聚合酶链式反应技术及应用课件

1聚合酶链式反应技术及应用分子生物学

1聚合酶链式反应技术及应用分子生物学2022/11/27^2聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）技术是生命科学界的重大发明，是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。通过体外（试管内）扩增，可以将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，从而达到极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞、甚至一个分子的水平。

2022/11/27^2聚合酶链式反应（polymerase2022/11/27^3PCR发展简史PCR的发明人，一般公认是凯利﹒穆利斯（K.Mullis,在Cetus公司工作期间，发明了PCR。1983年4月穆利斯萌发了PCR的构想;1985关于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上发表;1987当年7月Cetus公司在美国获得PCR基本技术专利批准,并于当年11月推出了第一个PCR试剂产品及第一台热循环仪；1989Science报道了耐热性DNA多聚酶Taq酶的发现,预示着分子时代的到来；1990Cetus科学家D.Gelfand和S.Stoffel发明了纯化TaqDNA多聚酶的方法；1991TaqMan技术发表；九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开；1998年实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测。2022/11/27^3PCR发展简史PCR的发明人，一般公2022/11/27^4引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2022/11/27^4引物引物Mullis的构思DNA聚合2022/11/27^5KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。2022/11/27^5KaryB.Mullis2022/11/27^6PCR的应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他……2022/11/27^6PCR的应用研究2022/11/27^7PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制，在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。2.PCR基本原理2022/11/27^7PCR技术的基本原理是DNA的半保留2022/11/27^8模板DNA94℃变性55℃退火72℃引物延伸第二次循环模板变性退火延伸图6-1PCR原理示意图2022/11/27^8模板DNA94℃变性55℃退火72℃2022/11/27^91234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍2022/11/27^91234522557294时间（mi2022/11/27^10PCR产物生成曲线扩增产物循环次数指数扩增期扩增平台期2022/11/27^10PCR产物生成曲线扩增产物循环次数2022/11/27^11PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个PFU(空斑形成单位)细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA2022/11/27^11PCR的特点灵敏度高2022/11/27^12反应体系：（五要素）

模板（template）引物(primer)人工合成的两段寡核苷酸序列，决定RCP的特异性。3.PCR反应体系和反应条件DNA

RNA：总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因组DNA质粒DNA2022/11/27^12反应体系：（五要素）3.PCR2022/11/27^13PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率，特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子；引发效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。2022/11/27^13PCR反应成功扩增的一个关键条件在2022/11/27^14引物的长度

典型的引物为18-24个核苷酸，在一定范围内引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性；引物长度的上限主要与反应效率有关，所以一般又不能太长，因为过长会导致其延伸温度大于72℃，即Taq酶的最适温度。引物设计基本原则2022/11/27^14引物的长度典型的引2022/11/27^15PCR产物长度

一般来说，PCR产物长度对扩增效率有影响。扩增片段长度在普通PCR以200～500bp为宜；实时荧光PCR则为50～150bp。2022/11/27^15PCR产物长度一般来说，P2022/11/27^16引物的均衡性和GC含量

引物中碱基组成应尽可能随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶碱基堆积现象。有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高(非特异性扩增)或过低（特异性降低）都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。2022/11/27^16引物的均衡性和GC含量2022/11/27^17引物溶解温度（Tm值）

引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度.

如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G)2022/11/27^17引物溶解温度（Tm值）2022/11/27^18引物自身

引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败;引物3’端的几个碱基与模板DNA需严格配对，并最好为低稳定性结构。

5’端序列对PCR影响不如3’端大，常用来引进修饰位点或标记物。

2022/11/27^18引物自身2022/11/27^19使用PrimerPremier5.0等软件设计PCR引物进行引物设计时，点击

按钮，界面如下：

2022/11/27^19使用PrimerPremier2022/11/27^202022/11/27^202022/11/27^212022/11/27^212022/11/27^22-

DNA聚合酶(DNApolymerase)

PCR发明初期，不耐热的Klenow片段耐热的TaqDNA聚合酶－良好的热稳定性：92.5、95、97.5℃时，半衰期分别为130、40、5～6min；－良好的延伸效率：在75～80℃时延伸效率最高，每个酶蛋白分子的延伸速度可达150个核苷酸/s；－无3′－5′外切酶活性，缺乏校正功能；2022/11/27^22-DNA聚合酶(DNApol2022/11/27^23dNTP:包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP-PCRbuffer:一般组成：50mMKCl,10-50mM,Tris-Cl(室温PH8.3)，1.5mMMgCl2

KCl：促进引物退火，高浓度KCl抑制TaqDNA聚合酶活性；Tris-Cl：调节pH值，使反应体系偏碱性；MgCl2

：调节TaqDNA聚合酶活性、影响引物退火，PCR产物的特异性等2022/11/27^23dNTP:包括dATP、dTTP2022/11/27^241）PCR反应成分（1）模板一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件2022/11/27^241）PCR反应成分（1）模板PC2022/11/27^25（2）引物浓度

0.1-0.5mol/L

浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）TaqDNA聚合酶（thermus

aquaticus，水生栖热菌)

0.5-5U/100l

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。2022/11/27^25（2）引物浓度2022/11/27^26（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度

四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量

dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。2022/11/27^26（4）dNTP2022/11/27^27（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。对于大多数的PCR引物来说，Mg2+浓度为1.5mmol/L是适宜的，如果扩增效果不好，则调整镁离子的浓度可能会有所帮助。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2022/11/27^27（5）Mg2+Mg2+是DNA2022/11/27^282）循环参数变性使双链DNA解链为单链

94℃,30s～1min。(2)退火温度由引物长度和GC含量决定，一般比引物Tm值约低5℃。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性，但特异性低。热启动：在第一轮扩增前必须使模版DNA完全变性，一般94℃，变性5分钟2022/11/27^282）循环参数热启动：在第一轮扩增前2022/11/27^29（3）延伸

70-75℃,一般为72℃

延伸时间由扩增片段长度决定。（1~3min)（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-30次次数过多：产生“平台效应”错误掺入率增加2022/11/27^29（3）延伸2022/11/27^304.PCR扩增产物的检测方法凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）单链构型多态性分析法（PCR-SSCP）核酸探针杂交法PCR产物测序荧光PCR2022/11/27^304.PCR扩增产物的检测方法凝胶电2022/11/27^31(一)琼脂糖凝胶电泳法基本原理：DNA在电泳缓冲液中带负电荷，将PCR产物点样于负极端的加样孔，在电场力的作用下DNA涌向正极，并且由于电荷效应和分子筛效应，不同DNA分子量及构型的DNA涌动率不同；在电泳过程中，凝胶中的EB将嵌入DNA分子中，在紫外线照射下，EB-DNA复合物发出橙红色荧光，荧光强度与DNA含量成正比；不同浓度的凝胶分辨DNA的有效范围不同。操作简单，但存在EB污染。2022/11/27^31(一)琼脂糖凝胶电泳法基本原理：操2022/11/27^32聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途特点：分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；回收的DNA纯度高；采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。用途：PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。2022/11/27^32聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途特点：2022/11/27^33(二)PCR-限制性片段长度多态性分析法（polymerasechainreactionbasedonrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸内切酶可识别特异DNA序列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息用途：传染病病原体基因分型人类基因的变异性研究。是诊断遗传病和传染病病原体基因分型的常用方法2022/11/27^33(二)PCR-限制性片段长度多态性2022/11/27^34PCR-RFLP法：

限制性内切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突变限制性内切酶2022/11/27^34PCR-RFLP法：限制性内2022/11/27^35(三)单链构型多态性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism，简称PCR-SSCP）本法就是将PCR产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA（ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。2022/11/27^35(三)单链构型多态性分析法（PC2022/11/27^36PCR-SSCP过程

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP掺入

PCR扩增产物

↓

变性↓

单链DNA↓

中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

↓12345

自显影↓1.为正常结果分析2、4、5纯合患者

3.为杂合子

.

解链构像DAN原理过程2022/11/27^36PCR-SSCP过程2022/11/27^37优点及作用：方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要。该方法和其他方法相比有较高的检测率。首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。不足之处：只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序；电泳条件要求较严格；另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。2022/11/27^37优点及作用：方法简便、快速、灵敏，2022/11/27^38(四)核酸探针杂交法(1)点杂交（dotblot）(2)反向点杂交（reversedotblot）(3)微孔板夹心杂交（microplatehybridization）(4)荧光探针杂交(5)Southern印迹杂交（Southernblot）2022/11/27^38(四)核酸探针杂交法2022/11/27^39样品正对照负对照标准分子量

污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。用紫外灯破坏污染物也是一个办法5.PCR常见问题及分析2022/11/27^39样品正对照负对照标准分子量污染是2022/11/27^40(1)假阳性①PCR产物是最主要的污染源。②阳性对照的污染。③标本之间的交叉污染。④在采集标本时，其他污染源带来的污染。⑤使用带有污染的试剂。预防措施：2022/11/27^40(1)假阳性预防措施：2022/11/27^41(2)假阴性假阴性是PCR反应中另一个易出现的问题。造成的原因也比较多。可以归纳以下几方面原因。1)标本处理的原因。①处理标本时，靶DNA丢失。②处理标本时，杂质成分没有去除干净，带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。③标本放置不当，模板发生降解（尤其是RNA）。2022/11/27^41(2)假阴性2022/11/27^422)PCR试剂问题。

①引物设计不合理。②TaqDNA聚合酶失活。

③

Mg2+浓度过低或是没有加。3)PCR扩增过程中的问题①PCR扩增仪故障。②PCR扩增反应液没有加液体石蜡油。

4)PCR产物鉴定中的问题①电泳时没有加溴化乙锭。②电泳缓冲液和凝胶使用次数过多。③凝胶浓度过低，使扩增带跑散。2022/11/27^422)PCR试剂问题。2022/11/27^43(3)引物二聚体形成引物二聚体的原因有：⑴两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3′端有互补区。⑵引物比例太高，可增加模板用量。⑶退火温度过低。⑷热循环次数过多。2022/11/27^43(3)引物二聚体2022/11/27^44(4)非特异性PCR产物造成非特异性PCR产物的常见原因及其预防措施：①引物特异性不高或用量太大，应更换引物或降低用量；②TaqDNA聚合酶质量不好或用量太大，应更换酶或降低酶使用量；③Mg2+浓度过高，可适当调整其浓度；④退火温度过低，可提高退火温度；⑤延伸时间过长，可减少延伸时间；⑥热循环次数过多，应适当增加模板量，减少循环次数。2022/11/27^44(4)非特异性PCR产物2022/11/27^456.PCR技术的发展巢式PCR（nestedPCR）逆转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）多重PCR(multiplexPCR)重组PCR(recombinantPCR)锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）不对称PCR（asymmetricPCR）反向PCR（inversePCR）扩增长片段PCR（longPCR，long-distancePCR）免疫PCR(immuno-PCR)原位PCR(insituPCR)差示PCR（DD-PCR）定量PCR2022/11/27^456.PCR技术的发展巢式PCR（2022/11/27^46图6-3巢式PCR原理示意图外引物1外引物2内引物1内引物2第一次PCR第二次PCR（一）巢式PCR（nestedPCR）

2022/11/27^46图6-3巢式PCR原理示意图外2022/11/27^47提高反应的特异性2022/11/27^47提高反应的特异性2022/11/27^48RNA模板逆转录酶DNA-RNA

杂化双链RNA酶单链cDNAＤＮＡ聚合酶双链cDNA（二）逆转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）2022/11/27^48RNA模板逆转录酶DNA-RNA2022/11/27^49one-stepRT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、TaqDNA聚合酶、PCR引物、dNTP和缓冲液，直接以mRNA

为模板进行逆转录和PCR扩增，称为一步法RT-PCR。TthDNA聚合酶具有逆转录功能和DNA聚合功能。常用的逆转录酶有AMV逆转录酶（最适温度为42℃）和MoMLV逆转录酶（最适温度为37℃），常用的逆转录引物有三种：①随机引物；②Oligo（dT），只适合于3′端带有poly(A)尾的mRNA；③特异性引物，只适合于逆转录目的RNA序列。以逆转录产物cDNA为模板，再做PCR。2022/11/27^49one-stepRT-PCR：在2022/11/27^50经济2022/11/27^50经济2022/11/27^51（三）多重PCR（multiplexPCR）

PCR一般由一对引物扩增产生一个核酸片段，以此手段诊断疾病的效率低。为提高效率，常采用多重PCR技术。该技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用电泳加以鉴别。多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或病原微生物、遗传病及癌基因的分型鉴定。2022/11/27^51（三）多重PCR（multiple2022/11/27^52用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物2022/11/27^52用于检测特定基因序列的存在或缺失。2022/11/27^53乳头瘤病毒（ＨＰＶ）检验及分型

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性中仅次于乳腺癌。我国每年有宫颈癌新发病例１３.１５万，占世界宫颈癌新发病例总数的２８.２％。临床科学研究表明，ＨＰＶ持续感染是导致宫颈癌的直接原因。ＨＰＶ可分为高危型和低危型两种，不同的ＨＰＶ亚型在致癌性方面存在很大的差别。至今发现的ＨＰＶ病毒约有１２３种，至少有２０种高危型ＨＰＶ会构成子宫颈癌。所以提早诊断ＨＰＶ感染，对ＨＰＶ尤其是高危型ＨＰＶ进行检验和分型极为重要。

2022/11/27^53乳头瘤病毒（ＨＰＶ）检验及分型宫2022/11/27^54（四）重组PCR（recombinantPCR）将两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。该技术主要应用于DNA片段的任何位置引入点突变、插入、缺失以及两个不相邻片段的连接。其基本原理是将突变碱基、插入或缺失片段、或一种物质的几个基因片段的部分碱基设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。所得到的产物是一重组合的DNA。2022/11/27^54（四）重组PCR（recombin2022/11/27^55引物a引物c引物b引物d5'3'PCR混合，变性和复性延伸异源部分双链DNA形成5'5'5'5’5'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'5'5'5'5'5'5'PCR引物a引物d

再次PCR5'5'3'3'（四）重组PCR（recombinantPCR）2022/11/27^55引物a引物c引物b引物d5'3'2022/11/27^56（五）锚定PCR（anchoredPCR，APCR）用于扩增已知一端序列的目的DNA例如，T细胞受体和免疫球蛋白基因5'端具有高度可变性。2022/11/27^56（五）锚定PCR（anchored2022/11/27^57（六）不对称PCR（asymmetricPCR）其基本原理是：采用两条不同浓度的引物，即非限制引物（高浓度引物）与限制性引物（低浓度引物），二者之比为50～100:1。在PCR最初10-15个循环中，扩增产物主要是双链DNA（dsDNA）；第15个循环以后，限制性引物已被耗尽，非限制性引物介导的PCR就会产生大量的单链DNA（ssDNA）。尽管此时单链DNA仅以线性速率递增，但其浓度已能满足双脱氧链终止法测定DNA序列的要求。2022/11/27^57（六）不对称PCR（asymmet2022/11/27^58已知序列PCR用途：未知序列的研究限制酶切点（X）限制酶切点（X）限制酶X酶切连接未知序列（七）反向PCR（inversePCR）2022/11/27^58已知序列PCR用途：限制酶切点（X2022/11/27^59（八）定量PCR（QuantitivePolymeraseChainReaction，QPCR）以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。定量PCR定量的理论依据：理想的扩增结果：Y=X×2n

其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体中的原始模板数n为扩增次数；理论上PCR扩增效率为100%，PCR产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2的倍增长；实际应为：Y=X(1+E)n

，其中E代表扩增效率：E=参与复制的模板/总模板，通常E≤1，E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X在1～105拷贝、循环次数n≤30时，E相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；2022/11/27^59（八）定量PCR（Quantiti2022/11/27^601．PCR定量DNA

一个或两个拷贝的特定靶序列的细胞株即是标准的一个理想来源，也可使用含特定靶序列的质粒DNA作为对照，将待检样品与一系列稀释的标准对照一起扩增，检测PCR产物，即可推知靶序列的含量。2．PCR定量mRNA(1)mRNA相对定量－靶基因的扩增产物量与内源性对照的扩增产物量的比值

(2)竞争性PCR定量mRNA(3)cRNA标准曲线法定量mRNA2022/11/27^602022/11/27^61实时荧光定量PCR（RT-FQ-PCR）与普通PCR的区别

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析；无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测普通PCR实时荧光定量PCR利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析；无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析；无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时荧光定量PCR利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析；无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测普通PCR实时荧光定量PCR利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析；无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测与普通PCR的区别普通PCR实时荧光定量PCR利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析；无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测2022/11/27^61实时荧光定量PCR（RT-FQ-P2022/11/27^62如何对初始模板定量?荧光信号如何产生？RealtimePCR实时监测系统2022/11/27^62RealtimePCR实时监2022/11/27^63实时荧光定量PCR原理定量原理介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析2022/11/27^63实时荧光定量PCR原理定量原理介绍2022/11/27^64实时荧光定量PCR原理---------扩增曲线扩增曲线图：

横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件2022/11/27^64实时荧光定量PCR原理----2022/11/27^65实时荧光定量PCR原理-------荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：

前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99

真正的信号:荧光信号超过域值2022/11/27^65实时荧光定量PCR原理---2022/11/27^66实时荧光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定义：

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value2022/11/27^66实时荧光定量PCR原理---2022/11/27^67实时荧光定量PCR原理-------Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；

Ct值则极具重现性2022/11/27^67实时荧光定量PCR原理---2022/11/27^68荧光定量PCR原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率XCt=X0(1+Ex)Ct=NlogX0=-

log(1+Ex)*Ct+logNXCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数最后结论：LogX0与Ct呈线性关系，根据样品扩增的Ct值就可计算出样品中所含的模板量2022/11/27^68荧光定量PCR原理理想的PCR反应2022/11/27^69

标准曲线（使用外参照物的定量PCR）

将已知浓度的标准品梯度稀释进行RealtimePCR，就会按照起始DNA浓度由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。再由Ct值与起始模版的对数值之间存在的线性关系，就可制作标准曲线。未知浓度的样品与标品一样，也可得到Ct值，并将Ct值代入标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模版量。2022/11/27^69标准曲线（使用外参照物2022/11/27^70荧光信号如何产生？非特异性荧光标记：1、SYBRGreen特异性荧光标记：2、TaqMan3、MolecularBeacon2022/11/27^70荧光信号如何产生？非特异性荧光标记2022/11/27^71SYBRGreenISYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光（SYBRGreen1

结合到双链DNA的小沟部位）变性时，DNA双链分开，无荧光在延伸结束阶段采集荧光信号。SYBRGreen也能和非特异的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析2022/11/27^71SYBRGreenISY2022/11/27^72SYBR-GreenI5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmission双链荧光染料SYBR-GreenI荧光染料原理示意图2022/11/27^72SYBR-GreenI5’3’52022/11/27^73SYBR-GreenI5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission2022/11/27^73SYBR-GreenI5’3’52022/11/27^74Real-TimePCR，SYBRgreenCycle1Cycle3Cycle2MolecularProbe公司的一个专利产品，USPatent5,436,134

1993年7月12日申请2022/11/27^74Real-TimePCR，SYB2022/11/27^75荧光强度的变化是由于温度不断升高双链DNA解离，SGI游离Tm是熔解曲线的特征值：SYBRGreenI熔解曲线分析当双链DNA解链一半时，荧光信号强度急剧下降，此时的温度为溶解温度。Tm值与PCR产物序列有关，对某一PCR扩增产物其值是固定的。溶解曲线的一次曲线溶解曲线的负一次微分曲线2022/11/27^75荧光强度的变化是由于SYBRGr2022/11/27^76融解曲线的作用采用SYBRGreenI荧光嵌合法检测时，可以通过溶解曲线分析，确认PCR反应的特异性特异性产物非特异产物引物二聚体2022/11/27^76融解曲线的作用采用SYBRGre2022/11/27^77

优点对DNA模板没有选择性，适用于任何DNA使用方便，不必设计复杂探针灵敏度较高便宜

缺点易与非特异性双链结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高SYBRgreen的优缺点2022/11/27^77优点2022/11/27^78TaqMan技术TaqMan探针探针水解型杂交探针5′3′与目标序列互补5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针2022/11/27^78TaqMan技术TaqMan探针探2022/11/27^79TaqMan探针工作原理Taq酶：5′外切酶活性每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号2022/11/27^79TaqMan探针工作原理Taq酶：2022/11/27^80TaqMan应用范围鉴定PCR产物(定性）定量起始模板浓度单核苷酸多态性（SNP）检测2022/11/27^80TaqMan应用范围鉴定PCR2022/11/27^81

优点对目标序列的高特异性

--阴性结果确定引物设计相对简单重复性比较好

缺点只适合一个特定的目标价格较高TaqMan优缺点2022/11/27^81优点2022/11/27^82molecularbeacon技术检测靶基因的部分随着每次扩增产物的增加，其荧光强度也增加，因而它可以反映每次扩增末期扩增产物积累的量。分子信标2022/11/27^82molecularbeacon2022/11/27^83

荧光定量PCR的临床应用•遗传疾病的早期诊断•肿瘤的诊断•抗病毒药物疗效的观察、指导•病情评估和预后判断•新药验证•输血源的筛选•母婴传播的控制与观察2022/11/27^832022/11/27^84聚合酶链反应方法的标准化2022/11/27^84聚合酶链反应方法的标准化2022/11/27^85PCR技术的最大优点是具有极高的敏感性，其反应过程与以往其他任何一种检验诊断技术相比，都易受到各种自身和外部因素的影响。所以，制定一套适应当前基因诊断实验的基本要求并使PCR技术标准化的操作程序已迫在眉睫。2022/11/27^85PCR技术的最大优点是具有极高的敏2022/11/27^86一.PCR实验诊断的基本原则二.PCR操作程序标准化（一）上岗人员培训制度（二）标准化PCR诊断实验室（三）PCR标准化操作程序

1．试剂配制、分装及保存

2．标本的采集与处理

3．基因扩增及其实验条件的选择

4．扩增产物检测

5．PCR结果的判读（四）污染的预防及污染源的标准化处理2022/11/27^86一.PCR实验诊断的基本原则2022/11/27^87阈值高度：是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。

2022/11/27^87阈值高度：是基线范围内荧光信号强度88聚合酶链式反应技术及应用分子生物学

1聚合酶链式反应技术及应用分子生物学2022/11/27^89聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）技术是生命科学界的重大发明，是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。通过体外（试管内）扩增，可以将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，从而达到极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞、甚至一个分子的水平。

2022/11/27^2聚合酶链式反应（polymerase2022/11/27^90PCR发展简史PCR的发明人，一般公认是凯利﹒穆利斯（K.Mullis,在Cetus公司工作期间，发明了PCR。1983年4月穆利斯萌发了PCR的构想;1985关于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上发表;1987当年7月Cetus公司在美国获得PCR基本技术专利批准,并于当年11月推出了第一个PCR试剂产品及第一台热循环仪；1989Science报道了耐热性DNA多聚酶Taq酶的发现,预示着分子时代的到来；1990Cetus科学家D.Gelfand和S.Stoffel发明了纯化TaqDNA多聚酶的方法；1991TaqMan技术发表；九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开；1998年实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测。2022/11/27^3PCR发展简史PCR的发明人，一般公2022/11/27^91引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2022/11/27^4引物引物Mullis的构思DNA聚合2022/11/27^92KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。2022/11/27^5KaryB.Mullis2022/11/27^93PCR的应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他……2022/11/27^6PCR的应用研究2022/11/27^94PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制，在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。2.PCR基本原理2022/11/27^7PCR技术的基本原理是DNA的半保留2022/11/27^95模板DNA94℃变性55℃退火72℃引物延伸第二次循环模板变性退火延伸图6-1PCR原理示意图2022/11/27^8模板DNA94℃变性55℃退火72℃2022/11/27^961234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍2022/11/27^91234522557294时间（mi2022/11/27^97PCR产物生成曲线扩增产物循环次数指数扩增期扩增平台期2022/11/27^10PCR产物生成曲线扩增产物循环次数2022/11/27^98PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个PFU(空斑形成单位)细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA2022/11/27^11PCR的特点灵敏度高2022/11/27^99反应体系：（五要素）

模板（template）引物(primer)人工合成的两段寡核苷酸序列，决定RCP的特异性。3.PCR反应体系和反应条件DNA

RNA：总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因组DNA质粒DNA2022/11/27^12反应体系：（五要素）3.PCR2022/11/27^100PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率，特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子；引发效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。2022/11/27^13PCR反应成功扩增的一个关键条件在2022/11/27^101引物的长度

典型的引物为18-24个核苷酸，在一定范围内引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性；引物长度的上限主要与反应效率有关，所以一般又不能太长，因为过长会导致其延伸温度大于72℃，即Taq酶的最适温度。引物设计基本原则2022/11/27^14引物的长度典型的引2022/11/27^102PCR产物长度

一般来说，PCR产物长度对扩增效率有影响。扩增片段长度在普通PCR以200～500bp为宜；实时荧光PCR则为50～150bp。2022/11/27^15PCR产物长度一般来说，P2022/11/27^103引物的均衡性和GC含量

引物中碱基组成应尽可能随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶碱基堆积现象。有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高(非特异性扩增)或过低（特异性降低）都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。2022/11/27^16引物的均衡性和GC含量2022/11/27^104引物溶解温度（Tm值）

引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度.

如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G)2022/11/27^17引物溶解温度（Tm值）2022/11/27^105引物自身

引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败;引物3’端的几个碱基与模板DNA需严格配对，并最好为低稳定性结构。

5’端序列对PCR影响不如3’端大，常用来引进修饰位点或标记物。

2022/11/27^18引物自身2022/11/27^106使用PrimerPremier5.0等软件设计PCR引物进行引物设计时，点击

按钮，界面如下：

2022/11/27^19使用PrimerPremier2022/11/27^1072022/11/27^202022/11/27^1082022/11/27^212022/11/27^109-

DNA聚合酶(DNApolymerase)

PCR发明初期，不耐热的Klenow片段耐热的TaqDNA聚合酶－良好的热稳定性：92.5、95、97.5℃时，半衰期分别为130、40、5～6min；－良好的延伸效率：在75～80℃时延伸效率最高，每个酶蛋白分子的延伸速度可达150个核苷酸/s；－无3′－5′外切酶活性，缺乏校正功能；2022/11/27^22-DNA聚合酶(DNApol2022/11/27^110dNTP:包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP-PCRbuffer:一般组成：50mMKCl,10-50mM,Tris-Cl(室温PH8.3)，1.5mMMgCl2

KCl：促进引物退火，高浓度KCl抑制TaqDNA聚合酶活性；Tris-Cl：调节pH值，使反应体系偏碱性；MgCl2

：调节TaqDNA聚合酶活性、影响引物退火，PCR产物的特异性等2022/11/27^23dNTP:包括dATP、dTTP2022/11/27^1111）PCR反应成分（1）模板一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件2022/11/27^241）PCR反应成分（1）模板PC2022/11/27^112（2）引物浓度

0.1-0.5mol/L

浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）TaqDNA聚合酶（thermus

aquaticus，水生栖热菌)

0.5-5U/100l

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。2022/11/27^25（2）引物浓度2022/11/27^113（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度

四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量

dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。2022/11/27^26（4）dNTP2022/11/27^114（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。对于大多数的PCR引物来说，Mg2+浓度为1.5mmol/L是适宜的，如果扩增效果不好，则调整镁离子的浓度可能会有所帮助。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2022/11/27^27（5）Mg2+Mg2+是DNA2022/11/27^1152）循环参数变性使双链DNA解链为单链

94℃,30s～1min。(2)退火温度由引物长度和GC含量决定，一般比引物Tm值约低5℃。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性，但特异性低。热启动：在第一轮扩增前必须使模版DNA完全变性，一般94℃，变性5分钟2022/11/27^282）循环参数热启动：在第一轮扩增前2022/11/27^116（3）延伸

70-75℃,一般为72℃

延伸时间由扩增片段长度决定。（1~3min)（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-30次次数过多：产生“平台效应”错误掺入率增加2022/11/27^29（3）延伸2022/11/27^1174.PCR扩增产物的检测方法凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）单链构型多态性分析法（PCR-SSCP）核酸探针杂交法PCR产物测序荧光PCR2022/11/27^304.PCR扩增产物的检测方法凝胶电2022/11/27^118(一)琼脂糖凝胶电泳法基本原理：DNA在电泳缓冲液中带负电荷，将PCR产物点样于负极端的加样孔，在电场力的作用下DNA涌向正极，并且由于电荷效应和分子筛效应，不同DNA分子量及构型的DNA涌动率不同；在电泳过程中，凝胶中的EB将嵌入DNA分子中，在紫外线照射下，EB-DNA复合物发出橙红色荧光，荧光强度与DNA含量成正比；不同浓度的凝胶分辨DNA的有效范围不同。操作简单，但存在EB污染。2022/11/27^31(一)琼脂糖凝胶电泳法基本原理：操2022/11/27^119聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途特点：分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；回收的DNA纯度高；采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。用途：PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。2022/11/27^32聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途特点：2022/11/27^120(二)PCR-限制性片段长度多态性分析法（polymerasechainreactionbasedonrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸内切酶可识别特异DNA序列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息用途：传染病病原体基因分型人类基因的变异性研究。是诊断遗传病和传染病病原体基因分型的常用方法2022/11/27^33(二)PCR-限制性片段长度多态性2022/11/27^121PCR-RFLP法：

限制性内切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突变限制性内切酶2022/11/27^34PCR-RFLP法：限制性内2022/11/27^122(三)单链构型多态性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism，简称PCR-SSCP）本法就是将PCR产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA（ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。2022/11/27^35(三)单链构型多态性分析法（PC2022/11/27^123PCR-SSCP过程

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP掺入

PCR扩增产物

↓

变性↓

单链DNA↓

中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

↓12345

自显影↓1.为正常结果分析2、4、5纯合患者

3.为杂合子

.

解链构像DAN原理过程2022/11/27^36PCR-SSCP过程2022/11/27^124优点及作用：方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要。该方法和其他方法相比有较高的检测率。首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。不足之处：只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序；电泳条件要求较严格；另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。2022/11/27^37优点及作用：方法简便、快速、灵敏，2022/11/27^125(四)核酸探针杂交法(1)点杂交（dotblot）(2)反向点杂交（reversedotblot）(3)微孔板夹心杂交（microplatehybridization）(4)荧光探针杂交(5)Southern印迹杂交（Southernblot）2022/11/27^38(四)核酸探针杂交法2022/11/27^126样品正对照负对照标准分子量

污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经