连接酶及其他二

关于连接酶及其他二第1页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六2.修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷酸二酯键一、DNA连接酶的基本性质44第2页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六一、DNA连接酶的基本性质3.连接多个平头双链DNA分子：第3页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六注意：（1）DNA连接酶只能连接相邻核苷酸之间的切口（nick）；（2）如果是缺少一个或几个核苷酸的裂口（gap），DNA连接酶是无法连接的；46第4页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六（3）DNA连接酶不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分；（4）DNA连接酶催化的连接反应是需要能量的：在大肠杆菌或其他细菌中，利用NAD+

（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），在动物细胞中及噬菌体中，利用ATP（腺苷三磷酸）。注意：47第5页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶

T4噬菌体RNA连接酶二、DNA连接酶的种类第6页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

T4噬菌体DNA连接酶

该酶最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，是T4噬菌体基因30编码的产物，分子量为68ku，需要ATP作为辅助因子。两个带有互补粘性末端的双链DNA分子一条带有切口的双链DNA分子两个带有平头末端的双链DNA分子DNA-RNA杂合体分子中切口该酶可连接49第7页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六第8页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

大肠杆菌DNA连接酶

该酶是从正常的大肠杆菌中提取的，由大肠杆菌基因组中lig基因编码，分子量为75ku，需要NAD+作为辅助因子。

具有同源互补粘性末端的不同DNA分子一条带有切口的双链DNA分子该酶可连接但,该酶几乎不能催化两个平头末端DNA分子的连接第9页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六T4噬菌体DNA连接酶该酶在DNA体外重组中比大肠杆菌DNA连接酶应用广泛(既能连接粘性末端,也能连接平头末端).两种酶各自的优点大肠杆菌DNA连接酶:

该酶的连接产物转化细菌后,假阳性背景低(由于它对DNA末端的要求比较严格-----互补粘性末端).52第10页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

T4噬菌体RNA连接酶T4噬菌体RNA连接酶由T4噬菌体基因63编码,需要ATP作为辅助因子.

连接反应:

主要用途:

对RNA进行3´末端标记,即将32P标记的3´,5´-二磷酸单核苷加到RNA的3´端.

该酶可催化单链DNA或RNA的5´磷酸与相邻的3´羟基、单核苷酸共价连接.53第11页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六第三节DNA聚合酶一、DNA聚合酶的分类根据DNA聚合酶所使用模板的不同,可分为:依赖于DNA的DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow大片段酶T4噬菌体DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶TaqDNA聚合酶逆转录酶55第12页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1.DNA聚合酶的分类

目前,从大肠杆菌中已分离出3种DNA聚合酶,分别为:DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ:与DNA复制有关主要参与DNA的修复分子克隆中常用DNA聚合酶Ⅰ第13页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是Kronberg等1956年发现的第一个DNA聚合酶,故也称为Kronberg酶.①

5´3´DNA聚合酶活性

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(DNApolⅠ)发挥聚合酶活性需要:DNA模板、引物、dNTP和Mg2+。57第14页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质②

3´5´核酸外切酶活性

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

该活性识别单链，能将复制过程中3´端的错配碱基切除，从而保证DNA复制的高保真度，也称为校对功能。DNApolⅠ5´3´5´58第15页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六③

5´3´核酸外切酶活性

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质5'3'5'3'5'5'3'3'5'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'

-P5'3'5'3'5'3'5'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'

-P第16页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六5´3´外切核酸酶活性的水解作用有3个特征：待切除的核酸分子必须具有5´端磷酸基团。核苷酸分子被切除前位于已配对的DNA双螺旋区段上。

被切除的核苷酸既可以是DNA也可以是RNA.③

5´3´核酸外切酶活性2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质第17页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的用途

合成ds-cDNA第二链（Doublestranded)

杂交探针的制备

DNA序列分析在DNA聚合反应体系中，如果加入放射性核素标记的核苷酸，则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子，这就是所谓的DNA分子杂交探针(书P36）。第18页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六杂交探针的制备过程:3´5´5´3´3´5´5´3´3´5´5´3´3´************5´5´3´*****DNAaseⅠE.ColiDNApolⅠ*dNTP图切口平移反应原理62第19页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

Klenow

片段1.Klenow

片段的由来E.coliDNApolⅠ蛋白酶较小片段较大片段(Klenow片段)5´3´3´5´聚外合切酶酶活活性性性质5´3´外切酶活性第20页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六Klenow

片段的由来通常所用的Klenow片段是由枯草杆菌蛋白酶切割完整的DNA聚合酶片段而成,或是经过克隆产生的一条多肽链。

Klenow

片段第21页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

Klenow

片段2.Klenow

片段的用途

填补由DNA限制酶反应产生的凹陷3´末端。用[32P]dNTP填补凹陷的3´末端，即DNA分子的末端标记（书P32）。在cDNA克隆出来后，合成cDNA第二条链。用Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA序列分析等。65第22页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

T4DNA聚合酶1.T4DNA聚合酶的性质T4DNA聚合酶的外切酶活性比Klenow片段高100~1000倍与Klenow片段不同具有5´3´聚合酶活性具有3´5´外切酶活性与Klenow片段相同不具有5´3´外切酶活性66第23页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

T4DNA聚合酶2.T4DNA聚合酶的用途

填补或标记由限制酶切割DNA后产生的凹陷3´末端，标记反应时需要高浓度的dNTP，以保证聚合反应（填补）大于3´5´核酸外切酶活性。进行3´突出末端的DNA末端标记。67第24页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

T4DNA聚合酶2.T4DNA聚合酶的用途

标记用作杂交探针的DNA片段。

由3´5´核酸外切酶活性部分酶切双链DNA，得到凹缺3´末端用[32P]dNTP填补（取代合成）。

将双链DNA的末端转化成平头末端。

利用T4DNA聚合酶的3´5´核酸外切酶活性从双链DNA上切除突出3´末端，在高浓度dNTP中模板上双链区的降解与合成达到平衡。68第25页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

TaqDNA聚合酶1.来源

TaqDNA聚合酶最初是从耐热细菌Thermusaqraticus中纯化而得，因此是一种单亚基耐热的依赖DNA的DNA聚合酶，现已广泛用于基因工程的操作中。69第26页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

TaqDNA聚合酶702.性质具有5´3´聚合酶活性最适反应温度为75℃~80℃（据目的序列不同而不同）

TaqDNA聚合酶在60℃时其聚合酶活性下降2倍，在37℃时下降10倍。第27页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

TaqDNA聚合酶3.用途

TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应（PCR），在体外扩增特定的DNA片段，DNA或单链cDNA都可作为起始模板。但在使用中应注意：①TaqDNA聚合酶需要Mg2+。②磷酸缓冲液抑制该酶活性，应避免使用。71第28页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

逆转录酶一、一般知识

依赖于RNA的DNA聚合酶或RNA指导的DNA聚合酶。分子量约为16万，由分子量分别为6.2万和9.5万的两个结构相关的亚单位组成。72第29页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

逆转录酶二、来源

逆转录酶最主要的来源是鸟类成髓细胞性白血病病毒（AMV）。三、特性AMV逆转录酶的活性首先表现为DNA聚合酶的活性.

模板既可以是DNA,也可以是RNA.在以RNA为模板是称为RNA指导的DNA聚合酶活性,而以DNA为模板是则叫做DNA为指导的DNA聚合酶.73第30页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

逆转录酶三、特性AMV逆转录酶的活性其次表现为RNaseH活性。此酶可以特异性降解RNA-DNA杂种双链中的RNA部分。另外，还具有DNA内切酶活性和核酸结合活性。74第31页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六

逆转录酶四、用途

逆转录酶在基因工程中可用于cDNA的合成。即可将任何真核基因的mRNA经反转录形成cDNA拷贝,然后构建克隆,大量扩增,并表达这种基因,从而为真核基因的研究与其核遗传工程提供了一项必不可少的手段。75第32页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六一、性质

末端转移酶催化脱氧核苷酸添加到DNA分子的3´-OH末端。这很像DNA聚合酶通过5´3´聚合5´-脱氧核苷三磷酸合成一条DNA链。所不同的是末端转移酶不需要模板。第四节末端转移酶76第33页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六二、用途主要用途是给载体和外源DNA分别加上互补的同聚物尾巴，以便二者在体外连接。进行DNA3´-OH末端标记。标记物可以是放射性的，如α-32P-dNTP,也可以是非放射性的,如生物素-11-dUTP（生物素和亲和素）,它们可用于DNA序列分析、DNaseⅠ足迹分析、分子杂交等实验中。77第34页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六二、用途

进行同聚物接尾

用末端转移酶给一群DNA分子3´-OH末端接上oligo（dA）或（dG）,给另一群DNA分子3´-OH末端接上oligo（dT）或（dC）,混合这两群分子,就能使末端转移酶接上的同聚物尾部退火形成环状分子。这种方法称为同聚物接尾法。78第35页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六第五节核酸酶

核酸酶是一类能降解核酸的水解酶，它在基因工程操作中应用非常广泛。根据核酸酶对底物作用的专一性，可将其分为三类：

核糖核酸酶（RNase）：只作用于RNA。

脱氧核糖核酸酶（DNase）：只作用于DNA。

核酸酶（nuclease）：既作用于DNA，又作用于RNA。79第36页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六一、核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ

）

exoⅦ是一种的单链核酸外切酶，它能够从5´末端或3´末端降解DNA分子，产生出寡核苷酸短片段，且不需要Mg2+的参与。第37页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六二、核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ

）

该酶可以从双链DNA的3´-OH末端起逐一切去5´单核酸,其作用底物为含切口或缺口的线性双链DNA和开环DNA。作用后在双链DNA上形成一条长的单链区,这种外切酶不能降解单链DNA和带突出3´末端的双链DNA。81第38页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六二、核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ

）第39页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六三、核酸酶S1

1.基本知识核酸酶S1是从米粉状曲菌（Aspergillusoryzae）提取带的一种金属蛋白，分子量32000（32ku），相对耐热，催化反应通常需要Zn2+和酸性条件，产生带5´磷酸的寡核苷酸。83第40页，共47页，2022年，5月20日，10点26分，星期六2.特性

降解单链DNA或RNA,包括双链分子中的单链区域(如发夹结构),这种单链区域甚至可以小到1个碱基对的程度。降解单链DNA的速度比RNA的速度快10倍。降解发应的方式为内切和外切。降解发应