植物转基因的花序浸润法

植物转基因的花序浸润法自从1984年首次获得转基因烟草以来，植物基因工程取得了长足的发展，转基因技术得到了日益广泛的应用，转基因作物在生产上大面积推广应用。但是，在大多数植物中还存在转化率低、转基因植株再生和鉴定难、操作周期长等问题，获得大量转基因植株仍然比较困难。目前，植物遗传转化最常用的农杆菌介导法和基因枪法，存在着依赖于组织培养，操作复杂，过多的处理常引起受体组织的突变，以及转化植株中常出现基因沉默等不足。而非组培植物基因转化方法中，农杆菌真空渗透法虽然无须经过植物组织培养或再生，但是真空渗透过程很费力。为此，在真空渗透法的基础上又发展了花序浸润法(flora／dip)。花序浸润法转化首先在拟南芥中获得成功，随后对萝卜、甘蓝型油菜的转化也获得了成功。花序浸润法转化不需要进行真空处理．只需将发育的花组织简单地浸泡在农杆菌液中，大大简化了转化程序，对其他物种的遗传转化也有很好的借鉴价值。结合笔者的实践体会，本文以拟南芥为例介绍花序浸润法转化的操作要点及其注意事项。花序浸润法转化的操作要点1．1植株的培养拟南芥植株在植物生长室或人工气候箱中生长至开花阶段，培养条件为16h光照/8h黑暗，在室外光照水平低于 14000LX时白天辅以18h高压钠光，湿度为80％。在盛有潮湿的培养土的25cm3容器中种植1〜2株，或64cm3容器中种植6〜20株。为了防止容器中的土在浸润时洒落进接种介质，土隆起至略微高出容器中的边沿，播种后用尼龙窗纱或纱布织品覆盖在土上并用橡皮带固定。为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花薹形成后剪去第一个花薹，解除顶端优势，促使多个次生花薹的同步出现。当大多数花序约1〜10cm高（剪主薹后4〜8d）时开始浸润。1．2农杆菌的培养取出保种的农杆菌菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接入10mL无菌LB液体培养基中（一般含75mg/L利福平、100mg/L链霉素和100mg/L卡那霉素），28C恒温下250r/min振摇过夜培养。再将所得到的菌液按1%〜2%接入200mL同样含上述抗生素LB液体培养基中，28C恒温振摇使农杆菌的浓度达到 OD600=18,然后在4C下3000r/rain离心15min,弃去上清液后用浸润培养基（1/2XMS大量+1xMS微量+1xMS铁盐+1xMS肌醇+1xMS维生素+0.5g/LMES+%蔗糖，pH值为5.7,高压灭菌）重新悬浮农杆菌，悬浮至0D600约0.80,且在浸润培养基中加入蔗糖和表面活性剂SilwetL-77,使之含有5．0%的蔗糖和0．05%（500卩L/L）的SilwetL-77 。1．3花序的浸润种菌加入大口容器中，每2〜3个口径9cm的容器用400〜500mL用于浸染。将植株倒转，使地上组织全部浸没在农杆菌悬浮液中2〜3s，并要轻轻搅动。浸润后植株上应该有一层液体膜。浸润过的植株放在塑料盘中，用干净的塑料或保鲜膜覆盖以保湿，然后放置在弱光或暗处过夜，第二天放回温室，注意小心防止阳光直射植株。处理后约24h去掉覆盖。正常地浇水和培养植株，植株进一步生长3〜5周，直至角果变褐变干。收获种子，并将种子用离心管在4C下干燥贮存。1．4转化株的抗生素标记选择种子采用液体消毒，首先用95%的乙醇处理30〜60s,接着用含0.05%吐温(Tween20)的50%漂白剂(2.62%次氯酸钠，最后体积)处理5min，然后用无菌水漂洗4〜5次。为了选择转化植株，消过毒的种子悬浮在0．1%无菌琼脂糖中，并以每个150mrhC15mm卡那霉素盘中覆3000粒(40mg)种子的方式播种，4C下冷处理2d,接着在24C(2和2800〜5600Lx光照23h生长7〜IOd。选择盘含有1/2xMS0.8%琼脂粉和50g/mL卡那霉素。生长的第一周培养皿和盖子用封口膜密封,生长过程中过多的水分通过简单地开盖从盖子上抖落除去。在选择培养基上长出绿叶和完好的根系的抗卡那霉素苗即可确定为转化株。在有3〜5片成熟叶片后,转化株移植至湿润的容器土中生长至成熟,得到的抗性植株即可用于进一步的分子检测和性状鉴定。花序浸润法转化应注意的问题2.1生长状态植物的生长状态是影响转化成败的一个重要因素，健康的生殖能力旺盛的植物有利于提高转化效率。因为如果植株过于老熟，细胞对农杆菌的敏感性降低，而过于嫩弱的植株则容易受到伤害而难以收到一定数量的种子，转化效果都不好。2．2修剪修剪第一个花薹促发许多次级花薹的增殖，而修剪可以反复进行，以推迟植株的处理时间。最佳的植株应有许多花序和许多未成熟的已受精角果。转化之前要将已经授粉的花和果荚除去，因为它们不可能被转化。所结的种子中不可能有转化子存在，除去可以免去不必要的筛选工作。2．3浸润处理农杆菌的重复使用可以获得较高的转化效率，植株可以浸润2次或3次。拟南芥修剪后2d浸润1次，1周后浸润第二次。两次浸润以间隔7d为宜，不要少于6d的间隔。但不同的作物在不同的生长环境条件下生长发育快慢不同，间隔处理的时间也应作相应改变。2．4蔗糖和表面活性剂蔗糖和表面活性剂是花序浸润法成功的关键，而 MS盐和激素等没有影响，细菌的0D也不会有很大影响。仅在浸染前加SilwetL-77至0.05%(500卩L/L)并混合好。如果有SilwetL-77的毒性问题，采用0．02％或低至0．005％。2.5湿度接种后覆盖植物保湿也能提高转化效率。将浸润过的植株置于一个穹顶状物或覆盖下约24h以维持高湿度.但不要暴露于过强的阳光下，因为穹顶状物下的空气可能变热。展望近年来有关花序浸润法转基因的报道逐渐增多，对于功能基因组的研究和分子育种，由于不需要植物组织培养、苄基腺嘌呤激素和pH值调节等，因此花序浸润法具有简单、快速、高效和实用等特点。随着该方法的进一步完善，它在植物