DNA体外酶切连接课件

DNA体外重组技术概述一、DNA重组技术相关概念

克隆(clone)来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被成为副本或拷贝）。克隆化(cloning)获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖。DNA克隆(DNAcloning)应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子)-重组DNA

。继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞。再进行扩增提取获得大量同一DNA分子的过程称为DNA克隆，又称为基因克隆(genecloning)或分子克隆(molecularcloning)。

二、DNA重组技术基本程序1.外源DNA（目的DNA）的获取4.连接物（重组DNA)导入合适受体细胞3.目的DNA与载体的连接2.克隆载体的选择与构建5.重组体的筛选克隆基因的表达

分、切、接、转、筛供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。基因克隆简介

目的基因

载体

酶切，连接

重组基因

转入

受体细胞筛选阳性克隆

分切、接转筛常用工具酶限制性内切核酸酶：能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶，简称内切酶。DNA连接酶：能够在DNA双链5’-磷酸基和3’-羟基之间形成3’,5’磷酸二酯键。封闭DNA的缺口或链接两个DNA片段T4DNA连接酶来源于噬菌体

限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名属名种名株名HindIII

HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶EcoRI等产生的5‘粘性末端’5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPPvuII等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr酶切效率1U

核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’DNA连接酶DNA连接酶的基本性质修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键DNA连接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknickDNA连接酶的基本性质修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键T4-DNA连接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’DNA连接酶DNA连接酶的反应条件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量DNA连接酶平头双链DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）

加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mMDNA连接酶

作为基因工程载体所需具备的基本条件：1.

带有复制子，能在宿主细胞内携带外源基因一同进行复制。3.

具有多个筛选标志：如抗药基因、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应等。2.

有单酶切位点、多克隆酶切位点(多种酶单一位点)，供外源基因的插入。4.

表达型载体还应有使外源基因表达的完整的转录单位：如强启动子、前导序列、增强子等调控元件。质粒载体：存在于细菌外且能独立复制的双链闭合环状DNA分子克隆用质粒载体表达用质粒载体病毒载体：通过改造病毒基因组DNA，使其具有携带目的基因并且能够在宿主细胞中包装成病毒颗粒的DNA分子腺病毒载体、慢病毒载体、原核病毒载体（噬菌体）载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件质粒质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是DNA型的绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA质粒DNA的分子量范围：1-300kb质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1-3拷贝stringentplasmid松弛型复制控制的质粒10-60拷贝stringentplasmid质粒质粒的基本特征质粒的不相容性：分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势质粒质粒的基本特征质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等如Col、R的其它成员非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定质粒质粒的基本特征携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义质粒质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC101

8.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124ColE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Apr质粒重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制pBR322：氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell用于基因克隆质粒重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19：拷贝数2000-3000/cell用于基因克隆和测序装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’质粒重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal质粒重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3Z：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增噬菌体或病毒DNA与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病

毒基因组DNA。动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：单链DNA病毒双链DNA病毒单链RNA病毒双链RNA病毒RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。

用于基因转移的受体菌或细胞各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外

各种基因工程受体的特性大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌产结构复杂、种类繁多的内毒素各种基因工程受体的特性酵母菌具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌内源性蛋白产物种类繁多且含量高各种基因工程受体的特性哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）

与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体细胞培养条件苛刻，生长缓慢DNA重组前的准备工作选择载体的基本原则目的DNA片段大小：质粒容量小、病毒容量大明确重组目的：克隆载体、表达载体合适的克隆位点：酶切，先分析DNA片段酶切位点，再选择合适载体载体的稳定性：有的载体在37℃时会被宿主菌细胞中的酶降解磷酸二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶DNA片段与载体的重组连接方式：

黏性末端的连接平头末端的连接修饰黏性末端的连接

PCR产物的连接

Gateway载体构建体系一、黏性末端的连接

黏性末端连接(Cohesiveendligation)：具有黏性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下,连接成为一个杂合双链DNA。

1.同种酶产生的黏末端的连接优点经济省时，操作方便；外源片段容易回收；问题载体自身环化插入片段可双向插入2.不同限制酶酶切产生黏末端的连接载体和目的基因分子上有两个相同的酶切位点载体和目的基因只有一个相同的限制酶识别位点无相同的限制酶识别位点，有同尾酶

SalⅠ片段（CAGCTG）XhoⅠ片段(GAGCTC)G3’CAGCT5’C3’GAGCT5’DNA连接酶讨论：

连接后的重组分子还能被这两种限制酶切割么？？二、平末端的连接

平末端连接(bluntendligation)：在T4DNA连接酶的作用下，将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。平端连接