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文档简介

皮层神经元细胞原代培养

☞主要内容:

实验原理1

准备工作2

实验步骤3

影响因素4实验原理◆细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一。可分为原代培养和传代培养两种。◆原代培养：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

实验准备实验前准备工作培养板包被培养基，阿糖胞苷配制制备冰盒0.1%多聚赖氨酸包被

实验步骤要点细心

细节决定成败耐心胰酶消化法1准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒30分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手及台面。2布局：点燃酒精灯，安装吸管帽；准备离心管；

平皿及器械放置妥当。

实验步骤

实验步骤布局酒精PBS冰盒PBSPBS器械剥离血管及筋膜取脑，分离皮层神经元清洗血液断头剪碎组织块5剪碎：将大脑皮层转移到另一装有PBS的平皿中，用手术剪将其剪成小块（1mm3），用PBS液洗三次，转移至离心管中离心1000rpm5min。6消化：加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱消化20min,中间翻转振荡一次。使细胞分离。

实验步骤9细胞计数：4个大方格内细胞总数

──────────×10４×n(稀释倍数)

4

10种板：以5×105个/ml接种于用多聚左旋赖氨酸包被过的培养板内，培养板置细胞培养箱中37℃、5%CO2、饱和湿度下进行培养

实验步骤培养基材料剥膜包被消化低温操作

影响因素材料选择

影响因素胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆★易于操作★有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生影响因素培养基选择不建议血清培养1血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，影响神经元产量；2抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验；3血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。4neurobasal和neurbasal-A被认为是最标准，最好的培养基。需要的添加剂为B27和谷氨酰胺。影响因素培养板选择6孔板是最佳选择大于6孔板（比如6CMDISH）会使得中间很难和周围的细胞密度一样，造成板中间和边缘成熟度不一样，而这会给实验带来很大干扰。96孔或128孔：细胞会倾向于向中间集中也会照成发

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