酵母转化(陈晗俊)

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酵转原理：我们采用的是LiAc法化酵母。PEG一种高分子聚合物只分子量达到3000左的才发挥最大的转化促进作用。本文使用的分量为,实验结果表明促转化效果可以达到10～g。PEG在酵母转化中起到在高浓度醋酸锂环境中保护细胞减少醋酸锂对细胞膜结构的过渡损同时促进质粒与细胞膜接触更密PEG的浓度是务必适宜,一点很重要。LiAc可酵母细胞产生一种短暂的感受性状态此它们能够摄取外源性。鲑鱼精担体DNA为的线形单链在转化实验中主要是保护质粒免于被酶解;外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒中发挥助作用。在每次使用前务必进行热变性使可能结合的双打开保证鲑鱼精担体在转化实验体系中以单链形式存在材料、器设备及试：培基：：g/L硫酸铵：5g/L氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加调节，121灭菌15minYPDA培基胰蛋白胨酵母浸膏琼脂20g/L(固体腺嘌呤15ml0.2%腺嘌呤/L调节pH=7.5°灭菌0.9%NaCl（w/v）0.9gmilipore定容到灭菌°，从试剂瓶中分装到管，500ul每管，室温保存10×（（0.1M，EDTA）Tris-HCl1.211g/100mlEDTA0.37g/100ml调节pH=7.5,121，10LiAc）

1MLiAc10.202g/100ml用醋酸调节，°灭菌20min10.

1.1×TE/LiAcTris-HCl10LiAcpH=7.5）/100mlEDTA11ml×EDTA（）调节pH=7.5,121，50%PEG3350：：50g已灭菌的milipore水定到（可用°水浴助溶PEG易水，不可灭菌）PEG/LiAc现配现用，在超净台中操作，吸取母液到管50ml离管中终浓度10ml40%50%PEG3350buffer×1ml10×TELiAc1×1ml×变性的鲑鱼精11.milipore水酒精棉球离心管个ep管一盒15ml试架，试架，ep管架()具体方：A酵母感受制备从板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA板上划单克隆，°培养3天右。从板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3mlYPDA的玻璃试管中（平行做管）30，，培养取200ul菌，测选值最大的一个试活最高的一个转至新鲜的YPDA培养基中（培养基装在三瓶中）30，，培养，至OD600=0.15-0.3将养好的菌液转入50ml离心管，室温离心3000g，，弃上清，用新鲜的YPDA悬管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。30，培直到OD600=0.4-0.5（3-5小）将液倒入个50ml离管室温离心3000g，，弃上清，每个离心管用30mlmilipore重悬。10.再离，3min，弃上清，每管用1.4ml1.1×TE/LiAc重。11.将悬菌液转移到个管，，12.弃清每管用600ul1.1×TE/LiAc悬将管重悬菌液并入一管备进行转化。B酵母质粒化小规模转化大模转化

加入质粒鲑鱼精变的10mg/ml)

100-500ng5ul

加入感受态细胞轻混匀加入PEG/LiAc,轻混匀°水浴，每10-15min轻混匀加入DMSO,轻弹混匀°水浴，每弹混匀

600ul500ul2.5ml30min160ul15min

离心，弃上清

最大转速

用液体YPDA培基重悬°，，养

15s1ml3ml90min90min

离心，弃上清

最大转速

10.11.

用0.9%NaCl重涂板在相应的筛选培养基上。

15s1ml15ml()

注意事：

转化效率与很多因素有关母力是一个重要因素般制备酵母感受态的细胞必须是没有经过4保存的，活化过的，从培养箱中取出的新鲜酵母。在制备酵母感受态时超过上述的的OD值酵一直处在生长最旺盛的时期，特别是最后一次培养OD600的值不要超过酵母转化过程中，没有抗生素易菌，所有实验都在超净台中进行，超净台需提前一天用70%精棉擦拭，将第二天用到的物品（如，试剂试管，架子等）都放入超净台，灭菌过夜，每次进入超净台操作时，需用70%