《BD流式基础知识qj》课件

流式细胞术ForFCMTrainingBD:钱璟2011.9.28重庆《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第1页!流式细胞术？对于处在流动状态中的细胞或颗粒各项特性进行检测FlowCytometryinmotioncellmeasure♠特点：速度快(≥10000cells/s)特异性强，灵敏度高(MRD:1/10000)多参数分析、活细胞分选♠

研究对象:单细胞悬液可检测的样本种类多样：外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞、藻类等《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第2页!流式细胞术《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第3页!FL2PESSCFSC电子系统计算机系统FL3PerCP,Cy5

FL1FITCLightdetectors液流系统光学系统laser流式细胞仪工作流程《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第4页!液流系统流动室（Flowcell）LaserSample流体动力学聚焦鞘液：sheathSheathSample

StreamCell《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第5页!调节样本进样速度样本流与鞘液压力差改变，样本流直径改变，细胞间距改变10psi10psi10psi10psi10psi10.2psi10.4psi10.8psi压力差样本流进样速度分辨率HiLoMed《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第6页!流式细胞仪的构造1.细胞样本成单列依次通过光检测区2.激发并收集各种光信号液流系统光学系统《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第7页!激发光学系统:将激光引导到检测区域，产生光信号激光单波长高强度高稳定488nmblue633nmred405nmvioletLightSignals光学棱镜《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第8页!通过流式细胞仪我们可以得到---♠

相对细胞大小（前向角散射光-FSC）♠

相对细胞颗粒密度和内部复杂度（侧向角散射光-SSC）♠

染色过细胞的相对荧光强度（荧光-Fluoresentlight）《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第9页!前向角散射光（FSC）FSCisproportionaltorelativesize&cell-surfacearea《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第10页!侧向角散射光（SSC）SSCisproportionaltocellgranularityorinternalplexity.《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第11页!eg.MajorleucocytesubpopulationscanbedifferentiatedusingFSCandSSC.Figure:CellsubpopulationsbasedonFSCvsSSCDualParameterdot-plot《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第12页!荧光信号（Fluoresentlight）《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第13页!荧光强度（Fluoresenceintensity）♠荧光信号的强度代表被测细胞膜表面抗原强度或细胞内物质浓度。《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第14页!接收光学系统：接收光信号,并将光信号引导到对应的接收器中光学滤片460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50

LongpassShortpass Bandpass(500+/-25)《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第15页!光学探测器光电二极管---FSCPhotodiodes光电倍增管---SSC&Fluoresence

Photomultipliertubes(PMTs)光电转换器：

将光信号转换为电信号《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第16页!电子系统将光信号转化为电信号（模拟信号）将模拟信号转化为数字信号计算每个脉冲峰和计算机连接以传出数据将光信号成比例的转换成电信号，并进行数字化处理后传入计算机《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第17页!电压脉冲的产生—模拟信号LaserLaserLaserTimeVoltageTimeVoltageTimeVoltage1当微粒通过激光束时，脉冲开始。此时，激光强度和信号强度都很低。2当微粒达到激光束中间时，脉冲达到最大强度或者高度，此时激光束和信号强度都最高。此时测定峰值强度或者脉冲高度。3当微粒离开激光束时，脉冲减弱。《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第18页!模拟信号转换为数字信号《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第19页!数据的获取表现《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第20页!设门（Gating）平均荧光强度百分比《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第21页!分选系统检测加电偏转收集《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第22页!ReviewQuestions在仪器设置中调高Red参数的电压，左图中群体会发生什么变化？《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第23页!1.样本处理单细胞悬液细胞悬液：直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小灌洗液、体腔积液培养细胞、细胞系实体组织：病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本针吸组织：新鲜样本《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第24页!荧光信号（Fluoresentlight）《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第25页!ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmPhycoerytherin(PE)《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第26页!2.选择合适的荧光染料★必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发★激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内★根据抗原表达强弱选择荧光抗体★荧光素光谱的重叠应当尽量减少《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第27页!2.选择合适的荧光染料★必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发★激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内★根据抗原表达强弱选择荧光抗体★荧光素光谱的重叠应当尽量减少《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第28页!《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第29页!荧光补偿补偿前补偿后《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第30页!.bdbiosciences.《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第31页!4.数据收集和分析1)画图（直方图，散点图）2)调整仪器设置到合适的状态3)寻找目标细胞4)我们可以得到怎样的结果？它们意味着什么？《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第32页!同型对照（Isotypecontrol）例：一个双色染色的实验抗体AFITC，抗体BPE

对应的同型对照是IgG1FITC,IgG1PE那么需要准备的是阴性对照：细胞加上IgG1FITC,IgG1PE单阳性对照：

FITC:细胞加上AbAFITCPE:细胞加上AbBPE同型抗体为没有特异性，与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1或IgG2.同型对照就是使用同型抗体进行平行实验，反映待测样本对抗体非特异性结合水平。《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第33页!如何设定阴性与阳性的界限《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第34页!散点图《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第35页!FACSVerseAccuriC6LSRforttesa现代流式细胞仪(Flowcytometer)《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第36页!流式细胞仪的构造1.细胞样本成单列依次通过光检测区液流系统2.激发并收集各种光信号3.光信号转换成电信号，数字化处理4.数字信号传入计算机光学系统电子系统计算机系统分选系统5.活细胞分选《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第37页!样本流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法鞘液压力恒定，流速不变通过调节样本压力调节样本进样速率液流系统液流驱动系统《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第38页!LowpressureHighpressure细胞周期FL301024204830724096Count300280260240220200180160140120100806040200.G0/G1CV=2.42G2/MSphaseG0/G1FL301024204830724096Count340320300280260240220200180160140120100806040200GO/G1CV=7.79.GO/G1CV=7.79《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第39页!光学系统

激发光学系统:激发光源—激光透镜和反射镜—将激光引导到检测区域接收光学系统:滤光片等—将产生的光信号引导到对应的光学接收器《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第40页!流式细胞仪检测信号Injector

TipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheath

fluidLaserbeam

1.散射光信号

2.染色过细胞的荧光信号

前向角散射光(FSC)

侧向角散射光(SSC)360度立体角《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第41页!前向角散射光（FSC）Forward(AngleLight)Scatter♠FSC信号收集方向与激光束相平行♠

FSC与被测细胞或颗粒相对大小及表面积相关

FALSSensorLaser《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第42页!侧向角散射光（SSC）Side-scatteredlight

(90DegreeLightScatter)♠SSC信号收集方向与激光束相垂直（90°）♠

SSC与被测细胞或颗粒内部颗粒度和结构复杂度相关FALSSensor90LSSensorLaser《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第43页!散射光（FSC&SSC）

散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异

♠通常使用“散点图”来看散射光信号

♠散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第44页!流式细胞仪检测信号Injector

TipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheath

fluidLaserbeam

1.散射光信号

2.染色过细胞的荧光信号

自发荧光信号特异性荧光信号《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第45页!双色荧光散点图《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第46页!荧光信号（Fluoresentlight）荧光信号收集方向与激光束相垂直（90°）FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(FL1,FL2,FL3,FL4)接收光学系统《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第47页!FACSCalibur光路图每个探测器前往往为BP，所以每个探测器只能接收特定波长范围的光信号FL1:515nm-545nm《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第48页!流式细胞仪的构造3.光信号转换成电信号，数字化处理1.细胞样本成单列依次通过光检测区2.激发并收集各种光信号液流系统光学系统电子系统《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第49页!光信号转换为电信号LinearAmplificationLogAmplificationorVoltageTimeVoltagePMT电压电信号

《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第50页!计算一个电压脉冲峰Time

VoltsPulseAreaPulseHeightPulseWidth0面积是对荧光光通量进行积分测量的结果宽度=面积/高度，与颗粒通过激光照射区的时间成正比特定参数可选择面积、宽度信号（DNA含量分析）《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第51页!流式细胞仪的构造3.光信号转换成电信号，数字化处理4.数字信号传入计算机1.细胞样本成单列依次通过光检测区2.激发并收集各种光信号液流系统光学系统电子系统计算机系统《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第52页!专业软件中的数据表现单参数直方图双参数散点图三维点图等高图密度图《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第53页!流式细胞仪的构造1.细胞样本成单列依次通过光检测区2.激发并收集各种光信号3.光信号转换成电信号，数字化处理4.数字信号传入计算机液流系统光学系统电子系统计算机系统分选系统5.活细胞分选《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第54页!ReviewSorting《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第55页!如何进行流式细胞实验？1.样本处理2.荧光染料的选择3.染色4.数据收集和分析《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第56页!2.选择合适的荧光染料★必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发★

激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内★根据抗原表达强弱选择荧光抗体★荧光素光谱的重叠应当尽量减少《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第57页!Fluorescein(FITC)400nm500nm600nm700nmWavelengthExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm《BD流式基础知识qj》课件共68页，您现在浏览的是第58页!Allophycocyanin(APC)633nm红激光ExcitationEmisson300nm400nm500nm60