第三部分细胞培养与细胞融合

主要内容植物细胞分离与培养动物细胞分离与培养细胞融合及其应用1第一页，共七十二页。第一部分植物细胞分离与培养1、物理方法2、化学方法3、酶法一、植物细胞的分离2第二页，共七十二页。1、物理方法将疏松的愈伤组织放入液体培养基中，经摇床不断振动，使细胞分散。若向细胞悬浮液中吹入脉冲压缩气体，细胞分散的更好。2、化学方法是在细胞悬浮培养中加入草酸盐（能结合细胞间质中果胶钙的钙离子）、秋水仙素（0.1mmol/L）或2,4-D或水解乳蛋白（对细胞分散有一定的作用）。3、酶法利用果胶酶和纤维素酶使细胞分离。3第三页，共七十二页。单细胞培养：平板培养、看护培养、液体浅层培养、微室培养（微滴培养）等据培养基形态：分为固体培养与液体培养（悬浮培养）细胞固定化培养：

二、植物细胞的培养4第四页，共七十二页。此法适用于难于培养的植物种类

优点：简便、成功率高缺点：不能在显微镜下直接观察5第五页，共七十二页。优点：可以连续观察细胞的分化和发育；缺点：通气性差，水分难保持，pH易变动。

6第六页，共七十二页。一）、悬浮培养(suspensionculture)

定义：是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。悬浮培养的过程7第七页，共七十二页。一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；三是振荡培养可以适当改善气体的交换；1、悬浮培养的优点：8第八页，共七十二页。悬浮培养物分散性良好，细胞团较小；均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同；细胞生长迅速（2～3天加倍）。2、一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足怎样的条件？9第九页，共七十二页。3、悬浮细胞培养方法

分披培养法

半连续培养法

连续培养法10第十页，共七十二页。起始愈伤组织的质量；接种细胞密度；培养条件：方式、温度；继代周期。4、影响悬浮细胞生长的因素有哪些？11第十一页，共七十二页。定义：即把细胞固定在一种惰性基质上，细胞不能运动而培养液可在细胞间流动以供应营养。按照其支持物不同可以分为两大类：

A、包埋式固定化培养系统：琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺；B、附着式固定化培养系统：尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维。二）、细胞固定化培养

固定化细胞培养特点（见P112)12第十二页，共七十二页。流化床生物反应器：细胞包裹在胶粒、泡沫颗粒中，通入空气使固定化细胞悬浮于反应器中。填充床生物反应器：细胞固定在胶粒、泡沫颗粒或连续的多个网中，细胞固定不动，通过流动的培养液传质。常见的几种固定化培养系统出口进口填充床生物反应器出口进口流化床生物反应器13第十三页，共七十二页。膜生物反应器：－－常见的是中空纤维和螺线式卷绕反应器，传质效率低，易阻塞，产物收获较困难，投资大。细胞细胞营养物入口营养物入口营养物出口营养物出口营养物质中空纤维反应器螺线式卷绕反应器14第十四页，共七十二页。三、植物细胞培养的应用

植物细胞含有人类所需的成分，包括初生代谢物（蛋白质、碳水化合物、脂肪等）和次生代谢物（多酚类、香精油、生物碱、树脂等），传统提取分离这些物质由于资源短缺和需求量的加大，难以满足需求，通过细胞培养生产植物产品成为解决的有效途径。

15第十五页，共七十二页。1、生产药用代谢产物生物碱（吡啶、喹啉、吗啡）、蛋白质类（氨基酸、植物抗生素、胰岛素）、酚类化合物（黄酮类、单酚类、醌类）、萜类化合物（三萜皂甙、甾体皂甙、单萜、倍半萜、二萜）等。豆杉细胞紫杉醇（抗癌药物）紫草细胞紫草宁（烧伤、痔疮）例子：苦瓜细胞胰岛素聚合草愈伤组织L-谷氨酰胺16第十六页，共七十二页。2、生产天然食品、食品添加剂色素（胡萝卜素、叶黄素、单宁）、甜味剂（甜菊苷）、香料物质、饮料（可可碱、咖啡碱）等；3、生产杀虫剂、杀菌剂万寿菊细胞中获得农药噻吩烷；除虫菊的愈伤组织中得到除虫菊脂；香草细胞中分离到鱼藤酮杀虫剂等；4、生产饲料、精细化工产品桑细胞培养养蚕饲料银胶菌细胞培养橡胶17第十七页，共七十二页。1、两步培养技术（使用两个反应器）四、细胞培养中提高代谢产物的技术(1)第一个用于细胞生物量的累积，即尽可能快的使细胞量增长，用维持培养基；(2)第二个用于次级代谢产物的生产，即诱发和保持次生代谢旺盛并积累相应代谢产物，一般用生产培养基。18第十八页，共七十二页。2、固定化培养技术

应用淀粉、琼脂、琼脂糖、藻酸钠、聚丙烯酰胺等作载体，将细胞固定在珠状胶囊或各种形状的支持物上。含CaCl2的培养基盖子空气出口海藻酸钠+细胞悬浮液喷嘴无菌空气入口19第十九页，共七十二页。

在培养体系中加入水溶性和脂溶性有机物，或是具有吸附作用的多聚化合物（如大孔树脂等），使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长和合成次生物质，次生物质分泌出来转到有机相中。3两相培养技术(2)前提条件：a添加的有机物无毒害作用

b产物溶于有机物或被其吸收

c两相易分离，有利于产物回收

d有机物等不吸收培养基中的有效成分20第二十页，共七十二页。(1)诱导剂：

可引起代谢途径改变或代谢强度改变的物质,

如无机离子、真菌提取液、葡聚糖等。

作用机理:

可以调节代谢进程某些酶的活性,并对某些关键酶在转录水平上进行调节。4加入诱导剂及前体物21第二十一页，共七十二页。作用：消除关键酶的阻碍、阻断内源性中间体的分隔和有效贮存，大大提高次生代谢物的产量。(2)前体物烟草：加入天仙子胺，则尼古丁产量降低而新烟碱含量大大提高22第二十二页，共七十二页。第二部分

动物细胞分离与培养

在活体内，动物细胞的形态与其功能密切相关。如肌细胞呈纤维状，便于收缩；神经细胞发出许多分支，便于形成网络；红细胞呈圆盘状，便于气体交换；上皮细胞呈不规则状，便于覆盖在器官表面相互挤压。23第二十三页，共七十二页。原代培养（primaryculture):将组织取出来后，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中，在培养箱中培养，这个过程称为原代培养。24第二十四页，共七十二页。鸡胚原代细胞：在无菌条件下采取9－10日龄鸡胚↓除去头(或仅除去喙和眼)、爪和内脏，并剪成块↓用Hanks液等充分冲洗↓剪将其剪成lmm大小的碎块↓加入Hanks液或其他洗液，充分冲洗↓约4倍量的0.25％胰酶，并调整pH至7.6－7.8↓37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次↓吸弃上层胰酶溶液↓用洗液轻洗2次后↓吸管充分吹打，直至形成均匀的细胞悬液↓准备细胞计数↓单层细胞培养25第二十五页，共七十二页。传（继）代培养（secondaryculture,passage,split):细胞在培养瓶中贴壁生长。随着细胞的生长和增殖，培养瓶中的细胞越来越多，需要定期地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中培养，这称为传代培养。26第二十六页，共七十二页。在离体条件下，细胞一般表现为三种形态：（1）贴壁依赖型（anchorage-dependent)细胞；（2）非贴壁依赖型（anchorage-independent)细胞：也称为悬浮型细胞，包括来源于血液的细胞和许多肿瘤细胞。（3）兼性贴壁细胞：主要是一些细胞系，如CHO细胞。27第二十七页，共七十二页。一、动物细胞体外培养的方法悬浮培养贴壁培养固定化培养大规模培养法28第二十八页，共七十二页。类似于微生物发酵培养，但对机械剪切力敏感，常采用转瓶和摇瓶培养方式。缺点：培养细胞密度低且易发生变异1、悬浮培养29第二十九页，共七十二页。2、贴壁培养贴壁培养

指必须将细胞帖附在固体介质表面上（带适量正电荷）才能进行细胞培养的方式，包括成纤维型细胞（如肌细胞)、上皮型细胞(如皮肤表皮细胞)。细胞贴壁培养过程

贴壁因子吸附于培养表面、细胞与表面接触、细胞贴附于培养表面和细胞在培养表面上扩展等几个过程。30第三十页，共七十二页。细胞贴壁的过程：31第三十一页，共七十二页。贴壁培养正常细胞在生长过程中随着细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制现象（Contactinhibition），而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制（Densityinhibition）32第三十二页，共七十二页。容易更换培养基；可采用灌注培养；方便产物表达；方便调节培养液与细胞的比例；易于观察等。细胞贴壁生长优点33第三十三页，共七十二页。滚瓶系统培养

操作简单，重复性好，但单位体积提供细胞生长的表面积小，产量低，监测难。微载体培养

细胞贴附在微载体表面生长成细胞单层，而微载体悬浮于培养基中，综合了单层培养与悬浮培养的优点。贴壁培养细胞培养方法34第三十四页，共七十二页。3、固定化细胞培养技术固定化细胞培养（immobilizationculture)是指采用吸附（固体吸附剂）、共价贴附（与固相载体结合）、共价交连（用试剂处理形成细胞絮结）、包埋（将细胞包埋在多孔材料内）和微囊化等方法将细胞固定在支持物上，或形成细胞絮结，或将细胞嵌入微囊或高分子聚合物的网络中进行培养。该方法对贴壁依赖性细胞与非贴壁依赖性细胞均适用。

35第三十五页，共七十二页。4、大规模培养技术

动物细胞大规模培养技术（large-scaleculturetechnique)是指在动物细胞生物反应器中大量地培养动物细胞以获得生物制品的技术。主要包括：微载体（microcarrier)培养技术中空纤维(hollowfiber)培养技术微囊化(micro-encapsulation)技术

36第三十六页，共七十二页。（1）微载体培养技术微载体是指直径在60-250μm的微珠、能够适用于贴壁细胞生长，细胞贴壁于微载体上，微载体(和细胞)悬浮于培养基中，细胞在微载体表面逐渐生长成单层。优点：是表面积与体积比大、可搅拌、便于显微观察、占用空间小、易放大；具有单层培养和悬浮培养的特点；缺点：是培养液用量大。玻璃微珠37第三十七页，共七十二页。微载体的主要特性微载体的大小：通常直径在100-200微米之间。微载体的密度：在慢速（40-50rpm)搅拌下，一般为1.03-1.05g/cm3微载体的表面电荷：表面电荷密度应适中，太低不利于细胞贴附；太高则有细胞毒性。38第三十八页，共七十二页。微载体的种类以交连葡聚糖为基质的微载体：DEAE-交连葡聚糖微载体、cytodex2微载体、dormacell微载体、cytodex3微载体等。以塑料为基质的微载体：聚苯乙烯微载体、聚苯烯酰胺微载体。明胶(gelatin)微载体以玻璃为基质的微载体以纤维素为基质的微载体（DE-52、DE-53）液膜微载体（形成聚赖氨酸微液珠）大孔微载体（载体内部有大孔互相连通）39第三十九页，共七十二页。（2）中空纤维培养技术中空纤维培养技术由Knazek于1972年研制成功。空心纤维的材料是聚砜或聚丙烯等高分子物质。纤维壁为半透膜。数百或数千条纤维捆成一束并集中开口，培养液从管腔流过，细胞贴附在纤维外壁生长。40第四十页，共七十二页。（3）微囊化技术微囊化培养由Lim等于1981年提出，其原理是采用一层亲水性的半透膜将细胞包围在珠状的微囊内，因而降低了培养液对细胞的剪切力，培养密度高。目前采用最多的是多聚赖氨酸/海藻酸法（PLL/ALG法），通过氯化钙成囊，再用柠檬酸液化。缺点：成囊技术较难，成功率约50%。41第四十一页，共七十二页。二、动物细胞体外生长的要求环境要求营养要求温度pH值气体渗透压葡萄糖氨基酸无机盐维生素动物血清等CO2培养箱42第四十二页，共七十二页。1）、温度：不同来源的细胞，其培养的最适温度不同。例如，昆虫及鱼类细胞25-28度，哺乳动物细胞一般为37度；细胞对低温的耐受力比高温强。温度除直接影响细胞生长外，还与培养液的pH值有关，温度低时CO2溶解性增加，从而影响pH。环境要求43第四十三页，共七十二页。2）、pH值：动物细胞培养最适pH值为，低于6.8或高于7.6均对细胞产生严重影响，甚至导致细胞死亡；一般原代培养的细胞对pH值要求严格，细胞系对一定范围的pH值改变有抵抗力。酚红是常用的指示剂，用来检测pH的变化：红色--pH7.4，橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。44第四十四页，共七十二页。3）、气体：细胞在培养初期对溶氧要求较少，但在快速增殖（对数增长期或指数增长期）要求有较多的溶氧。4）、渗透压：培养液的渗透压一般保持在与体液相同的水平，对细胞较为适宜。例如，生理盐水或平衡盐溶液。45第四十五页，共七十二页。动物细胞培养营养要求高，培养液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。分天然培养基、合成培养基和无血清培养基。营养要求46第四十六页，共七十二页。1）、天然培养基：来自动物的体液或组织液，早期广泛采用。例如：血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）等；优点：营养成分丰富，培养效果好，符合细胞生长的要求；缺点：成分不确定，来源复杂、有限，不能做到标准化，易发生支原体污染。47第四十七页，共七十二页。血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）；②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；⑤各种生长因子；⑥转移蛋白；⑦其它不明成分。48第四十八页，共七十二页。血清种类及来源：(1)胎牛血清(2)犊牛血清：犊牛出生后，不给吮乳，尽早由颈动脉无菌放血。(3)牛、马、羊血清：通常由颈静脉采取，或屠宰时由颈动脉放血采取。(4)其它血清：如兔血清和鸡血清等，

49第四十九页，共七十二页。2）、合成培养基：根据动物的体液成份和细胞生长的需要，由各种营养物质组合而成，如MEM、DMEM、RPMI1640等。优点：能够标准化生产，组分和含量相对固定，成本低；缺点：不能完全满足细胞生长与增殖的需要。因此，在培养时，一般在培养液中加入一定量（10-15%）的血清，为细胞提供促贴壁因子或促生长因子。3）、无血清培养基50第五十页，共七十二页。第三部分细胞融合

细胞融合（cellfusion）是20世纪60年代创立的，是指在一定条件下，将两个或多个细胞融合在一个细胞的过程，又称细胞杂交。51第五十一页，共七十二页。注意事项：动物细胞因没有细胞壁，可以直接融合；植物细胞和微生物细胞具有细胞壁不能直接融合，需除去细胞壁后获得原生质体（protoplast）,而后再进行融合，又称原生质体融合。52第五十二页，共七十二页。一、细胞融合的方法：生物法——仙台病毒法化学法——PEG等物理法——电融合法53第五十三页，共七十二页。1、生物法——仙台病毒法

原理：病毒被膜具有凝聚细胞的能力，它一边黏连一个细胞的表面，另一边黏连另一个细胞的表面，从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结，诱导细胞的融合。54第五十四页，共七十二页。2、化学法主要包括：盐类融合法（NaNO3）高Ca2+和高pH值诱导法聚乙二醇（PEG）融合法PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法55第五十五页，共七十二页。1）、盐类融合法（NaNO3）的原理：

盐（如NaNO3）能中和原生质体表面的电荷，促进原生质体的聚集，诱导细胞的融合。盐类融合剂种类硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2氯化物类：NaCl、CaCl2

、MgCl2

、BaCl2葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠56第五十六页，共七十二页。2）、聚乙二醇（PEG）融合法PEG的作用机理：

PEG分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的物质形成氢键，在原生质体之间形成分子桥，使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合。57第五十七页，共七十二页。PEG诱导原生质体融合过程58第五十八页，共七十二页。PEG诱导融合的优点与缺点优点：融合成本低，勿需特殊设备；

融合子产生的异核率较高；

融合过程不受物种限制。缺点：

融合过程繁琐；

PEG可能对细胞有毒害。59第五十九页，共七十二页。3、物理法—电融合法

原理：

改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭合成完整的膜，形成融合体。60第六十页，共七十二页。细胞电融合过程61第六十一页，共七十二页。融合过程：◉细胞膜的接触：电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，使原生质体极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；◉膜的击穿：高频直流脉冲使原生质膜击穿，导致两个紧密接触的细胞融合在一起。62第六十二页，共七十二页。电融合优点：不存在对细胞的毒害问题；融合效率高，重复性强；融合技术装置精巧，操作简便。可在显微镜下观察或录像融合过程，免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。63第六十三页，共七十二页。二、细胞融合类型对称融合（symmetricfusion）：即两个完整的细胞或原生质体融合。非对称融合（asymmetricfusion）：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。64第六十四页，共七十二页。核或细胞质失活的方法：物理方法：常采用射线处理，如X射线、γ射线等，使细胞核失活；化学处理：

核失活－碘乙酰胺、碘乙酸；

细胞质失活－罗丹明（能抑制线粒体的氧化磷酸化过程）。65第六十五页，共七十二页。三、影响细胞或原生质体融合的因素：⊙首先，细胞或原生质体质量；⊙其次，融合方法：

PEG诱导法：PEG规格、纯度，作用时间

电诱导法：细胞或原生质体密度、交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间、直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数。66第六十六页，共七十二页。四、体细胞杂种的鉴定形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定（如核型）。生化鉴定：同功酶鉴定。分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。67第六十七页，共七十二页。几种细胞融合成功的例子融合生物种类细胞来源成功年代烟草两个种间叶——叶1972甘蓝——青菜叶——根1972大豆——马唐草愈伤组织——叶1972矮牵牛——龙面花叶——花瓣1973大麦——花生种子——种子1974大麦——大豆叶——悬浮细胞1974小麦——矮牵牛