中国农业大学本科生“URP”计划立项申请书

中国农业大学本科生“URP”计划立项申请书项目名称类病毒接种番茄与致病性检测张文娜工作单位园艺学院联系电话电子信箱填表日期2019年11月27日中国农业大学教务处制项目起止时间2020.1-2020.12项目申请人情况姓名张文娜性别女出生日期1984.4最后学历与学位博士专业技术职务副教授从事专业蔬菜学项目名称类病毒接种番茄及致病性检测一、项目概况类病毒(viroid)是已知最小的可以在寄主体内自我复制的病原，其分子是裸露的RNA,没有蛋白质外壳包裹，能在细胞内复制和累积。其传播途径广泛，包括汁液传播、媒介昆虫传毒、实生种子带毒等⑴。番茄类病毒病是番茄生产中的一个重要病害，在我国番茄生产区时有发生，该病会导致番茄植物矮化，影响果实产量和品质，目前仍缺少有力的防控措施⑵。研究发现，类病毒首先释放到细胞质中，通过胞间连丝进入相邻的细胞，然后再进入筛管系统进行长距离运输，最后进入其他非接种叶片，完成系统侵染。类病毒的致病能力和序列位点相关，某些特殊的基序可识别关键的寄主因子，从而导致寄主植物感病⑶。不同类病对寄主因子的识别能力存在差异，导致其在寄主体内复制和韧皮部长距离运输能力的不同，进而引起致病性的差异⑷。因此，本试验通过类病毒接种番茄，比对不同类病毒对不同品种番茄的致病性，为抗类病毒病番茄品种选育提供理论依据，也为类病毒的毒源保存提供新的途径，对番茄高效安全生产具有重要意义。在此科研训练过程中，锻炼学生的实验操作与实验设计能力，加强分子生物学和实践能力。参考文献HammondRWandOwensRA.2006.Viroids:Newandcontinuingrisksforhorticulturalandagriculturalcrops.APSnetfeatures,doi:10.1094/APSnetFeature-2006-1106OwensRAandHammondRW.2009.Viroidpathogenicity:Oneprocess,manyfaces.Viruses,1,298-316.FloresR,OwensR,TaylorJ.genesisbysubviralagents:viroidsandhepatitisdeltavirus.CurrentOpinioninVirology.17:87-94.ZhuY,QiY,XunY,OwensRandDingB.2002.MovementofPotatospindletuberviroidrevealsregulatoryPointsofphloem-mediatedRNAtraffic.PlantPhysiology,130(1),138-146.二、实施计划及方案（明确各个环节对培养学生创新能力的具体思路及考核办法）.文献查找与阅读（2020.1-2020.2）项目参加者阅读研究领域近年来发表的文章，学会使用文献检索网站查找文献，并学习撰写试验方案。该环节让学生初步接触专业文献，学习查找以及阅读文献，提高学生搜集信息的能力和对研究方向的兴趣。.试验方案（1）番茄播种和育苗（2020.3-2020.4）取一定数量的番茄种子（品种：Moneymaker、Rutgers）于55度水浴锅中浸种30分钟,然后置于室温浸种3小时，再将种子置于湿润的滤纸上避光催芽，待种子发芽后播种于穴盘中。覆盖保鲜膜，待种子发芽出土后，揭开保鲜膜，并在26度（白天16小时）/18度（黑暗8小时）条件的培养箱中培养2周，待植株长到两叶一心。（2）类病毒的接种和表型的观察（2020.5-2020.7）方法一：a.剪取小块含类病毒的叶片（约1g）放在研钵中，加入适量磷酸缓冲液（PBS）,研磨成糊状。b.在番茄植株底部叶面上均匀撒少许金刚砂，用棉棒蘸取研磨后的汁液在植株叶片上朝一个方向轻轻涂抹2〜3次，每株接种2〜3个叶片，然后用喷壶清洗干净接种的叶片，并在盆中插入标牌，标注接种类病毒的名称，接种时间和接种人等信息。接种后放于26度（白天16小时）/18度（黑暗8小时）条件的培养箱中培养。c.每2〜3天观察一次植株发病情况，并照相记录，注意接种叶片和新叶上的症状是否一样。观测时间持续2周。方法二：a.将类病毒从二倍化的侵染性克隆上酶切和体外转录，用Nanodrop测定体外转录物的浓度，并跑胶检测。b.用体外转录物配置侵染液，在番茄待接种叶片表面均匀撒少许金刚砂，然后用棉棒蘸取接种液，在番茄下部叶片上朝一个方向轻轻涂抹2〜3次，每株接种2〜3个叶片，用喷壶清洗干净接种的叶片，并在盆中插入标牌，标注接种类病毒的名称，接种时间和接种人等信息。接种后放于26度（白天16小时）"8度（黑暗8小时）条件的培养箱中培养。c.每2〜3天观察一次植株发病情况，并照相记录，注意接种叶片和新叶上的症状是否一样。观测时间持续2周。方法三：a.取一定量含类病毒过表达载体的农杆菌在28度摇床中摇菌，待菌液浑浊且OD值约为1.0时进行集菌，然后用注射培养基（IM）重悬农杆菌菌体，混匀后放于黑暗处2小时。b.用一次性小注射器吸取农杆菌菌液，从番茄下部叶片的背面叶脉之间的部分缓慢注射,菌液要浸没番茄叶片，注射完成后用喷壶喷湿注射叶片，标注注射的农杆菌名称，注射时间和注射人等信息，并将番茄放于遮光处培养2天。2天后放于26度(白天16小时)/18度(黑暗8小时)条件的培养箱中培养。c.每2〜3天观察一次植株发病情况，并照相记录，注意注射叶片和新叶上的症状是否一样。观测时间持续2周。(3)总RNA的提取、反转录和RT-PCR检测(2020.8-2020.10)接种或注射2周后用RNA提取试剂盒提取番茄上部叶片的总RNA,以提取的RNA为模板，使用反转录试剂盒进行反转录。以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系为20ML,扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。(4)数据整理及统计，报告撰写(2020.11-2020.12)小组成员每个试验阶段给指导老师上交试验工作汇报和试验心得，指导老师定期组织学生进行进展汇报，并与学生交谈，解答疑问。此环节将培养项目参加者进行试验汇报、交流、独立思考和动手操作的能力。考核办法：通过对各小组成员的试验思路、分析解决问题的能力以及PPT汇报的情况对学生进行考核评分。.结题验收试验结束后，学生整理试验结果和数据，按规定时间独立完成科研论文或书面总结，及相应的研究成果；同时总结实验过程中的经验教训，并提出合理的改进意见。该环节主要培养学生实验分析、归纳总结等方面的能力。考核办法：指导老师根据学生上交的书面材料考核评分。三、实施基础和条件.研究基础：申请人课题组前期进行过类病毒接种的试验，并筛选出了不同致病能力的类病毒，建立了成熟的类病毒接种技术、表型观测体系和类病毒检测技术等，整体思路和方法可行，具有指导研究生和本科生科研训练的经验，能够保证本实验的顺利进行。.试验条件：申请人所在实验室具有完备的硬件及软件设施，具备本研究所需的材料和仪器设备，可以完全支持本研究涉及的所有试验。另外，申请人所在实验室有正常运转的日光温室和人工气候室，可以为本研究所用植物材料的生长提供面积充足且条件良好的场所。四、学生提交的成果1、提交相关研究报告1份；2、提交试验过程与结果的相关图片及数据分析资料1份;3、提交PPT汇报材料，并完成验收