培训：菌落总数的测定GB4789.2-2010-课件

食品卫生微生物学检验

菌落总数测定Gb4789.2-2010平板计数法一、定义1菌落（colony）：是指细菌在固体培养基上经培养后生长繁殖而形成的能被肉眼所识别的生长物集落，它是由数以万计的相同细菌集聚而成的。2菌落总数：是指食品检样经过处理，在一定条件下(如培养基、培养温度和时间)培养后，所得1g或1mL检样中形成的微生物菌落总数。以CFU/g（mL）来表示。

C菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以有时被称为杂菌数、需氧菌数等。

3、区分定义：细菌总数指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1g或1mL样品中的细菌总数来表示。

4菌落总数测定的卫生学意义

食品本身的新鲜程度加工储存运输过程中是否受到污染—卫生质量卫生学指标：必须配合大肠菌群的检验和其他病原菌项目的检验，才能做出比较全面准确的评定。---菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。--食品中细菌菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全面的评价。

二、试验材料1、

食品检样

2、

培养基和试剂

2.1平板计数琼脂培养基；2.2无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液

3、

设备和器具

无菌培养皿、无菌吸管/移液枪及无菌枪头、电磁炉、均质器、电子天平、恒温培养箱、生物安全柜、冰箱、蒸汽灭菌器等。

菌落总数的检验程序图检样：25g（ml）样品加入225ml稀释液，均质10倍系列稀释选择2~3个适宜样品匀液，各取1mL分别加入无菌培养平皿内每皿内加入适量（15-20ml）培养基(PCA)，混匀，培养菌落计数36±１℃48±2h报告1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。常见做法：以无菌操作取检样25g（mL），放于225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或均质袋内，经充分振荡或拍击制成1:10的均匀稀释液。1.5、根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度（液体样品可包括原液），分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。同时分别取1ml空白稀释液（不含样品），加入两个灭菌平皿内作空白对照。1.6、稀释液移入平皿后，及时将冷却至46℃平板计数琼脂培养基注入平皿约15～20ml，并转动平皿，使其混合均匀。（二）培养1.1琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h。1.2如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4毫升），凝固后培养。（三）

菌落记数

菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，cfu）表示。做平板菌落数记录时，可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器检查，以防遗漏。记录稀释倍数和相应的菌落数量。到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0～4℃，但不要超过24h。

计数规则1

选取菌落数在30cfu～300cfu之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30cfu的平板记录具体菌落数；大于300cfu的可记录为多不可计；每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。计数规则3：当平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计。注意：如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。四、结果与报告1、菌落总数的计算方法：1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。菌落总数计算公式的改变统计学依据：平板菌落数越多，结果越具有代表性；（不考虑稀释倍数和培养基的营养状况等）取样量越大，结果越具有代表性；（同等取样条件、排除其他方面的干扰因素）计算范例1稀释度1:100（第一稀释度）1:1000（第二稀释度）菌落数232，24433，351.3、

若所有稀释度的平板菌落数均>300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可以记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。即：所有平板菌落数均>300，则计最高稀释度平板的菌落数1.4、若所有稀释度平板菌落数均<30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。即：所有平板菌落数均<30，则计最低稀释度平板的菌落数1.5、若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以<1乘以最低稀释倍数计算。

即：样品原液和所有稀释度平板均无菌生长，以<1乘以最低稀释倍数计算1.

6、若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300CFU之间（其中一部分>300或<30）时，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。即：所有稀释度平板菌落数均不在均不在30～300之间有些>300，有些<30，则以最接近30～300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

4、若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

5、称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL

为单位报告。

记录方式样品稀释液及菌落数选择稀释度报告(CFU/g,ml)10-210-310-4样品名称原始数据计算公式报告平均报告方式编号菌落总数报告方式单位195.596CFU/g,或CFU/ml（CFU大写）216801700或1.7*1033均为蔓延菌落无法计数报告“蔓延菌落”4空白对照有菌结果无效六、注意事项

1、无菌操作

操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。

2、采样的代表性如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。

3、稀释液样品稀释液主要是灭菌生理盐水，或磷酸盐缓冲液，后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。

4检样稀释：4.1检样稀释时，应以无菌操作称取或量取有代表性在样品25g（25mL）置225mL灭菌稀释液中。固体样品应剪碎，以拍打式样品处理器做成样品悬液（1：10）。4.2根据食品卫生标准和对样品污染情况的估计，再进行10倍递增稀释。注意每递增稀释一次，必须另换1支吸管，以保证样品稀释倍数的准确性。4.3从吸管筒内取出灭菌吸管时，注意不要将管尖碰到手或其他沾污物可能触及的部位。（如玻璃瓶口、试管品、仍留在容器内的吸管的外露部分）。4.4进行稀释时应注意取样的准确性。（如：吸入液体时应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将液体放至所需刻度。放液体时，不要让吸管接触稀释液的液面，可沿管壁放入，避免吸管外粘附的食品残渣进入稀释液体中）。5培养基倾注的温度与厚度培养基倾注的温度与厚度是实验正确与否的关键。a倾注的温度：46℃±1℃左右（水浴内保温），温度过高会造成已受损伤的菌细胞死亡，影响细菌生长，过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。b倾注的厚度：直径9cm的平皿一般要求15~20mL培养基，一般以15ml较为适宜。平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。若培养基太薄，在培养过程中还可能因水分蒸发而影响细菌的生长。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。6、为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。7、培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。8、为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。9、培养条件一般样品36℃±1℃/48h±2h。水产品（指原生态、未加工水产品）30℃±1℃/72h±3h10、必须做空白对照：检测培养基、平皿、稀释液的无菌程度。同时应在工作台内打开一块空白PCA（其暴露时间应于检样时间相当），以了解样品在检验过程中有无收到来自环境的污染。11、如样品（干调、面粉、脱水蔬菜）中可能含有在琼脂表面蔓延生长的菌落，可在凝固后的琼脂表面