无菌检查方法学验证实验08年11月课件

无菌检查法及《中国药典》2005年版无菌检查法中方法验证试验2005版《中国药典》张春华一·无菌检查法1.基本定义无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。2·需进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的范围各种注射剂眼用及外伤用制剂植入剂可吸收的止血剂外用敷料、器材4·仪器及设备无菌室内常备器具恒温培养箱、生化培养箱离心机，显微镜，高压蒸汽灭菌器，恒温烤箱，开放或全封闭过滤系统等玻璃器皿无菌衣，裤，帽，口罩除菌滤器及滤膜其他用具：手术剪、镊、接种环、酒精灯、微波炉、电子天平、洗耳球、纱布、牛皮纸、棉线绳等。洁净间的日常监测浮游菌沉降菌5·培养基、稀释液及冲洗液硫乙醇酸盐培养基属于流体培养基，即在液体培养基中加入0.05%～0.07%的琼脂，增加了培养基的粘度，降低培养基中的含氧量，使培养基在一段时间内保持厌氧的条件，有利于厌氧菌的生长。硫乙醇酸盐培养基有红色的氧化层，适合需气菌的生长，在供试品接种前，培养基的氧化层的颜色不得超过培养基深度的1／5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。营养琼脂培养基、玫瑰红钠培养基

是固体培养基，在液体培养基中添加1%～2%的琼脂作为凝固剂。45℃以上时为液态培养基，使用时需在水浴中保存。营养肉汤培养基、改良马丁培养基。表面活性剂，中和剂。稀释剂1.0.9%氯化钠溶液：常用的等渗溶液。2.pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液：调解pH至近中性，其中蛋白胨对菌细胞有保护作用，有利于菌数及控制菌测定。3.0.1%蛋白胨水溶液。培养基的灵敏度检查取每管装量不少于12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、生孢梭菌各2支。另1支不接种作为空白对照，培养3天；每管装量不少于9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。结果判断空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。

《中国药典》2005年无菌检查和微生物限度检查的验证试验中使用7株菌见表1：

表17株菌的培养条件

菌种接种培养基 培养温度℃ 培养时间金黄色葡萄球菌

30～3518～24h铜绿假单孢菌 营养肉汤或者普通 枯草芽孢杆菌 斜面

大肠埃希菌

生孢梭菌 硫乙醇酸盐培养基

白色念珠菌 改良马丁或者普通23～28 24～48h斜面

黑曲霉 改良马丁斜面

23～28 5～7d

金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌菌液的制备

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24小时，上述培养物采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。菌数测定采用营养琼脂培养基平皿法。

生孢梭菌菌液的制备

接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30～35℃培养18～24小时，采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。菌数测定用硫乙醇酸盐流体培养基试管法。白色念珠菌菌液的制备

接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基,23～28℃培养24～48小时，上述培养物采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu（一般稀释至10-6）的菌悬液。菌数测定用玫瑰红钠琼脂培养基平皿法。黑曲霉菌液的制备

接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上,23～28℃培养5～7天至大量孢子产生，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，采用细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。孢子数测定用玫瑰红钠培养基平皿法。菌种保藏方法斜面保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、冷冻保藏法冷冻、干燥保藏法。菌种衰退菌种的管理菌种资料：名称、编号、来源、传代次数、最适培养基、培养条件、保藏方法、保藏地址、使用记录。验证试验确认所采用的方法适合于供试品的无菌检查或微生物限度检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以已被充分消除到可以忽略不计。保证“微生物限度检查”或“无菌检查”方法的科学性和检验结果的准确性。污染的微生物，伤害并未死亡。验证试验是对微生物学检验的完善。洁净间（尘埃粒子数、浮游菌数、沉降菌数）的监测，灭菌效果的验证，培养基灵敏度检以及试验中阴性、阳性对照的设置，都是为了使微生物学检验的结果更加准确、有效。试验原理微生物恢复生长比较。设计试验方法：在检测前，产品的预处理方式能有效消除产品的抑菌性；预处理方式和检测过程及培养条件等均不会影响产品中微生物生长。2.直接接种法

取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8支，分别接入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌的菌悬液1ml(含菌小于100cfu)各两管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液1ml(含菌小于100cfu)各两管。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为阳性对照，按规定的温度培养3～5天。与阳性对照比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用，可按此法进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量；增加培养基的用量；使用中和剂如ß-内酰胺酶、对氨基苯甲酸、聚山梨脂80等；更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行验证试验。验证试验可与供试品的无菌检查同时进行。3.阳性对照

应根据供试品的特性选择相应的阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。3.2.阴性对照

每次无菌检查所用的溶剂、稀释剂和冲洗剂同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。(二)检查法

有直接接种法和薄膜过滤法。1.薄膜过滤法强调了要“优先采用封闭式薄膜过滤器，也可用一般薄膜过滤器。”无菌检查用的滤膜孔径为0.45µm与直径为50mm。

根据供试品及溶剂的特性选择滤膜的材质。如抑菌性供试品采用具有疏水性边缘及低吸附性的滤膜。滤器及滤膜采用适宜的方法灭菌；使用时，要保证滤膜的完整性；水溶性供试品，先用少量冲洗液湿润滤膜。油类供试品，滤膜和滤器，在使用前应充分干燥，备用。过滤时，保持供试液及冲洗液覆盖整个滤膜表面；冲洗滤膜时，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗液、冲洗量及冲洗方法与方法验证相同。1.1供试品的处理供试品分8类，增订5种：③④⑤⑥⑦。2.直接接种法

供试品的处理和接种2005版有9类供试品，其中增订3种-非澄清水溶液供试品；非水溶性供试品。β-内酰胺类供试品。直接接种法即每支（或瓶）供试品按规定量分别接入含培养细菌及真菌培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%(表2)，用量和培养基的高度同方法验证试验；每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。

3.培养及观察

修订：上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养2日、真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。4.结果判断

若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何1管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效即生长的微生物非供试品所含。增订：当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效：⑴无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。⑵回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。⑶阴性对照管有菌生长。⑷供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。5.重试的修订：试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。药品无菌检查法验证示例注射用头孢噻肟钠（2.0g）

表1菌落计数结果表平皿金黄色葡大肠杆菌枯草杆菌铜绿假单孢菌生孢黑曲霉白色念珠数萄球菌梭菌菌1

68

97

77

45＜100

78

85259

92

63

37＜100

80

72表2人工污染大肠埃希菌结果培养时间1d2d3d4d5d300ml/筒冲洗-----500ml/筒冲洗-----800ml/筒冲洗

-

+

+

+

+1000ml/筒冲洗阴性对照+-+-+-+-+-培养基为硫乙醇酸盐液体培养基观察不同冲洗量，对阳性代表菌抑菌的影响表3人工污染金黄色葡萄球菌结果培养时间1d2d3d4d5d800ml/筒冲洗+++++阴性对照-----培养基为硫乙醇酸盐液体培养基表4人工污染枯草杆菌结果培养时间1d2d3d4d5d800ml/筒冲洗+++++阴性对照-----培养基为硫乙醇酸盐液体培养基表5人工污染铜绿假单孢菌结果培养时间1d2d3d4d5d800ml/筒冲洗+++++阴性对照-----培养基为硫乙醇酸盐液体培养基表6人工污染生孢梭菌结果培养时间1d2d3d4d5d800ml/筒冲洗+++++阴性对照-----培养基为硫乙醇酸盐液体培养基表7人工污染白色念珠菌结果培养时间1d2d3d4d5d800ml/筒冲洗-++++阴性对照-----培养基为改良马丁培养基表8人工污染黑曲霉菌结果培养时间1d2d3d4d5d800ml/筒冲洗--+++阴性对照-----培养基为改良马丁培养基（1）表中（-）为阴性，（+）为阳性。（2）从表2-8可以看出800ml/筒冲洗，在每100ml培养基中加