大学课程生物化学实验SOD3课件

实验七

透析法脱盐葡聚糖凝胶层析

一、实验目的掌握透析方法进行蛋白质脱盐。学习凝胶层析的工作原理和操作方法。

实验七透析法脱盐掌握透析方法进行蛋白质脱盐。二、实验原理用硫酸铵沉淀蛋白质，如果不除去无机盐，就无法用电泳法，离子交换层析法作进一步分离提纯，也影响酶活力的测定，因此，必须除去无机盐。用透析法、超滤法和分子筛层析的方法可以从蛋白质制剂中除去无机盐。

透析是利用蛋白质大分子不能通过半透膜而小分子杂质能通过半透膜的性质，使蛋白质和小分子杂质分开的方法。常用的半透膜是玻璃纸、火棉胶薄膜等。将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，然后将透析袋放在蒸馏水或低离子强度的缓冲液中，则小分子杂质通过半透膜而被除去，大分子蛋白质则仍留在袋中。二、实验原理用硫酸铵沉淀蛋白质，如果不除去无机盐，为了缩短透析时间，可以经常换水或流水透析。用4%BaCl2溶液检查透析袋外的溶液是否含有硫酸根离子，当液体中无BaSO4白色浑浊出现时，即表明硫酸铵已被除尽，可以结束透析。（NH4）2SO4+BaCl2

BaSO4↓+2NH4Cl为了缩短透析时间，可以经常换水或流水透析。用4%BaCl2溶半透膜袋蛋白质溶液透析液磁棒磁力搅拌器半透膜袋蛋白质溶液透析液磁棒磁力搅拌器透析袋酶溶液蒸馏水加压酶溶液超滤膜支持栅板超滤液图3-1透析装置图3-2超滤装置透析袋酶溶液蒸馏水加压酶溶液超滤膜支持栅板超滤液图3-1

电泳

前处理粗分离细分离生物组织

无细胞提取液破碎、溶解、差速离心选择性沉淀法亲和层析离子交换层析精制后的蛋白质凝胶过滤疏水层析吸附层析一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率柱层析及电泳方法。另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。电泳凝胶作为支持剂凝胶颗粒内部具有多孔网状结构。被分离的混合物流过层析柱时:凝胶过滤柱层析

（分子筛层析）大分子先下来小分子后下来凝胶作为支持剂凝胶过滤柱层析

分子筛层析原理示意图分子筛层析原理示意图分子筛层析与洗脱曲线

凝胶颗粒收集蛋白质管蛋白质混合物大分子从柱上面加缓冲溶液小分子洗脱体积（Ve）凝胶柱大分子小分子Ve1Ve2V0分子筛层析与洗脱曲线

凝胶颗粒收集蛋白质管蛋白质混合物大分子蛋白质Mr=49,000洗出液中的蛋白质浓度洗脱体积（mL）未知logMr洗脱体积与相对分子质量的关系

Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“选择性曲线”

G-200G-100logMrKav蛋白质Mr=49,000洗出液中的蛋白质浓度洗脱体积（mL）凝胶的种类和性质

交联葡聚糖凝胶（Sephadex)SephadexG系列

G后的数字为凝胶吸水值的10倍。

G反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。琼脂糖凝胶（Sepharose；Bio-Gel)

依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。聚丙烯酰胺一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品名为生物胶—P（Bio-GelP)。聚丙乙烯凝胶（Styrogel)大网孔结构。凝胶的种类和性质表葡聚糖凝胶(Sephadex)的物理特性品名干胶颗粒直径/μm得水值Wf/g.g-1床体积/mL.g-1最适分段分离范围溶胀所需时间/h最大流体静力压/Pa(cmH2O)球蛋白分子质量／Da线性葡聚糖分子质量/Da20℃lOO℃SephadexG-1O40-1201.0±0.12-370070031>9810(100)SephadexG-1540-1201.5±0.22.5-3.51500150031>9810(100)SephadexG-25粗中粗细超细100-30050-15020-8010-402.5±0.24-61000-5000100-500062>9810(100)SephadexG-50粗中粗细超细100-30050-15020-8010-405.0±0.39-111500-30000500-1000062>9810(100)SephadexG-75中粗超细40-12010-407.5±0.512-153000-700001000-500002434905(50)SephdexG-100中粗超细40-12010-4010±l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)SephadexG-150中粗超细40-12010-4015±1.520-305000-4000001000-1500007251472(15)SephadexG-200中粗超细40-12010-4020±2.030-405000-8000001000-200000725981(10)表葡聚糖凝胶(Sephadex)的物理特性品名干柱层析实验装置UVmonitorRecorderFractionCollectorColumnBufferReservoir柱层析实验装置柱层析实验装置UVmonitorRecorderFract自动部份收集器自动部份收集器FPLCFPLC三、

实验仪器与试剂

仪器：50mL；烧杯：500mL；透析袋；透析夹；移液管：2mL；吸耳球；试管。

试剂：20mmol/LpH7.8磷酸盐缓冲液

。三、实验仪器与试剂四、操作方法

1透析除盐将沉淀溶于少量缓冲液中(以沉淀刚溶解为度)，装入透析袋中，于4℃条件下透析24小时，除去硫酸铵，透析液为20mmol/LpH7.6磷酸盐缓冲液。透析后离心10min弃去沉淀。2纯化后酶液的处理计量酶液的体积，保留上清液1mL于冰箱中。其余保存在冰箱中供进一步纯化用。四、操作方法

1透析除盐实验七

透析法脱盐葡聚糖凝胶层析

一、实验目的掌握透析方法进行蛋白质脱盐。学习凝胶层析的工作原理和操作方法。

实验七透析法脱盐掌握透析方法进行蛋白质脱盐。二、实验原理用硫酸铵沉淀蛋白质，如果不除去无机盐，就无法用电泳法，离子交换层析法作进一步分离提纯，也影响酶活力的测定，因此，必须除去无机盐。用透析法、超滤法和分子筛层析的方法可以从蛋白质制剂中除去无机盐。

透析是利用蛋白质大分子不能通过半透膜而小分子杂质能通过半透膜的性质，使蛋白质和小分子杂质分开的方法。常用的半透膜是玻璃纸、火棉胶薄膜等。将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，然后将透析袋放在蒸馏水或低离子强度的缓冲液中，则小分子杂质通过半透膜而被除去，大分子蛋白质则仍留在袋中。二、实验原理用硫酸铵沉淀蛋白质，如果不除去无机盐，为了缩短透析时间，可以经常换水或流水透析。用4%BaCl2溶液检查透析袋外的溶液是否含有硫酸根离子，当液体中无BaSO4白色浑浊出现时，即表明硫酸铵已被除尽，可以结束透析。（NH4）2SO4+BaCl2

BaSO4↓+2NH4Cl为了缩短透析时间，可以经常换水或流水透析。用4%BaCl2溶半透膜袋蛋白质溶液透析液磁棒磁力搅拌器半透膜袋蛋白质溶液透析液磁棒磁力搅拌器透析袋酶溶液蒸馏水加压酶溶液超滤膜支持栅板超滤液图3-1透析装置图3-2超滤装置透析袋酶溶液蒸馏水加压酶溶液超滤膜支持栅板超滤液图3-1

电泳

前处理粗分离细分离生物组织

无细胞提取液破碎、溶解、差速离心选择性沉淀法亲和层析离子交换层析精制后的蛋白质凝胶过滤疏水层析吸附层析一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率柱层析及电泳方法。另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。电泳凝胶作为支持剂凝胶颗粒内部具有多孔网状结构。被分离的混合物流过层析柱时:凝胶过滤柱层析

（分子筛层析）大分子先下来小分子后下来凝胶作为支持剂凝胶过滤柱层析

分子筛层析原理示意图分子筛层析原理示意图分子筛层析与洗脱曲线

凝胶颗粒收集蛋白质管蛋白质混合物大分子从柱上面加缓冲溶液小分子洗脱体积（Ve）凝胶柱大分子小分子Ve1Ve2V0分子筛层析与洗脱曲线

凝胶颗粒收集蛋白质管蛋白质混合物大分子蛋白质Mr=49,000洗出液中的蛋白质浓度洗脱体积（mL）未知logMr洗脱体积与相对分子质量的关系

Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“选择性曲线”

G-200G-100logMrKav蛋白质Mr=49,000洗出液中的蛋白质浓度洗脱体积（mL）凝胶的种类和性质

交联葡聚糖凝胶（Sephadex)SephadexG系列

G后的数字为凝胶吸水值的10倍。

G反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。琼脂糖凝胶（Sepharose；Bio-Gel)

依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。聚丙烯酰胺一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品名为生物胶—P（Bio-GelP)。聚丙乙烯凝胶（Styrogel)大网孔结构。凝胶的种类和性质表葡聚糖凝胶(Sephadex)的物理特性品名干胶颗粒直径/μm得水值Wf/g.g-1床体积/mL.g-1最适分段分离范围溶胀所需时间/h最大流体静力压/Pa(cmH2O)球蛋白分子质量／Da线性葡聚糖分子质量/Da20℃lOO℃SephadexG-1O40-1201.0±0.12-370070031>9810(100)SephadexG-1540-1201.5±0.22.5-3.51500150031>9810(100)SephadexG-25粗中粗细超细100-30050-15020-8010-402.5±0.24-61000-5000100-500062>9810(100)SephadexG-50粗中粗细超细100-30050-15020-8010-405.0±0.39-111500-30000500-1000062>9810(100)SephadexG-75中粗超细40-12010-407.5±0.512-153000-700001000-500002434905(50)SephdexG-100中粗超细40-12010-4010±l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)SephadexG-150中粗超细40-