《中国药典》无菌检查法修订

中国药典2015年版无菌检查法的增修订内容

1、无菌

是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物。2、无菌检查法用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。3、无菌操作

是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械等进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法。4、无菌技术

是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作。5、无菌检查法的局限性若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。也就是无菌试验并不能用于保证整批产品的无菌性，但是它可用于确定批产品不符合无菌要求。

灭菌产品的无菌保证不能依赖于最终产品的无菌检验，它是作为确定批无菌产品是否无菌的一个检验项目，而产品的无菌保证要取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、良好的无菌保证体系和严格的GMP管理。

1.理论上的局限性

2.统计概率的局限性

3.检验条件的局限性

主要内容

我国药典无菌检查法的历史发展我国药典无菌检查法与欧美药典的差异中国药典2015年版通则（1101）无菌检查法的增修订内容2015版《中国药典》无菌检查法医院制剂进行微生物控制的必要性

修订时间修订内容1953年版直接接种法无阳性对照菌取样量2支/瓶1963年版直接接种法三种培养基培养基阳性对照－金葡1977年版直接接种法增加了薄膜过滤法（抗生素）。阳性对照－金葡1985年版直接接种法薄膜过滤法限培养基为需、厌气菌培养基及霉菌培养基。阳性对照－金葡1990年版同1985年版1995年版培养基灵敏度检查－藤黄、生孢、白念。阳性对照：金葡10－6；生孢10－6；白念10－51998年阳性对照：金葡10－6；生孢10－6；白念10－52000年版实验环境为100级洁净度。要求全过程防止微生物污染，检验量6～11支/瓶；50毫升以上大容量液体采用薄膜过滤法检查。首次收载全封闭无菌测试技术。阳性对照：金葡、生孢、白念均10～100个菌抑细菌和抑真菌试验2005年版增收隔离系统，环境洁净度的验证，培养基适用性检查，稀释液冲洗液品种；规定优先采用薄膜过滤法；检验方法的验证试验；延长培养时间为14天、取消复试。2010年版在2005版基础上强调检验的过程控制，保证检验结果的准确性我国药典无菌检查法的历史发展

2005年版主要变化10000下局部100级，隔离系统，GB-洁净度验证培养基适用性检查方法验证试验优先用封闭式薄膜过滤器增加稀释液冲洗液品种直接接种法“一对一”延长培养时间为14天对表1强调了“每种培养基最少检验数量”取消复试2010年版主要变化对无菌检查人员提出专业要求和培训增加了可选用其它经验证的稀释液、冲洗液方法验证试验菌：金、大、枯、生、白、黑冲洗量：少量（约100ml）多次，总量不超过1000ml强调检验的过程控制，保证检验结果的准确性我国药典无菌检查法的历史发展

我国药典无菌检查法与欧美药典的差异比较项目ChP2010USP35EP7.0检验条件规定总体10000级、局部100级应在无菌条件下进行。应在无菌条件下进行。人员要求具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训经培训和认可经培训和认可培养基、培养条件与时间硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃；20～25℃(三部）改良马丁培养基

23～28℃均培养14天，转种后细菌培养2天、真菌培养3天硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃胰酪大豆胨液体培养基20～25℃

培养不少于14天转种后培养不少于4天硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃胰酪大豆胨液体培养基

20～25℃培养不少于14天转种后培养不少于7天培养基灵敏度检查与方法验证用菌株金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌；生孢梭菌；白色念珠菌、黑曲霉检验方法只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法性状允许的样品采用薄膜过滤，利于抗菌影响去除采用薄膜过滤，利于抗菌影响去除稀释剂与薄膜过滤冲洗液1、0.1％蛋白胨水溶液；2、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液3、其他经验证过的溶液1．0.1%蛋白胨水溶液；2．0.1%蛋白胨水溶液＋1ml吐温803．动物组织消化液＋牛肉浸膏＋吐温801．0.1％蛋白胨水溶液2．0.1％蛋白胨水溶液＋0.1％（聚乙氧基乙醇、0.1％吐温-80）3．十四烷酸异丙酯。结果判断与复试规定一次检出结果为准(设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌生长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的。单倍量重试)

2015版药典无菌检查法的增、修订内容

1、方法应用范围增加“生物制品”。

2、实验环境的修订。3、培养基体系的修订。

4、检查方法的整合修订。5、参照USP对表2、表3的整合修订。－50100200不作规定不作规定290003520000D级－25501002900035200002900352000C级555102900352000293520B级<1<1<1<120

3520203520A级5指手套cfu/手套接触碟/（f55mm）cfu/≥5.0μm≥0.5μm≥5.0μm≥0.5μm表面微生物沉降菌（f90mm）cfu/4h(2)浮游菌cfu/m3动态静态微生物监测的动态标准(1)悬浮粒子最大允许数/立方米洁净度级别实验环境的重大修订

动态

2010年版无菌检查应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内或隔离系统进行2015年版无菌检查在无菌条件下进行试验，环境必须达到无菌检查的要求。无菌检查环境修订

2010年版1.硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃；20～25℃2.改良马丁培养基23～28℃培养。3.选择性培养基4.0.5%葡萄糖肉汤培养基5.营养肉汤培养基6.营养琼脂培养基7.改良马丁琼脂培养基2015年版1.硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃；20～25℃培养2.胰酪大豆胨肉汤培养基20～25℃培养。

3.选择性培养基4.0.5%葡萄糖肉汤培养基5.胰酪大豆胨琼脂培养基6.沙氏葡萄糖肉汤培养基7.沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基增修订内容硫乙醇酸盐流体培养基厌氧菌检查（首选）

需气菌检查。胰酪大豆胨液体培养基真菌和需气菌的检查。

适用范围培养基灵敏度检查实验菌株的修订

2010年版

硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌改良马丁培养基白色念珠菌、黑曲霉

2015年版硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、胰酪大豆胨液体培养基枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液制备用培养基2010年版1、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤培养基培养基2、接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基3、接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基4、接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上2015年版1、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基2、接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基3、接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基

4、接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基

2010版

硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌

改良马丁培养基接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉。2015版硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100CFU的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管胰酪大豆胨液体培养基接入小于100CFU的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉。方法适用性试验的修订ICHQ6B，USP、EP、BP、JP无菌检查法中生物技术产品/及生物制品检定规程、标准没有对生物制品作出特殊的规定。整合中的焦点：培养温度

三部无菌检查法规定样品接种硫乙醇酸盐流体培养基必须分成双份，分别置30～35℃、20～25℃两个温度下培养。以致在取样量、检验量、接种方式、培养温度、阳性对照试验等方面存在与二部不一致的规定。

修订原则：

以国际发展趋势为主导，遵照2015年版药典编制大纲的要求进行，以二部为基础，整合稿保留了生物制品无菌检查法的特点，在检验数量、检验量、阳性对照、培养温度方面互相兼顾，作原则性要求而不作具体细则规定。致力于逐步修订完善。检验数量的整合

2010版检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出厂产品按表1规定；上市产品监督检验按表2、表3规定。表1、表2、表3中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加每种培养基中所接种的量作阳性对照用。

2015版检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，①出厂产品按表1规定；②上市产品监督检验按表2规定表1、表2中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。检验量的整合2010版2015版检验量：是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表2、表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法供试品的总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g或ml）。除另有规定外供试品检验按表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。

检验量的整合2010版检验量是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表2、表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法供试品的总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。

2015版

检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g或ml）。除另有规定外供试品检验按表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。

参照USP对表1、表2、表3整合修订内容

2010版表1.批出厂产品最少检验数量。表2.液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量。表3.固体制剂最少检验及上市抽验样品的最少检验数量。2015版表1.批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量。注若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。表2.上市抽验样品的最少检验数量（包括液体和固体制剂）。注①若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。②抗生素粉针剂（≥5g)及抗生素原料药的最少检验数量为6瓶（或支）。

筒装固体原料的最少检验数量为4个包装。根据具体情况定表3.供试品的最少检验量（包括液体和固体制剂）。注如果医疗器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。

阳性对照试验

按原二部的规定：⒈供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。⒉阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小

于100CFU。⒊阳性对照管培养48～72小时应生长良好。

阴性对照试验

阴性对照试验按原二部的规定：取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。

阴性对照不得有菌生长。薄膜过滤法

2010版薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般薄膜过滤器水溶液供试品：取规定量，直接过滤，或混合至适量含适宜稀释液的无菌容器中，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法适用性试验。2015版薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。水溶液供试品：增加：①一般样品冲洗后，1份滤器加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，1份滤器加入100ml胰酪大豆胨液体培养基。②生物制品样品冲洗后，2份滤器加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，1份滤器加入100ml胰酪大豆胨液体培养基。直接接种法2010版直接接种法取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中。

2015版增订：①直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品等量接种于硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨肉汤培养基中除生物制品外，一般样品两种培养基接种的支/瓶数相等；②生物制品硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2：1。

培养及观察整合

2010版将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养14天；外观上判断不能从有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养2天、真菌培养3天2015版将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养14天；增订：接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份，一份置30～35℃培养，一份置20～25℃培养。修订：不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养3天。结果判断整合按原二部的规定2015版无菌检查法增、修订内容说明1.无菌检查法收载于《中国药典》三部通则中，一部和二部内容一致2.以2010年版二部的“无菌检查法”为基础进行整合和修订3.保留了生物制品的特点。如检查数量、硫乙醇酸盐流体培养基接种份数和培养温度等。4.在无菌条件下进行试验，环境必须达到无菌检查的要求。5.改良马丁培养基修订为胰酪大豆胨液体培养基。6.方法验证试验修订为方法适用性试验。7.由于培养基的改变，培养基的灵敏度和方法适用性试验也做了修订。8.修订了表一、表二、表三的内容。

2010版

金葡、大肠、枯草、生孢

白色、黑曲2015版金葡、大肠、生孢枯草、白色、黑曲方法适用性试验的菌株

⒈医院制剂当前面临的形势⒉医院制剂微生物检查重点⒊个例医院制剂进行微生物控制的必要性

医院制剂当前面临的形势⒈贯彻《国家药品安全“十二五”规划》，加强对医疗机构制剂监督管理。⒉统一标准、提高标准，完成质量标准修订工作，保证制剂质量。⒊高风险制剂制定科学、合理的质量标准和技术规范，确保安全、有效和质量可控。⒋淘汰市场巳有供应或疗效不确等不符合国家注册要求的品种。⒌医院制剂微生物检查的现状

医院制剂微生物检查的现状⒈领导班子有待重视。⒉微生物检验人员缺乏，技术力量薄弱。⒊基本的仪器设备空缺。⒋操作不规范，标准掌握不透。⒌部分单位没有正常开展微生物检验工作。

医院制剂微生物检查重点妇科、儿科及风险高、质量可控不强的冲洗剂、眼用制剂及用于烧伤、创伤等需要进行无菌检查严