外显子组测序课件

外显子组测序1外显子组测序1目录一、外显子测序简介二、测序深度三、测序平台四、数据分析流程五、数据分析内容六、后期验证2目录一、外显子测序简介二、测序深度三、测序平台四、数据分外显子测序（也称目标外显子组捕获）是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。是一种选择基因组的编码序列的高效策略，外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势。在人类基因中大约有180,000外显子，占人类基因组的1%，约30MB。NgSB,TurnerEH,RobertsonPD,etal.Targetedcaptureandmassivelyparallelsequencingof12humanexomes[J].Nature,2009,461(7261):272-276.

人类基因组的蛋白编码区域大约包含85%的致病突变。-ChoiM,SchollUI,JiW,etal.GeneticdiagnosisbywholeexomecaptureandmassivelyparallelDNAsequencing[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2009,106(45):19096-19101.一、外显子测序简介3外显子测序（也称目标外显子组捕获）是指利用序列捕获技Thesensitivitytodetectheterozygousvariantswith10readsis78.6%,butincreasesto95.2%at20xandapproximately100%at30xandgreater.[1]Theaveragecover­ageofeachbaseinthetargetedregionswas100-fold,and95.3%ofthesebaseswerecoveredsufficientlydeeplyforvariantcalling(≥10×cover­age)[2]Exomesequencingproducedahigherlevelofcoverageforthetargetedsequences(mean,167.50×),slightlyincreasingourabilitytodetectmutationswithVAFsoflessthan10%.[3]ChoiM,SchollUI,JiW,etal.GeneticdiagnosisbywholeexomecaptureandmassivelyparallelDNAsequencing[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2009,106(45):19096-19101.YanXJ,XuJ,GuZH,etal.ExomesequencingidentifiessomaticmutationsofDNAmethyltransferasegeneDNMT3Ainacutemonocyticleukemia[J].Naturegenetics,2011,43(4):309-315.PlatformsA.GenomicandEpigenomicLandscapesofAdultDeNovoAcuteMyeloidLeukemia[J].NEnglJMed,2013,2013(368):2059-2074.二、测序深度4ThesensitivitytodetectheteCoveragerateSequencingdepthandcoverageoftheninepairedinitialsequencingsamples.5CoveragerateSequencingdepth三、测序平台IonProton™IlluminaHiSeq6三、测序平台IonProton™IlluminaHiSe基于IonProton™的外显子测序流程7基于IonProton™的外显子测序流程7TheboundDNAisisolatedusingstreptavidin-coatedDynabeads®paramagneticbeads,andthenamplifiedandpurified.Thepurified,target-enrichedsampleisthenreturnedtotheIonTorrentsystemworkflowforemulsionPCR,enrichment,andsequencing.ExomesequencingresultsontheIonProton™SystemusingtheIonPI™ChipandtheIonTargetSeq™ExomeKit8TheboundDNAisisolatedusinRawreadsReadsmappedPercentreadsmappedReadsontargetPercentreadsontarget89,782,71987,156,36497.1%68,899,95779.1%MeandepthofcoverageTargetbasesat1xTargetbasesat10xTargetbasesat20x119x98.5%95.3%92.5%TypeNumberofvariantsConcordancewithdbSNP135SNVs30,09598.0%HeterozygousSNVs18,03197.1%HomozygousSNVs12,04699.4%基于IonProton™的外显子测序结果9RawreadsReadsmappedPercent基于IlluminaHiSeq的外显子测序流程10基于IlluminaHiSeq的外显子测序流程10DNA样本要求（单次）：总量：≥6µgDNA；浓度：≥

37.5ng/µL；纯度：OD260/280=1.8-2.0。（来自华大基因）DNA样本要求（单次）：总量：200-300bp小片段PE文库≥5µg；浓度：≥50ng/µL；纯度：OD260/280=1.8-2.0。（来自美吉生物）DNA样本要求（单次）：总量：≥50µg；浓度：≥100ng/µL；纯度：OD260/280=1.8-2.0。（来自派森诺生物）基因组DNA样本要求11DNA样本要求（单次）：基因组DNA样本要求11外显子捕获平台12外显子捕获平台12Highlyuniformcoverageacross62Mbofexomicsequence,including5’UTR,3’UTR,microRNA,andothernon-codingRNA.Streamlinedprotocolforpre-enrichmentpoolingofuptosixsamplesdramaticallyreduceshands-ontimeandcost.OptimizedforusewiththeTruSeqDNASamplePreparationKit,providingagel-freeprotocolthatrequiresthelowestDNAinput.Automation-friendlywithmaster-mixedreagentsandplate-basedprocessingforupto96reactions.TruSeqExomeEnrichmentKit13HighlyuniformcoverageacrossTruSeqExomeEnrichmentWorkflow14TruSeqExomeEnrichmentWorkfl烈冰生物外显子测序数据分析思路15烈冰生物外显子测序数据分析思路15四、数据分析流程16四、数据分析流程161.数据下机文件：*.fastq2.序列QC去除低质量reads，和连续的低质量片段，去掉接头序列。QC统计reads数量及测序质量。3.Mapping由于bwa能准确、快速的将短序列比对到基因组上，而且软件持续更新和说明文档完备，是外显子捕获测序的首选。4.Sam到bam转换：

Samtools的多种工具可以将sam文件转换为bam文件，rmdup工具能去除PCR扩增产生的冗余reads，消除由于文库扩增而导入的突变，降低假阳性。Flagstat统计reads的mapping情况以及比较去除duplicate前后reads数目的反映样品建库的冗余情况。

Picard提供的多个工具，修改bam文件，使之适合于后续的GATK软件包中的工具的处理。171.数据下机文件：*.fastq175.Indel区域的reads重新做局部多序列比对：

在indel的边缘，一些错配看起来很像是SNP，通过对dbSNP库及bam文件检测到的indel附近的reads进行局部的重新比对，可以消除indel周边的假阳性SNP。

6.碱基质量重新打分：

测序仪给reads中的碱基的qual值存在一定的偏差，通过经验的错误模型来重新计算的碱基的qual值，重新给reads的各个碱基的qual打分。

7.Callsnv和indel：

对处理好的多样品bam文件同时运行UnifiedGenotyper，大大提高callSNP的灵敏度和准确性，多样品同时比较的结果，方便了后续的样品间差异的筛选。

8.突变位点的重新打分：

通过hapmap，omni，dbsnp数据库中已知的突变位点建模优化，对各个突变位点重新打分，筛选。大大降低了假阳性率。

9.注释：

通过ANNOVAR软件对vcf结果注释，关联到多个数据库。185.Indel区域的reads重新做局部多序列比对：

在i1.Mapping统计：

统计总reads数，mappedreads及uniquemappedreads数目及百分比。

2.捕获效率统计：

统计来自捕获区域的Fragment比例：五、数据分析内容191.Mapping统计：

统计总reads数，mappe统计target区域所有的碱基覆盖次数分布：对每个target区域的覆盖和深度统计：

如果客户对某些基因特别感兴趣，想要看看来自这些基因的外显子区域的覆盖情况，可以提供每个target或者特定target区域的覆盖情况和测序深度统计。20统计target区域所有的碱基覆盖次数分布：对每个targe3.Snv和indel关联数据库：

Snv和indel结果按照突变的位点是否在捕获的区域之内分成两部分：

*_target.snv：突变处于捕获的靶区域(targetregion)内。

*_off_target.snv或者*_target.indel:突变在捕获的靶区域之外。

Snv和indel结果与以下的数据库关联，为突变的筛选提供大量的信息。213.Snv和indel关联数据库：

211）基因注释：

通过基因注释可以达到以下的目的：突变的功能定位(在外显子，内含子，剪接位点还是基因间区)；突变所在的基因名称或者临近的基因；突变如果在编码区域，是否引起氨基酸的改变(同义突变，非同义突变的呢过)；如果引起氨基酸的改变，按照HGVS命名规则表示--改变的基因ID，转录本ID，外显子编号，以及氨基酸改变，如OD2:NM_022162:exon8:c.G2722C:p.G908R。

默认使用refSeq完成基因注释，如果有特殊的要求，可以使用UCSCknowngene，Ensembl，GENCODE，CCDS等基因注释系统。221）基因注释：

通过基因注释可以达到以下的目的：22232324242）1000G注释：

检测突变位点是否在1000GenomesProjects（2012release）数据库中检测到，如果检测到，显示等位基因频率（allelefrequency）。默认是使用所有人种的数据库，如果有特定要求，可以按照要求展示不同人种（比如AMR,AFR,ASN，EUR，中国人，日本人）等位基因频率。

3）dbSNP注释：

检测突变是否在dbSNP数据库中，如果在，显示rsID。

默认使用dbSNP135数据库,如果有特定的要求，可以使用dbSNP129，dbSNP130，dbSNP131，dbSNP132数据库。4）AVSIFT：

SIFT是一款很受欢迎的检测非同义突变位点重要性的软件，对应非同义突变位点，会给定一个打分，若打分低于0.05，则表明突变很可能会影响到蛋白质的功能。

252）1000G注释：

检测突变位点是否在1000Gen5）与UCSC的数据库的关联：

/goldenPath/hg19/database/.txt.gz,提供了大量的基因组注释信息，目前关联的数据库有：

tfbsConsSites：在人/小鼠/大鼠中保守的转录因子结合位点，以transfacMatrixDatabase(v7.0)为基础。

wgRna：snoRNAandmiRNA注释。

targetScanS：TargetScan预测的miRNA把区域。

gwasCatalog：已经发表的各种疾病的GWAS结果。

genomicSuperDups：基因组中的重复片段。

phastConsElements46way：通过phastCons对脊椎动物的全基因组比对生成的保守区域，根据用于比对的物种数目，分为17way,28way,30way,44way等。默认使用46way。

如果客户需要关联UCSC中其它的数据库，也可以定制。

6）cosmic63：

已观察到的癌症相关突变，显示在COSMIC中的ID（identifiers），观察到的次数，以及观察到的癌组织。265）与UCSC的数据库的关联：

ftp://hgdown4.CNV：

XHMM是一款外显子捕获拷贝数变异检测的优秀软件包，使用GATK和XHMM能够得到较好的外显子捕获的CNV结果。

5.其它：

Polyphen-2(PolymorphismPhenotypingv2)也是一款基于多序列比对和蛋白质3D结构，预测氨基酸替换(从一种氨基酸改变为另一种氨基酸)对蛋白质结构和功能影响的软件，如果客户有要求，可以提供Polyphen-2对snv结果的进一步分析服务。274.CNV：

XHMM是一款外显子捕获拷贝数变异检测的优28282929可以通过GT（genotype）直接比较样品间的差异(GT简介：0表示与Ref相同，1表示与ALTS第1个碱基相同，2表示如ALTS第2个碱基相同)。通过和多个数据库的提供关联精细筛选条件：30可以通过GT（genotype）直接比较样品间的差异(GT简六、后续验证Sanger测序验证根据目的基因设计个性化验证方案（后续验证由老师自己完成）31六、后续验证Sanger测序验证31外显子组测序32外显子组测序1目录一、外显子测序简介二、测序深度三、测序平台四、数据分析流程五、数据分析内容六、后期验证33目录一、外显子测序简介二、测序深度三、测序平台四、数据分外显子测序（也称目标外显子组捕获）是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。是一种选择基因组的编码序列的高效策略，外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势。在人类基因中大约有180,000外显子，占人类基因组的1%，约30MB。NgSB,TurnerEH,RobertsonPD,etal.Targetedcaptureandmassivelyparallelsequencingof12humanexomes[J].Nature,2009,461(7261):272-276.

人类基因组的蛋白编码区域大约包含85%的致病突变。-ChoiM,SchollUI,JiW,etal.GeneticdiagnosisbywholeexomecaptureandmassivelyparallelDNAsequencing[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2009,106(45):19096-19101.一、外显子测序简介34外显子测序（也称目标外显子组捕获）是指利用序列捕获技Thesensitivitytodetectheterozygousvariantswith10readsis78.6%,butincreasesto95.2%at20xandapproximately100%at30xandgreater.[1]Theaveragecover­ageofeachbaseinthetargetedregionswas100-fold,and95.3%ofthesebaseswerecoveredsufficientlydeeplyforvariantcalling(≥10×cover­age)[2]Exomesequencingproducedahigherlevelofcoverageforthetargetedsequences(mean,167.50×),slightlyincreasingourabilitytodetectmutationswithVAFsoflessthan10%.[3]ChoiM,SchollUI,JiW,etal.GeneticdiagnosisbywholeexomecaptureandmassivelyparallelDNAsequencing[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2009,106(45):19096-19101.YanXJ,XuJ,GuZH,etal.ExomesequencingidentifiessomaticmutationsofDNAmethyltransferasegeneDNMT3Ainacutemonocyticleukemia[J].Naturegenetics,2011,43(4):309-315.PlatformsA.GenomicandEpigenomicLandscapesofAdultDeNovoAcuteMyeloidLeukemia[J].NEnglJMed,2013,2013(368):2059-2074.二、测序深度35ThesensitivitytodetectheteCoveragerateSequencingdepthandcoverageoftheninepairedinitialsequencingsamples.36CoveragerateSequencingdepth三、测序平台IonProton™IlluminaHiSeq37三、测序平台IonProton™IlluminaHiSe基于IonProton™的外显子测序流程38基于IonProton™的外显子测序流程7TheboundDNAisisolatedusingstreptavidin-coatedDynabeads®paramagneticbeads,andthenamplifiedandpurified.Thepurified,target-enrichedsampleisthenreturnedtotheIonTorrentsystemworkflowforemulsionPCR,enrichment,andsequencing.ExomesequencingresultsontheIonProton™SystemusingtheIonPI™ChipandtheIonTargetSeq™ExomeKit39TheboundDNAisisolatedusinRawreadsReadsmappedPercentreadsmappedReadsontargetPercentreadsontarget89,782,71987,156,36497.1%68,899,95779.1%MeandepthofcoverageTargetbasesat1xTargetbasesat10xTargetbasesat20x119x98.5%95.3%92.5%TypeNumberofvariantsConcordancewithdbSNP135SNVs30,09598.0%HeterozygousSNVs18,03197.1%HomozygousSNVs12,04699.4%基于IonProton™的外显子测序结果40RawreadsReadsmappedPercent基于IlluminaHiSeq的外显子测序流程41基于IlluminaHiSeq的外显子测序流程10DNA样本要求（单次）：总量：≥6µgDNA；浓度：≥

37.5ng/µL；纯度：OD260/280=1.8-2.0。（来自华大基因）DNA样本要求（单次）：总量：200-300bp小片段PE文库≥5µg；浓度：≥50ng/µL；纯度：OD260/280=1.8-2.0。（来自美吉生物）DNA样本要求（单次）：总量：≥50µg；浓度：≥100ng/µL；纯度：OD260/280=1.8-2.0。（来自派森诺生物）基因组DNA样本要求42DNA样本要求（单次）：基因组DNA样本要求11外显子捕获平台43外显子捕获平台12Highlyuniformcoverageacross62Mbofexomicsequence,including5’UTR,3’UTR,microRNA,andothernon-codingRNA.Streamlinedprotocolforpre-enrichmentpoolingofuptosixsamplesdramaticallyreduceshands-ontimeandcost.OptimizedforusewiththeTruSeqDNASamplePreparationKit,providingagel-freeprotocolthatrequiresthelowestDNAinput.Automation-friendlywithmaster-mixedreagentsandplate-basedprocessingforupto96reactions.TruSeqExomeEnrichmentKit44HighlyuniformcoverageacrossTruSeqExomeEnrichmentWorkflow45TruSeqExomeEnrichmentWorkfl烈冰生物外显子测序数据分析思路46烈冰生物外显子测序数据分析思路15四、数据分析流程47四、数据分析流程161.数据下机文件：*.fastq2.序列QC去除低质量reads，和连续的低质量片段，去掉接头序列。QC统计reads数量及测序质量。3.Mapping由于bwa能准确、快速的将短序列比对到基因组上，而且软件持续更新和说明文档完备，是外显子捕获测序的首选。4.Sam到bam转换：

Samtools的多种工具可以将sam文件转换为bam文件，rmdup工具能去除PCR扩增产生的冗余reads，消除由于文库扩增而导入的突变，降低假阳性。Flagstat统计reads的mapping情况以及比较去除duplicate前后reads数目的反映样品建库的冗余情况。

Picard提供的多个工具，修改bam文件，使之适合于后续的GATK软件包中的工具的处理。481.数据下机文件：*.fastq175.Indel区域的reads重新做局部多序列比对：

在indel的边缘，一些错配看起来很像是SNP，通过对dbSNP库及bam文件检测到的indel附近的reads进行局部的重新比对，可以消除indel周边的假阳性SNP。

6.碱基质量重新打分：

测序仪给reads中的碱基的qual值存在一定的偏差，通过经验的错误模型来重新计算的碱基的qual值，重新给reads的各个碱基的qual打分。

7.Callsnv和indel：

对处理好的多样品bam文件同时运行UnifiedGenotyper，大大提高callSNP的灵敏度和准确性，多样品同时比较的结果，方便了后续的样品间差异的筛选。

8.突变位点的重新打分：

通过hapmap，omni，dbsnp数据库中已知的突变位点建模优化，对各个突变位点重新打分，筛选。大大降低了假阳性率。

9.注释：

通过ANNOVAR软件对vcf结果注释，关联到多个数据库。495.Indel区域的reads重新做局部多序列比对：

在i1.Mapping统计：

统计总reads数，mappedreads及uniquemappedreads数目及百分比。

2.捕获效率统计：

统计来自捕获区域的Fragment比例：五、数据分析内容501.Mapping统计：

统计总reads数，mappe统计target区域所有的碱基覆盖次数分布：对每个target区域的覆盖和深度统计：

如果客户对某些基因特别感兴趣，想要看看来自这些基因的外显子区域的覆盖情况，可以提供每个target或者特定target区域的覆盖情况和测序深度统计。51统计target区域所有的碱基覆盖次数分布：对每个targe3.Snv和indel关联数据库：

Snv和indel结果按照突变的位点是否在捕获的区域之内分成两部分：

*_target.snv：突变处于捕获的靶区域(targetregion)内。

*_off_target.snv或者*_target.indel:突变在捕获的靶区域之外。

Snv和indel结果与以下的数据库关联，为突变的筛选提供大量的信息。523.Snv和indel关联数据库：

211）基因注释：

通过基因注释可以达到以下的目的：突变的功能定位(在外显子，内含子，剪接位点还是基因间区)；突变所在的基因名称或者临近的基因；突变如果在编码区域，是否引起氨基酸的改变(同义突变，非同义突变的呢过)；如果引起氨基酸的改变，按照HGVS命名规则表示--改变的基因ID，转录本ID，外显子编号，以及氨基酸改变，如OD2:NM_022162:exon8:c.G2722C:p.G908R。

默认使用refSeq完成基因注释，如果有特殊的要求，可以使用UCSCknowngene，Ensembl，GENCODE，CCDS等基因注释系统。531）基因注释：

通过基因注释可以达到以下的目的：22542355242）1000G注释：

检测突变位点是否在1000GenomesProjects（2012release）数据库中检测到，如