蛋白质工程制药

关于蛋白质工程制药第1页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六2第一节蛋白质和多肽类药物的分类一、多肽与蛋白质肽：2-50蛋白质：>50一般来说，大于20个氨基酸的多肽与蛋白质没有明显界限。第2页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六3二、多肽类药物的分类与作用激素类加压素、催产素、促皮质素及衍生物下丘脑-垂体肽激素消化道激素其他激素和活性肽细胞生长调节因子含有多肽成分的其他生化药物第3页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六4三、蛋白质类药物的分类与作用激素、细胞生长调节因子、血浆蛋白质、黏蛋白、胶原蛋白、碱性蛋白质、蛋白酶抑制剂、植物凝集素第4页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六5四、多肽和蛋白质类药物的性质酸碱性解离等电点pI离子结合蛋白质形成的盐在组织中广泛存在；小离子与蛋白质特异性结合在组织和体液中起重要作用。第5页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六6胶体性质——电荷和水化膜应用：除杂变性三维结构破坏第6页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六7五、多肽和蛋白质类药物的制备提取分离纯化化学合成法蛋白质工程法第7页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六8提取分离纯化原材料选择预处理多肽和蛋白质药物提取纯化来源丰富、目的物含量高、成本低破碎、防止变性水溶液提取、有机溶剂提取（溶解度、分子大小形状、电性等）第8页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六9蛋白质工程法更换活性蛋白质的关键氨基酸残基调整蛋白质分子的某些肽段、结构域或寡糖链，生成合适的糖型，产生新的功能功能互补的两种基因工程药物在基因水平上融合第9页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六10第二节、蛋白质分子设计与合成第10页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六11

蛋白质工程与蛋白质设计的术语是20世纪80年代初产生的。通过序列修饰改造改变蛋白质的性质并有应用价值的第一个报道引起了人们广泛的关注，纷纷成立了蛋白质工程及设计的专门机构。尽管通过蛋白质工程研究已取得许多激动人心的成果，但是通过蛋白质设计产生一个结构确定、具有新的所希望性质的稳定的新蛋白质并不容易。第11页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六12公开性蛋白质研究组织

研究組織目標/特色ProteinStructureInitiative(美國NIH)十年內定出一萬個蛋白質的立體結構StructuralDiversityPilotProject(美國)Rockefeller大學主導之學術合作NMRParkProject(日本)利用NMR來決定老鼠蛋白質之結構ProteinStructureFactory(德國)醫學上重要蛋白質結構之高速分析StructuralBiologyIndustrialPlatform(歐洲)包含幾個主要製藥公司等16家公司所組成的聯盟第12页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六13蛋白质设计的目的和类型

为蛋白质工程提供指导性信息；探索蛋白质的折叠机理。蛋白质设计分为基于天然蛋白质结构的分子设计及全新蛋白质设计（蛋白质从头设计）。第13页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六14蛋白质设计目前存在的问题设计的蛋白质与天然蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明显的功能优越性。所有设计的蛋白质有正确的形貌、显著的二级结构及合理的热力学稳定性，但一般说来它们的三级结构的确定性较差。第14页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六15

从图2-1(a)看出，天然蛋白质有确定主链结构及侧链构象。图2-1(b)所示的设计蛋白质的结构是一组低能构象的集合，缺乏结构独特性。第15页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六16蛋白质设计是一门新兴的研究领域，其本身在不断地发展，其内容也在不断地更新。蛋白质设计及结构与功能关系研究的必要性。蛋白质设计是多学科的交叉领域。蛋白质设计在许多方面取得的显著进展。第16页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六17基于天然蛋白质结构的分子设计

一、概述蛋白质结构与功能的关系的认识对蛋白质设计是至关重要的，蛋白质的结构涉及一级结构(序列)及三维结构。即使蛋白质的三维结构是已知的，选择一个合适的突变体仍是困难的，这说明蛋白质设计任务的艰巨性，它涉及多种学科的配合，如计算机模拟专家、X射线晶体学家、蛋白质化学家、生物技术专家等的合作与配合。第17页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六18计算机模拟

基因构建突变蛋白质产品功能分析蛋白质设计循环第18页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六19蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面在蛋白质设计开始之前，要对所要求的活性进行筛选。测定它们的序列、三维结构、稳定性、催化活性等。第19页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六20专一性突变产物是蛋白质设计成败的关键。一些新技术，如PCR及自动化技术的发展使各种类型的基因工程变得快速、容易。计算机模拟技术在蛋白质设计循环中占有重要位置。建立蛋白质三维结构模型，确立突变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的结构与功能对蛋白质工程是至关重要的。在明确突变位点或蛋白质序列应改变的区域后，可以进行定位突变，但要得到具有预期结构与功能的蛋白质是不容易的，可能需要经过几轮的循环。第20页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六21第21页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六22设计目标及解决办法蛋白质结构与功能的关系对于蛋白质工程及蛋白质分子设计都是至关重要的。如果我们想改变蛋白质的性质，必须改变蛋白质的序列。Hartley等于1986年完成了一个我们所要的有关蛋白质重要性质设计目标及解决办法表，该表至今仍有参考价值。第22页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六23设计目标解决办法热稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性提高酶学性质引入二硫桥增加内氢键数目改善内疏水堆积增加表面盐桥把Cys转换为Ala或Ser把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu把Trp转换为Phe或Tyr把Cys转换为Ala或Ser把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu替代表面羧基替换表面荷电基团His、Cys以及Tyr的置换内离子对的置换专一性的改变增加逆转数(turnovernumber)改变酸碱度蛋白质设计的目标及解决办法第23页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六24蛋白质突变体的设计涉及如下3个步骤。（1）从天然蛋白质的三维结构出发(实验测定或预测)，利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的氨基酸。这是非常关键的步骤，一般应注意如下问题。

a．应确定对蛋白质折叠敏感的区域，这些区域包括带有特殊扭角的氨基酸、盐桥、密堆积区等。

b．应确定对功能非常重要的位置，这些可以从结构与功能关系、生物化学或蛋白质工程实验及结构上的考虑。第24页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六25

c．应该考察剩余位置对所希望改变的影响。

d．当进行互换或插入删除残基时应考虑它们对结构特征的影响，如疏水堆积、侧链取向、氢键、盐桥等。同时也要考虑它们对蛋白质功能的影响。互换或插入/删除区域一般都在外环。有如下一些假设：氨基酸侧链的改变不会影响该主链折叠的改变，插入/删除某些部分不会影响表面区域，侧链交换遵守蛋白质结构保守原则。（2）利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构。（3）预测的结构与原始的蛋白质结构比较，利用蛋白质结构-功能或结构-稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质。在上述设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新的蛋白质。第25页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六26计算机蛋白质设计只是有效实验设计的一种方法。它不能替代实验，正像蛋白质结构预测不能替代蛋白质结构测定一样。如果一个科学家设计一种具有新的催化性质的酶，他必须了解催化过程及机理；了解蛋白质的结构化学、生物化学方面的知识。因此蛋白质设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧密结合。第26页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六27内核假设所谓内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域。在大多数情况，内核由氢键连接的二级结构单元组成。假定蛋白质独特的折叠形式主要由蛋白质内核中残基的相互作用所决定。

二、蛋白质设计原理

第27页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六28内部密堆积，并且没有重叠。

由两个因素造成的。分子是从内部排出的，这是总疏水效应的一部分；由原子间的伦敦色散力所引起的，是由于短吸引力的优化。第28页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六29氢键都是最大满足的蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白质键所替代。随着溶剂键的断裂所带来的能量损失是由折叠状态的重组以及可能释放一个结合的水分子而引起的熵的增益所弥补。第29页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六30疏水及亲水基团需要合理地分布在溶剂可及表面及不可及表面。在金属蛋白中，配位残基的替换要满足金属配位几何。对于金属蛋白，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的。最优的氨基酸侧链几何排列结构及功能的专一性。第30页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六31三、蛋白质设计中的结构－功能关系研究蛋白质结构－功能关系的重要性

蛋白质的序列、三维结构，热力学及功能性质之间的关系是目前广泛关注的热点。它对于蛋白质工程及蛋白质设计都是非常重要的。对蛋白质结构与功能的认识过程始于蛋白质中重要功能残基及蛋白质与其他分子相互作用的确定。第31页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六32定位突变在蛋白质结构与功能关系研究中的作用

通过定位突变替换单独的氨基酸残基是分析功能残基的有力工具。选择突变残基，最重要的信息来自结构特征。因此如果蛋白质的立体结构是未知的，则突变功能残基的研究带有不确定性。第32页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六33定位突变种类插入一个或多个氨基酸残基；删除一个或多个氨基酸残基；替换或取代一个或多个氨基酸残基。最大量的定位突变是在体外利用重组DNA技术或PCR方法。第33页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六34突变蛋白质结构的评估溶解性热力学分析Ｘ射线晶体学及ＮＭＲ谱园二色谱方法单克隆抗体探测构象变化第34页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六35热力学分析可以用于测量突变蛋白质的热稳定性及化学变化自由能，并可作为构象整体性的检测。

X射线晶体学及NMR谱可以直接提供突变蛋白的高分辨率结构及评估结构整体性。圆二色谱方法是可用于分析突变体结构的另一生物物理方法。第35页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六36蛋白质中功能残基的鉴定根据已知结构信息确定功能残基突变法鉴定功能残基利用蛋白质同源性鉴定功能残基第36页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六37不同动物胰岛素在A链中的差异

羧基端第37页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六38四、天然蛋白质的剪裁

什么是分子剪裁：分子剪裁是指在对天然蛋白质的改造中替换1个肽段或一个结构域。将小鼠单克隆抗体分子重链的互补决定簇用基因操作方法插到人的抗体分子的相应部位上，使得小鼠单抗分子所具有的抗原结合专一性转移到人的抗体分子上。这项实验有重要的医学价值。第38页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六39结构域由α螺旋、β折叠等二级结构单位按一定的拓扑学规则构成的三维结构实体。构域是蛋白质分子中一种基本的结构单位，结构域拼接是通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白的性质。

五、结构域的拼接第39页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六40第40页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六41六、结构与功能的容忍度蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度，即结构与功能关系有一定的稳健度。第41页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六42Fersht等替换了Barnase的所有内核残基。结果表明23％的突变体保留了酶的活性。Mathews及其合作者在溶菌酶内核中替换多至10个残基。实验证明多重取代的蛋白仍具有活性以及协同折叠。第42页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六43全新蛋白质设计一、特征全新蛋白质设计是另一类蛋白质工程，合成具有特异结构与功能的新蛋白质。根据所希望的结构及功能设计蛋白质或多肽的氨基酸序列。第43页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六44

全新蛋白质设计是根据所希望的结构及功能设计序列，称反折叠研究。蛋白质的功能是直接与它的三维结构相关的，通过序列的改变来操纵结构提供功能的多样性。基于天然蛋白质结构改造的蛋白质工程可以优化蛋白质的活性，改善它们的药效动力学性质。而全新蛋白设计是另一类蛋白质工程，它合成具有新奇的结构与功能的新蛋白质。第44页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六45二、蛋白质的全新设计内容蛋白质结构的从头设计蛋白质功能的从头设计第45页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六46三、蛋白质结构的从头设计１．二级结构模块单元的自组装２．配体诱导组装３．通过共价交叉连接实现肽的自组装４．在合成模板上肽的组装５．线性多肽折叠为球状结构６．基于组合库的全新蛋白质设计第46页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六47设计一个新奇的蛋白质结构的中心问题是设计一个具有稳定及独特的三维结构的序列。要达到这个目标需要克服的基本障碍是线性聚合链的构象熵。例如，如果在具有100个残基的蛋白质中每个残基采取10个可能构象中的一个构象，则这条链折叠成为确定的三维构象所消耗的熵是568.48kJ／mol。这个数字代表不合适的自由能的真实的量。因此要实现正确的折叠必须借助于许多合适的相互作用，要使一个序列能折叠为确定的三维结构，设计的相互作用能必须超过构象熵。第47页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六48可以采用不同的策略达到这个目标。最主要是使相互作用的强度与数目达到最大。另一个策略是通过共价交叉连接减小折叠的构象熵。根据第一原理设计一个蛋白质，我们必须依赖于分析已知结构的天然蛋白质中的二级结构单元，例如螺旋、β折叠片、(环)以及转折，得到一些结构知识，这些知识涉及氨基酸形成二级结构的倾向性等。十多年来，科学家对螺旋已有很好的认识，近几年的重点在于二级结构在三维空间形成的独特的构象通过长程相互作用可控形成超二级结构。我们可以有把握地设计并合成螺旋束，β折叠片以及ββα模块，它们的形成规律比较清楚，成功的概率也比较高。蛋白质中不同层次的结构组织见图2-6。第48页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六49第49页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六50分析己知结构的蛋白质，可以认为复杂的三级折叠和四级结合可以分解为有数的二级结构单元，例如螺旋、串、转角，它们通过LOOP连接为三级结构。特殊折叠的稳定性是由一定距离残基间键相互作用决定的。全新蛋白质设计要求很好地认识蛋白质结构及稳定性的规律。在了解残基形成二级结构单元的倾向性后，要安排残基的最大的疏水相互作用形成一个紧密的疏水内核。离子相互作用及氢键可以进一步用于稳定蛋白质的结构。另外一种途径是根据主链的构象限制设计二级结构。第50页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六51

1．二级结构模块单元的自组装设计新的蛋白质结构的最简单、最直接的策略是合成单一二级结构单元(α螺旋或折叠股)作为多肽链的片段的模块途径，然后复制这些二级结构片段并把它们连接为整个蛋白质结构。通常，这些二级结构是两亲性的。疏水表面埋藏在内核形成紧密的蛋白质结构中，如图2-7所示。第51页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六52

2．配体诱导组装全新蛋白质设计的第二个策略是使用一个配体(典型的是一个金属离子)诱导模块蛋白片段的组装，如图2-10所示。一个配位结合位点设计在结构中几个相互作用片段的界面处。如果这个位点对配体有很高的亲和力，则结合配体的合适的自由能将充分克服熵消耗并驱动肽自组装。第52页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六533．通过共价交叉连接实现肽的自组装设计全新蛋白的主要障碍是肽链的构象熵。当几个没有连接的肽链进行自组装时，熵势垒是比较难以克服的。通过共价交叉连接可以减少构象熵。因此共价连接他们的预组织肽是直接形成所希望结构的有力途径，如图2-13所示。第53页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六54

4．在合成模板上肽的组装

Mutter及其合作者发展了一种模板组装合成蛋白(TASPs)方法。他们不是使用天然蛋白中的turn和loops连接二级结构单元，而是使用图2-16中所显示的人工模板。同天然线性蛋白质不同。螺旋和折叠股在一个特殊折叠过程有一个正确的相对取向。TASP分子的螺旋和股通过模板结构导向形成所希望的构象。第54页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六55

5．线性多肽折叠为球状结构

不用模板或交叉连接而通过线性多肽折叠形成球形的确定的三维结构是全新蛋白质设计追求的目标之一。把一个线性肽折叠形成独特的三维结构的主要障碍是构象熵，这需要精心设计一系列的相互作用才能稳定结构。这方而工作已取得重大进展。第55页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六56

6．基于组合库的全新蛋白质设计

蛋白质组学是目前备受关注的新领域，它包括天然蛋白质的多样性、相互作用、结构以及功能。它回答的问题是“什么是天然存在的”。组合库方法要回答的问题是“什么是可能的”。要问答这个问题是要构筑大的全新蛋白质库。比较库中的全新蛋白质与自然进化选择的蛋白质，可以得到很多有用的信息。第56页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六57

所有可能的氨基酸序列是一个天文数字，例如一个含有100个残基的序列可能有20100种。但是实际能形成独特三维结构的序列仅占序列空间的很小部分。

组合库的构筑既要顾及序列的多样性又要利用合理设计大大减少序列的数目。

第57页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六58组合库设计的一个核心问题是埋藏疏水部分。一个常用的方法是基于极性（P）和非极性(N)氨基酸的“二元模式”。“二元模式”一方面要有利于形成二级结构，另一方面又要埋藏疏水残基。二元模式可用于二级结构两亲片段，一面完全是极性残基，另一面完全是非极性残基。第58页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六59组合库的设计中要考虑优化疏水核，通过筛选发现最优的堆积相互作用。主要使用两种筛选方法：第一种是使用一维1H-NMR谱；第二种方法是使用电喷雾质谱(ES-MS)观察H-D交换动力学。除了考虑疏水核堆积外还要考虑优化二级结构单元间的界面。近年来发展了一些计算机辅助设计方法，在开始实验之前先进行计算机筛选。一般分为两步，第一步建立侧链的旋转构象库(rotemer)；第二次把Rotomer库作为输入，计算低能序列组合的可能性。第59页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六60三、蛋白质功能的全新设计蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的结构又具有有趣和有用的功能。功能设计主要涉及键合及催化。为达到这些目的可以采用两条不同的途径：反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功能；从头设计功能蛋白质。第60页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六61计算蛋白质设计蛋白质设计是一个理论与实验之间的循环。这个循环已经在蛋白质的合理设计中得到了许多重要进展。计算蛋白质设计包括能量表达、能量优化、侧链构象的离散化、残基分类(内核、表面、边界)、功能位点设计、专一性、稳定性及序列空间的稳健性预测等方面内容。第61页，共81页，2022年，5月20日，4点43分，星期六62一、抗病毒药β-干扰素稳定性的改进-SH17形成二聚体失去活性-OH17氨基酸取代×二聚体二硫键第三节、蛋白质工程在制药中的应用第62页，共81