蛋白质分子基础蛋白质制备

关于蛋白质分子基础蛋白质制备第1页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质的电泳第2页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质的电泳分离电泳分离的原理:

蛋白质是两性电解质,在一定的pH下,可以解离为带电荷的离子。在电场中可以电泳移动。电泳迁移率：带电颗粒在溶液中迁移速度的快慢，用电泳迁移率(M)表示：

M为迁移率；dL为颗粒移动的距离；L为通电的时间。E为两个电极之间的电势差。M=EtdL第3页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六第4页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六影响蛋白质电泳迁移率的因素蛋白质分子的性质。分子的电荷、大小和形状。电场与电流和电压成正比。缓冲液和离子强度缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。支持介质纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。第5页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六第6页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六影响蛋白质电泳迁移率的因素蛋白质分子的性质。分子的电荷、大小和形状。电场与电流和电压成正比。缓冲液和离子强度缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。支持介质纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。第7页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六第8页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六影响蛋白质电泳迁移率的因素蛋白质分子的性质。分子的电荷、大小和形状。电场与电流和电压成正比。缓冲液和离子强度缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。支持介质纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。第9页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六缓冲液和离子强度缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。离子强度增强，缓冲液所载的分电流随之增加，样品所载分电流降低，样品电泳速度变慢离子强度太低，电导率太小，样品移动缓慢第10页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六影响蛋白质电泳迁移率的因素蛋白质分子的性质。分子的电荷、大小和形状。电场与电流和电压成正比。缓冲液和离子强度缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。支持介质纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。第11页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六电泳的类型自由界面电泳使用支持物的区带电泳。

区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。第12页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六聚丙烯凝胶电泳SDS凝胶等电聚焦第13页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六SDS电泳在蛋白质中加入摩尔比为1.4：1(SDS:蛋白质)的SDS(十二烷基硫酸钠)。使所有蛋白质都带上负电。SDS是阴离子去污剂，能与蛋白质的疏水部分结合，并且把大部分蛋白质拆成组成他的亚基形式。在上样缓冲液中加入巯基乙醇，可以使二硫键还原为巯基。使不同的蛋白质分子的短轴一致，长轴与蛋白质的分子量成正比。SDS-PAG中，蛋白质电泳的速度不再取决于蛋白质的电荷与形状，只与蛋白质的分子量有关。第14页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六第15页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六第16页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六SDS电泳当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logM=K-bX

M为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。第17页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六SDS电泳绘制标准曲线：

按下式计算相对迁移率：

以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。第18页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六SDS电泳PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类连续系统中,缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中,由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。第19页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六不连续SDS各部分凝胶配制电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。第20页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六第21页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六第22页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六第23页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六Figure6.2.4SDSresultsoffractionS1(SRA)兔磷酸化酶BMW=97,400牛血清白蛋白

MW=66,200兔肌动蛋白

MW=43,000牛碳酸酐酶

MW=31,000胰蛋白酶抑制剂

MW=20,100鸡蛋清溶菌酶

MW=14,400第24页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六SDS应注意的几个问题制备凝胶时，TEMED要加胶之前再加。电泳之前蛋白质要溶解在含1%的SDS和1%的巯基乙醇的磷酸缓冲液(0.01mol/L,pH7.2),1000C加热2~5分钟。如凝胶中含有杂质，可以在加入样品前先预电泳0.5~1小时。SDS与蛋白质分子结合后，蛋白质分子的构象发生变化，解离为亚单位，电泳结果显示的只是亚单位的大小，同时蛋白质也会失去原来的活性。已发现有些蛋白质不能用SDS测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。第25页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六等电聚焦电泳

蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。在电场存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白分子将向正极移动，在某一pH时，蛋白分子在电场中不再移动，此时的pH值即为该蛋白质的等电点。等电聚焦(IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。第26页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六等电聚焦电泳根据要分离的蛋白质的pI的不同，订购不同pH梯度的凝胶，可以对蛋白质样品进行分离。

如3.5~9.5、2.5~6.0、5.0~8.5、7.5~10等。凝胶的pH值范围越窄，分辨力越高。可分离等电点相差0.01个pH单位的蛋白质，最高可以分辨0.0025个pH单位的蛋白质。等电凝胶可以抵消扩散作用，蛋白质可以富集在很窄的区带上。适用于少量蛋白质样品的分析鉴定，不适用于大量制备。要求用无盐的溶液，而蛋白质在无盐溶液中容易沉淀；在等电点发生沉淀和变性的蛋白质也不适合用次方法分离。第27页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六第28页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六第29页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六pI的测定可以用染色法观察蛋白质，然后用表面电极直接测量pH值。或将凝胶切成小块，加蒸馏水，再捣碎凝胶块并且测量pH。第30页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六双向电泳双向电泳:由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。1975年，O’Farrell首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分离出1100多个蛋白点。后来此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随着蛋白质组学的发展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。第31页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六第32页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六第33页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六PAGE电泳分离的大分子的检测考马斯亮蓝染色法

可检出0.3~1ug的蛋白质。银染色法银离子与蛋白质以盐或配价络盐的形式结合，用甲醛将银离子还原为可见的银颗粒。可检测ng水平的蛋白质。荧光染色技术荧光合成物质与PAGE上的蛋白质发生反应，发出强烈的荧光，可检测到PAGE中的蛋白质。第34页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六免疫印迹法蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。具体操作为经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。第35页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六免疫印迹法抗原包被的实验膜条

特异性人抗体标记的二抗标记第36页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六免疫印迹法第37页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质的结晶第38页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质的结晶可以作为蛋白质提纯的方法之一。蛋白质纯度达到一定值时可以结晶。通过反复重结晶可以除去其中的杂质，使蛋白质得到更大程度的纯化。蛋白质结晶体是比较稳定的结构，所以结晶可以作为一个稳定的储存的方法。在蛋白质结晶之后，可以提供作X射线衍射分析用的材料，来分析蛋白质的结构等数据。第39页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质结晶的原理蛋白质溶液在合适的过饱和状态，溶质分子通过扩散、旋转、碰撞等运动形式，可以形成晶核。溶质分子以相互碰撞的作用方式有序而反复地堆砌在晶核上，直到晶核成长到晶体，最后从溶液中析出。第40页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六晶体结晶的条件蛋白质纯度越高，结晶越容易，至少要在50%以上。蛋白质浓度。浓度越高，结晶机会越大。但过大会因杂质存在而导致晶形不好。一般结晶的蛋白质浓度在10~50mg/mL。温度。蛋白质结晶温度在0~400C。一般在40C冷室或250C温箱中进行。pH。一般在蛋白质的等电点的pH附近结晶。金属离子和离子强度。一些二价离子可以引起或有利于蛋白质的结晶过程。沉淀剂。沉淀剂(如盐类和各种有机溶剂)可改变蛋白质的溶解度。理想的沉淀剂有：聚乙二醇(PEG)和2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)。第41页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质结晶方法盐析法在蛋白质溶液中加入盐，使蛋白质溶解度降低，之后以结晶形式从溶液中析出。有机溶剂法有机溶剂可以使蛋白质介电常数降低，导致蛋白质结晶析出。等电点结晶。蛋白质在等电点时溶解度最小，可以形成结晶。脱盐结晶。一些球蛋白溶于盐而几乎不溶于水，可将溶于盐溶液的蛋白质结晶而出，然后透析除盐。温差除盐。适用于一些对温度敏感的蛋白质，不同温度溶解度变化大。可运用此法。金属离子。在某些蛋白质溶液中加入金属离子，可以促进晶体的形成。第42页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质提纯过程中的定量第43页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质的定量(1)定氮法测量蛋白质含量蛋白质含量（克%）

=每克生物样品中含氮的克数

6.25第44页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质的定量(2)双缩脲法第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。

双缩脲试剂的成分是质量浓度为0.1g/mL的氢氧化钠溶液和质量浓度为0.01g/mL的硫酸铜溶液。在碱性溶液(NaOH)中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键,因此,含两个或亮个以上的肽键化合物尤其是蛋白质都可与双缩脲试剂发生颜色反应。第45页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六双缩脲反应产物可在540nm处进行比色测定可以测定蛋白质的含量，可测定范围为0.1~1.0mg/mL。

！此反应为肽及蛋白质特有的，而为氨基酸所没有的一个颜色反应。第46页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质的定量(3)福林-酚试剂法：

在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，在600nm下测光吸收。可根据测得的标准曲线计算出蛋白质的含量。灵敏度较高，可达25g-250g/ml。灵敏度比280nm处的紫外吸收法灵敏10倍，比双缩脲法灵敏100倍。

第47页，共55页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质的定量(4)紫外吸收法A.280nm光吸收法

根据得到的280nm的光吸收值与蛋白质的浓度正比，可以测量蛋白质溶液中的浓度。B.280nm和260nm的吸收差法用280nm下的紫外吸收减去260nm下的紫外吸收，可以排除260nm下由于核酸吸光带来的干扰。蛋白质浓度(mg/mL)