备课素材：PCＲ与琼脂糖电泳实验的改进-高二下学期生物人教版选择性必修3

PCＲ与琼脂糖电泳实验的改进聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCＲ)与琼脂糖电泳是高中生物学基因工程的常规实验。一次实验课的课时为1～3学时(45min～2h)，常规PCＲ反应至少需要1．5～2h;琼脂糖电泳中制胶、制样、点样、电泳等过程至少需要1h;实验原理、操作步骤的讲述、学生动手操作、结果点评等过程至少需1h;总体一次PCＲ与琼脂糖电泳实验需要4h，无法满足教学需要。通过改进PCＲ反应体系、缩短仪器运行及电泳时间，从而做到在单学时内顺利完成PCＲ及电泳实验，以便教师有足够的时间可充分解释实验原理、总结实验结果，帮助学生提高分析、解决问题的能力，满足PCＲ与电泳实验的教学需求，提高实验教学效果。改进PCＲ反应体系，减少加样种类常规PCＲ反应体系包括PCＲ反应缓冲液、Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、一对引物、模板DNA、H2O，反应需加7种试剂。本实验选用2×EasyTaqPCＲSuperMix试剂，该试剂包括了PCＲ扩增所需的反应缓冲液、Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶4种试剂，用表1反应体系、只需要加4种试剂，缩短了加样过程，更方便学生操作。减小扩增目的片段的大小，缩短单次循环反应时间。吊兰是常见的室内观赏植物，实验用吊兰基因组DNA(gDNA)作模板，取材方便。用吊兰gDNA做模板，引物序列，扩增出来的DNA总长315bp。由于扩增的片断较小，变性、退火、延伸时间均由原来的30～60s降低为10s(表2)，PCＲ产物经1%琼脂糖电泳后均可发现明亮、单一扩增条带(图1A—1D)，表明该实验参数可用于基因片段的扩增。降低循环圈数，缩短总体反应时间。PCＲ循环圈数也是影响反应时间的一个关键因素，常规的循环圈数为35～40，通过设置20、25、30、35、40个不同的循环圈数，发现循环圈数为20时，24min即可完成PCＲ扩增，且经检测发现，PCＲ产物条带明亮(图1A—1D，1)，可满足学生实验的需求。增大电压、缩短电泳时间。琼脂糖电泳电压要求为3～5V/cm，用150V电压，分别电泳5、10、15、20min(图1)，发现，电泳10min后DNAmarker中的100bp、250bp、500bp的条带可明显区分开，本实验设计扩增的片段为315bp，界于250～500bp之间，电泳10min足够用来观察条带，判断其位置(图1B)。染料加入琼脂糖凝胶中，省略染色过程。常用的染色步骤有两种:一种是先电泳，后染色;一种是将染料放入琼脂糖凝胶中，边电泳边染色。常用的DNA染料为EB，EB为强诱变剂，具有高致癌性，本实验选用相对较安全的染料GelＲed，采用将该染料加入琼脂糖凝胶中的方法进行DNA染色，既相对安全，又节省了时间。通过以上改进，选用表1的反应体系、选用表2的反应参数，用GelＲed做染料加入琼脂糖凝胶中，150V电泳10min，最终可以在34min完成PCＲ反应及电泳实验，且实验结果可满足学生实验。在快速完成该实验的过程中，以下几个问题值得关注:首先，PCＲ实验中需要不同量程的微量移液器，该装备价格相对较高，且如果使用不当，极易损耗，如何让每一位学生都能正确、熟练运用微量移液器是一个值得探究的问题;其次，本实验中需要2×EasyTaqPCＲSuperMix和毒性相对小的GelＲed为DNA染料，该染料价位相对较高，必使实验经费增