原位杂交课件

第五章原位杂交组织化学刘颖liuying6477@163.com(insituhybridizationhistochemistry)1第五章原位杂交组织化学刘颖(insituhybriWhatKindofDiseaseIsCancer?2WhatKindofDiseaseIs2CELLCelljunctionProliferationExtracellularmatrixTelomereSignaltransductionDifferentiationApoptosis3CELLCelljunctionProliferationWhatWeHaveKnownabouttheCellCycleControl?4WhatWeHaveKnown4OncogeneAntioncogeneCellDivisionCycleGene,cdcgenes;CyclinsCyclinDependentKinases,CDKsCyclinDependentKinasesInhibitors,CDKIsSphasePromotingFactor,SPFMaturationPromotingFactor,MPF蛋白质水平基因水平5OncogeneCyclins蛋白质水平基因水平5第一节原位杂交组织化学基本原理变性变性温度（Tm）复性共价键酯键JamesWatsonandFrancisCrick(Cambridge)discoverthestructureofDNA.6第一节原位杂交组织化学基本原理共价键酯键JamesWa我国培育出转基因克隆奶牛时间：2011-08-26吉林大学农学部奶牛繁育基地近日成功培育出一头携带转入赖氨酸基因的克隆奶牛。据介绍，这是世界上首次利用分子生物学技术和体细胞核移植技术获得的赖氨酸转基因克隆牛，也标志着世界克隆技术的又一次突破。7我国培育出转基因克隆奶牛时间：2011-08-26吉林大DNA变性(denaturation)指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性温度（meltingtemperature,Tm）热变性使DNA分子双链解开所需温度称为熔解温度。影响Tm的因素DNA的均一性DNA分子中的（G+C）含量溶剂的性质低离子强度，Tm低高pH变性剂甲酰胺8DNA变性(denaturation)8复性（renaturation）指变性的DNA(单链)在适当的条件下，两条彼此分开的多核苷酸链又可以重新结合成双螺旋

结构

复性的影响因素温度DNA浓度DNA片段长度DNA分子的复杂性离子强度9复性（renaturation）9第二节核酸分子杂交两条互补DNA或RNA单链之间以复性的原理形成双链核酸的过程影响杂交体稳定性的因素杂交双链的碱基组成杂交双链的长度碱基错配程度离子强度变性剂浓度10第二节核酸分子杂交两条互补DNA或RNA单链之间以复性的原核酸分子杂交液相杂交固相杂交11核酸分子杂交11原位杂交组织化学(ISH)应用特定标记的已知核酸探针与组织或细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观察。可进行细胞内核酸定性、定位的一种技术。12原位杂交组织化学(ISH)应用特定标记的已知核酸探针与组织或第三节核酸分子探针定义：一种带有标记物的、已知的、仅与靶分子特异反应的分子。探针的种类DNA探针cRNA探针寡核苷酸探针13第三节核酸分子探针定义：一种带有标记物的、已知的、仅与DNA探针基因组DNA探针最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针cDNA探针互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的优点：制备方法简便，不易降解，标记方法较成熟14DNA探针14cRNA探针以cDNA为模板在体外转录而成的探针优点单链探针，故以cRNA探针进行杂交反应可避免应用双链cDNA探针作杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。cRNA和mRNA之间形成的杂交体要比cDNA-mRNA杂交体稳定．因此杂交反应后可经受高严格度洗涤。cRNA-mRNA杂交体不受RNA酶的影响，故杂交后还可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。缺点制备过程较复杂，需要较高的分子生物学实验条件，cRNA对RNA酶敏感，易被RNA酶破坏，因而在操作过程中需严格防止RNA酶污染。15cRNA探针15寡核苷酸探针根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段。优点：

①短的探针比长探针杂交速度快，易穿透组织。

②制备简易，可以在短时间内大量制备，序列任定。

③在合成中进行标记制成探针。

④使用简便，可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。

⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。

16寡核苷酸探针16探针的标记

探针标记物放射性同位素

3H、35S或32P易掺入，敏感，易检测，时间长，污染非放射性标记物稳定，分辨率高，时间短，操作简便，无污染酶类：HRP,AKP半抗原：生物素,地高辛，2，4-二硝基苯（DNP）

荧光素：FITC,罗丹明探针标记方法17探针的标记17根据探针的标记物是否能直接检测直接法间接法18根据探针的标记物18第四节原位杂交组织化学基本程序标本制备杂交前处理

杂交反应

杂交后处理检测杂交信号19第四节原位杂交组织化学基本程序标本制备19标本制备取材

固定

固定剂

4％PFA固定方法

切片

石蜡切片冰冻切片

培养细胞

载玻片核酸酶清洗试剂盒(原位杂交)20标本制备取材载玻片核酸酶清洗试剂盒(原位杂交)20杂交前处理

增强组织通透性和核酸探针穿透性去污剂处理TritonX-100处理15min蛋白酶处理蛋白酶K，37℃孵育15~30min减低背景染色酸酐和稀酸处理0.25%乙酸酐处理10min预杂交不含探针的预杂交液在杂交温度下预先孵育标本1~2h内源性生物素和酶的抑制用5%脱脂奶粉缓冲盐液来稀释标记的卵白素以及将标本浸于含2%牛血清白蛋白的缓冲液对于内源性的AKP和过氧化物酶可通过将标本分别浸于20%乙酸(4℃)中15秒或过碘酸淋洗和用含1%H2O2的蒸馏水或甲醇溶液室温孵育30min加以阻断。

21杂交前处理增强组织通透性和核酸探针穿透性21杂交反应

双链DNA探针和靶DNA变性

杂交反应进行时，探针和靶核酸必须是单链。杂交液探针探针长度

50-100bp，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。探针浓度0.5-5.0μg/ml。甲酰胺可使Tm降低，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。硫酸葡聚糖能与水结合，提高探针有效浓度。牛血清白蛋白阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。杂交温度和时间

大约在30~60℃之间。一般将杂交时间定为16~20h，或为了方便，将杂交液和标本孵育过夜用杂交液孵育组织切片，杂交液中标记的核酸探针在适当的条件下与组织细胞内相应的靶核酸互补结合形成杂交体的过程。22杂交反应双链DNA探针和靶DNA变性用杂交液孵育组织切片杂交后处理

杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度盐溶液的漂洗

一般而言，盐浓度由高到低，而温度由低到高，漂洗10~15min。高浓度的盐可减少探针与组织标本间的静电结合。漂洗过程中，还必须注意防止切片干燥，因干燥的切片即使用大量溶液漂洗也很难减少非特异性结合。23杂交后处理杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度盐溶液的杂交体检测

放射性同位素标记探针的检测

32P、125I、35S等放射性同位素均可用来标记探针，利用感光乳胶记录被研究材料中放射性物质分布和定位。非放射性标记探针的检测常用非放射性标记物多为半抗原，以半抗原标记探针的原位杂交信号可通过免疫酶组织化学或亲合组织化学技术显示。

是通过一定的方法使杂交反应形成的杂交体成为在显微镜下可识别的产物。24杂交体检测放射性同位素标记探针的检测是通过一定的方法使杂放射性同位素标记探针的检测非放射性标记探针的检测25放射性同位素标记探针的检测非放射性标记探针的检测25对照实验组织对照Southern/Northern免疫组织化学探针对照已知阳性组织和已知阴性组织用有意义链RNA探针吸收试验杂交反应对照空白实验杂交前用核酸酶预处理标本检测系统对照放射自显影检测系统对照非放射性原位杂交检测系统对照26对照实验组织对照26试剂盒内容1.胃蛋白酶（×10;Pepsin）2ml；2.预杂交液2ml；3.地高辛标记ADRA1寡核苷酸探针杂交液2ml；4.封闭液5ml;5.生物素化鼠抗地高辛5ml;6.SABC-POD5ml；7.生物素化过氧化物酶5ml；27试剂盒内容1.胃蛋白酶（×10;Pepsin）2ml；2

原位杂交组织化学技术进展原位PCR技术

荧光原位杂交技术

胚胎原位杂交技术

双重和多重原位杂交技术

原位杂交结合免疫组织化学技术

电镜原位杂交技术

肽核酸原位杂交

28原位杂交组织化学技术进展原位PCR技术28将PCR技术与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原位研究基因变化的技术。根据在扩增反应中所用的dNTP或引物是否标记，原位PCR可分为：直接法原位PCR间接法原位PCR原位PCR技术原理29将PCR技术与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织的原有位置原位PCR技术直接法原位PCR

在标本进行PCR扩增时，标记物掺入到扩增产物中，无需分子杂交。优点:操作简便、省时.缺点:特异性较差、扩增效率较低、易出现假阳性，特别是在组织切片上，假阳性信号主要来自标本中受损DNA的修复过程。固定组织蛋白酶K消化PCR扩增显微镜观察dNTP--荧光素或dNTP-地高辛

-生物素或荧光染料－抗地高辛抗体－抗生物素抗体30原位PCR技术直接法原位PCR固定组织蛋白酶K消化PCR扩原位PCR技术间接法原位PCR

先将引物、核苷酸及酶等反应物引入细胞内进行扩增，然后用特异性标记探针与扩增产物进行原位杂交，检测细胞内扩增的DNA产物。优点:克服由于DNA修复或引物错配引起的非特异性染色问题，使扩增效率提高，特异性增强.缺点:操作步骤繁琐，用时长。固定组织蛋白酶K消化PCR扩增显微镜观察原位杂交31原位PCR技术间接法原位PCR固定组织蛋白酶K消化PCR扩原位PCR技术原位逆转录PCR原理:是将逆转录反应和PCR相结合，在原位检测细胞内低拷贝mRNA的方法。分类:直接法和间接法.步骤:1.用DNA酶处理以破坏组织细胞中的DNA。

2.逆转录

3.扩增优点：不需从标本中提取mRNA,不会因在核酸的分离中造成靶序列破坏而致信号丢失。32原位PCR技术原位逆转录PCR32荧光原位杂交技术(Fluorescentinsitu

hybridization,FISH)原理:一种利用荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。直接FISH间接FISH33荧光原位杂交技术(Fluorescentinsituh直接FISH34直接FISH34直接FISH将已知碱基序列的特异DNA片断作为探针，并标记上不同荧光素，在组织切片、染色体标本上与靶核酸进行DNA-DNA原位杂交，因所形成的杂交体带有荧光素，故可在荧光显微镜下直接观察.常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、得克萨斯红(TexasRed)、罗丹明(rhodamin)等。简单、快速信号较弱，敏感性较低。35直接FISH将已知碱基序列的特异DNA片断作为探针，并标记上间接FISH使用非荧光标记的探针，如生物素或地高辛等标记探针，再通过亲和连接或免疫反应带入各种发光物质来检测杂交体的存在。因为有杂交信号放大作用，从而增加了杂交的敏感性，也降低了实验成本，故间接法FISH是目前使用较多的方法。36间接FISH使用非荧光标记的探针，如生物素或地高辛等标记探针间接FISH地高辛or生物素37间接FISH地高辛or生物素37Down(21三体)综合征间期细胞中的杂交信号38Down(21三体)综合征间期细胞中的杂交信号38多色FISH通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针结合(直接法)，在一个细胞核中可呈现多种颜色标记，同时检测多种染色体异常。39多色FISH通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针

Figure1.Uprightopticalsliceofanintactembryoinblastodermstage.DoublestainingformRNAandprotein.TargetmRNAsforinsituprobes(sogandsna)andproteinstainedbyprimaryantibody(anti-Dorsal)areindicatedinthefigure.DAPIwasusedtolabelthenuclei.Notethattheexpressionofsogandsnaarelocatedapicallyinthecytoplasm,whiletheexpressionofDorsalisnuclear.40

Figure1.Uprightopticalsli十二色荧光原位杂交技术鉴定食管癌KYSE450细胞系核型各染色体标记的探针池组合41十二色荧光原位杂交技术鉴定食管癌KYSE450细胞系核型各染FIBERFISH将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA纤维，然后用标记不同颜色荧光物质的探针与DNA纤维进行杂交，最后用荧光显微镜观察结果并分析.42FIBERFISH将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展4343SwangerSA,BassellGJ,GrossC.High-resolutionfluorescenceinsituhybridizationtodetectmRNAsinneuronalcompartmentsinvitroandinvivo.Methods

MolBiol.2011;714:103-23.DepartmentofCellBiology,EmoryUniversitySchoolofMedicine,Atlanta,GA,USA.JamesR.Coleman,DavidE.Culley,WilliamB.ChrislerandFredJ.Brockman.mRNA-targetedfluorescentinsituhybridization(FISH)ofGram-negativebacteriawithouttemplateamplificationortyramidesignalamplification.JournalofMicrobiologicalMethods.Volume71,Issue3,December2007,Pages246-255

PacificNorthwestNationalLaboratory,POBox999/MSP7-50,Richland,WA99354,USA44SwangerSA,BassellGJ,Gross胚胎原位杂交技术

全胚胎原位杂交从整体水平反映胚胎发育过程中基因表达的时空顺序,是一种广泛应用于胚胎发育调控基因表达研究的技术。胚胎组织切片原位杂交A：小鼠10.5dpc胚胎ERβ反义RNA探针的杂交：

RE(菱脑),MA(颌弓),PC(心包),SNT(脊神经管),GR(生殖脊),LB(肢芽);B：小鼠10.5dpc胚胎ERb

有意义链RNA探针的杂交;C:13.5dpc胚胎ERb反义RNA探针的杂交结果:TE(端脑),ME(中脑),MO(延髓),SC(脊髓),LB(肢芽)：D：小鼠13.5dpc胚胎ERb有意义链RNA探针的杂交。45胚胎原位杂交技术全胚胎原位杂交A：小鼠10.5dpc胚胎4646原位杂交结合免疫组织化学47原位杂交结合免疫组织化学47电镜原位杂交48电镜原位杂交48肽核酸(PeptideNucleicAcids，PNA)是人工合成的电中性的肽链,以多聚酰胺键形成的类似核苷酸的物质。具有一个拟肽骨架，没有磷酸戊糖骨架.PNA链更容易和带有负电荷的互补序列的DNA或RNA链结合.PNA对互补DNA的错配容忍程度比相应的DNA/DNA更低.PNA不被目前已知的任何核酸酶或蛋白酶所降解。49肽核酸(PeptideNucleicAcids，PNA)LNA(Locked

Nucleic

Acid)是一种核酸类似物，和普通核酸分子区别在于在其碳环的2’氧原子和4’碳原子位置引入亚甲基桥形成锁状结构，因此也称锁核酸。优点和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性水溶性好,自由穿入细胞膜可用氨基磷酸法在DNA自动合成仪上合成

50LNA(Locked

Nucleic

Acid)是一种核酸类Alongwaytogo!!51Alongwaytogo!!51第五章原位杂交组织化学刘颖liuying6477@163.com(insituhybridizationhistochemistry)52第五章原位杂交组织化学刘颖(insituhybriWhatKindofDiseaseIsCancer?53WhatKindofDiseaseIs2CELLCelljunctionProliferationExtracellularmatrixTelomereSignaltransductionDifferentiationApoptosis54CELLCelljunctionProliferationWhatWeHaveKnownabouttheCellCycleControl?55WhatWeHaveKnown4OncogeneAntioncogeneCellDivisionCycleGene,cdcgenes;CyclinsCyclinDependentKinases,CDKsCyclinDependentKinasesInhibitors,CDKIsSphasePromotingFactor,SPFMaturationPromotingFactor,MPF蛋白质水平基因水平56OncogeneCyclins蛋白质水平基因水平5第一节原位杂交组织化学基本原理变性变性温度（Tm）复性共价键酯键JamesWatsonandFrancisCrick(Cambridge)discoverthestructureofDNA.57第一节原位杂交组织化学基本原理共价键酯键JamesWa我国培育出转基因克隆奶牛时间：2011-08-26吉林大学农学部奶牛繁育基地近日成功培育出一头携带转入赖氨酸基因的克隆奶牛。据介绍，这是世界上首次利用分子生物学技术和体细胞核移植技术获得的赖氨酸转基因克隆牛，也标志着世界克隆技术的又一次突破。58我国培育出转基因克隆奶牛时间：2011-08-26吉林大DNA变性(denaturation)指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性温度（meltingtemperature,Tm）热变性使DNA分子双链解开所需温度称为熔解温度。影响Tm的因素DNA的均一性DNA分子中的（G+C）含量溶剂的性质低离子强度，Tm低高pH变性剂甲酰胺59DNA变性(denaturation)8复性（renaturation）指变性的DNA(单链)在适当的条件下，两条彼此分开的多核苷酸链又可以重新结合成双螺旋

结构

复性的影响因素温度DNA浓度DNA片段长度DNA分子的复杂性离子强度60复性（renaturation）9第二节核酸分子杂交两条互补DNA或RNA单链之间以复性的原理形成双链核酸的过程影响杂交体稳定性的因素杂交双链的碱基组成杂交双链的长度碱基错配程度离子强度变性剂浓度61第二节核酸分子杂交两条互补DNA或RNA单链之间以复性的原核酸分子杂交液相杂交固相杂交62核酸分子杂交11原位杂交组织化学(ISH)应用特定标记的已知核酸探针与组织或细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观察。可进行细胞内核酸定性、定位的一种技术。63原位杂交组织化学(ISH)应用特定标记的已知核酸探针与组织或第三节核酸分子探针定义：一种带有标记物的、已知的、仅与靶分子特异反应的分子。探针的种类DNA探针cRNA探针寡核苷酸探针64第三节核酸分子探针定义：一种带有标记物的、已知的、仅与DNA探针基因组DNA探针最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针cDNA探针互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的优点：制备方法简便，不易降解，标记方法较成熟65DNA探针14cRNA探针以cDNA为模板在体外转录而成的探针优点单链探针，故以cRNA探针进行杂交反应可避免应用双链cDNA探针作杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。cRNA和mRNA之间形成的杂交体要比cDNA-mRNA杂交体稳定．因此杂交反应后可经受高严格度洗涤。cRNA-mRNA杂交体不受RNA酶的影响，故杂交后还可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。缺点制备过程较复杂，需要较高的分子生物学实验条件，cRNA对RNA酶敏感，易被RNA酶破坏，因而在操作过程中需严格防止RNA酶污染。66cRNA探针15寡核苷酸探针根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段。优点：

①短的探针比长探针杂交速度快，易穿透组织。

②制备简易，可以在短时间内大量制备，序列任定。

③在合成中进行标记制成探针。

④使用简便，可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。

⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。

67寡核苷酸探针16探针的标记

探针标记物放射性同位素

3H、35S或32P易掺入，敏感，易检测，时间长，污染非放射性标记物稳定，分辨率高，时间短，操作简便，无污染酶类：HRP,AKP半抗原：生物素,地高辛，2，4-二硝基苯（DNP）

荧光素：FITC,罗丹明探针标记方法68探针的标记17根据探针的标记物是否能直接检测直接法间接法69根据探针的标记物18第四节原位杂交组织化学基本程序标本制备杂交前处理

杂交反应

杂交后处理检测杂交信号70第四节原位杂交组织化学基本程序标本制备19标本制备取材

固定

固定剂

4％PFA固定方法

切片

石蜡切片冰冻切片

培养细胞

载玻片核酸酶清洗试剂盒(原位杂交)71标本制备取材载玻片核酸酶清洗试剂盒(原位杂交)20杂交前处理

增强组织通透性和核酸探针穿透性去污剂处理TritonX-100处理15min蛋白酶处理蛋白酶K，37℃孵育15~30min减低背景染色酸酐和稀酸处理0.25%乙酸酐处理10min预杂交不含探针的预杂交液在杂交温度下预先孵育标本1~2h内源性生物素和酶的抑制用5%脱脂奶粉缓冲盐液来稀释标记的卵白素以及将标本浸于含2%牛血清白蛋白的缓冲液对于内源性的AKP和过氧化物酶可通过将标本分别浸于20%乙酸(4℃)中15秒或过碘酸淋洗和用含1%H2O2的蒸馏水或甲醇溶液室温孵育30min加以阻断。

72杂交前处理增强组织通透性和核酸探针穿透性21杂交反应

双链DNA探针和靶DNA变性

杂交反应进行时，探针和靶核酸必须是单链。杂交液探针探针长度

50-100bp，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。探针浓度0.5-5.0μg/ml。甲酰胺可使Tm降低，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。硫酸葡聚糖能与水结合，提高探针有效浓度。牛血清白蛋白阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。杂交温度和时间

大约在30~60℃之间。一般将杂交时间定为16~20h，或为了方便，将杂交液和标本孵育过夜用杂交液孵育组织切片，杂交液中标记的核酸探针在适当的条件下与组织细胞内相应的靶核酸互补结合形成杂交体的过程。73杂交反应双链DNA探针和靶DNA变性用杂交液孵育组织切片杂交后处理

杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度盐溶液的漂洗

一般而言，盐浓度由高到低，而温度由低到高，漂洗10~15min。高浓度的盐可减少探针与组织标本间的静电结合。漂洗过程中，还必须注意防止切片干燥，因干燥的切片即使用大量溶液漂洗也很难减少非特异性结合。74杂交后处理杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度盐溶液的杂交体检测

放射性同位素标记探针的检测

32P、125I、35S等放射性同位素均可用来标记探针，利用感光乳胶记录被研究材料中放射性物质分布和定位。非放射性标记探针的检测常用非放射性标记物多为半抗原，以半抗原标记探针的原位杂交信号可通过免疫酶组织化学或亲合组织化学技术显示。

是通过一定的方法使杂交反应形成的杂交体成为在显微镜下可识别的产物。75杂交体检测放射性同位素标记探针的检测是通过一定的方法使杂放射性同位素标记探针的检测非放射性标记探针的检测76放射性同位素标记探针的检测非放射性标记探针的检测25对照实验组织对照Southern/Northern免疫组织化学探针对照已知阳性组织和已知阴性组织用有意义链RNA探针吸收试验杂交反应对照空白实验杂交前用核酸酶预处理标本检测系统对照放射自显影检测系统对照非放射性原位杂交检测系统对照77对照实验组织对照26试剂盒内容1.胃蛋白酶（×10;Pepsin）2ml；2.预杂交液2ml；3.地高辛标记ADRA1寡核苷酸探针杂交液2ml；4.封闭液5ml;5.生物素化鼠抗地高辛5ml;6.SABC-POD5ml；7.生物素化过氧化物酶5ml；78试剂盒内容1.胃蛋白酶（×10;Pepsin）2ml；2

原位杂交组织化学技术进展原位PCR技术

荧光原位杂交技术

胚胎原位杂交技术

双重和多重原位杂交技术

原位杂交结合免疫组织化学技术

电镜原位杂交技术

肽核酸原位杂交

79原位杂交组织化学技术进展原位PCR技术28将PCR技术与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原位研究基因变化的技术。根据在扩增反应中所用的dNTP或引物是否标记，原位PCR可分为：直接法原位PCR间接法原位PCR原位PCR技术原理80将PCR技术与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织的原有位置原位PCR技术直接法原位PCR

在标本进行PCR扩增时，标记物掺入到扩增产物中，无需分子杂交。优点:操作简便、省时.缺点:特异性较差、扩增效率较低、易出现假阳性，特别是在组织切片上，假阳性信号主要来自标本中受损DNA的修复过程。固定组织蛋白酶K消化PCR扩增显微镜观察dNTP--荧光素或dNTP-地高辛

-生物素或荧光染料－抗地高辛抗体－抗生物素抗体81原位PCR技术直接法原位PCR固定组织蛋白酶K消化PCR扩原位PCR技术间接法原位PCR

先将引物、核苷酸及酶等反应物引入细胞内进行扩增，然后用特异性标记探针与扩增产物进行原位杂交，检测细胞内扩增的DNA产物。优点:克服由于DNA修复或引物错配引起的非特异性染色问题，使扩增效率提高，特异性增强.缺点:操作步骤繁琐，用时长。固定组织蛋白酶K消化PCR扩增显微镜观察原位杂交82原位PCR技术间接法原位PCR固定组织蛋白酶K消化PCR扩原位PCR技术原位逆转录PCR原理:是将逆转录反应和PCR相结合，在原位检测细胞内低拷贝mRNA的方法。分类:直接法和间接法.步骤:1.用DNA酶处理以破坏组织细胞中的DNA。

2.逆转录

3.扩增优点：不需从标本中提取mRNA,不会因在核酸的分离中造成靶序列破坏而致信号丢失。83原位PCR技术原位逆转录PCR32荧光原位杂交技术(Fluorescentinsitu

hybridization,FISH)原理:一种利用荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。直接FISH间接FISH84荧光原位杂交技术(Fluorescentinsituh直接FISH85直接FISH34直接FISH将已知碱基序列的特异DNA片断作为探针，并标记上不同荧光素，在组织切片、染色体标本上与靶核酸进行DNA-DNA原位杂交，因所形成的杂交体带有荧光素，故可在荧光显微镜下直接观察.常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、得克萨斯红(TexasRed)、罗丹明(rhodamin)等。简单、快速信号较弱，敏感性较低。86直接FISH将已知碱基序列的特异DNA片断作为探针，并标记上间接FISH使用非荧光标记的探针，如生物素或地高辛等标记探针，再通过亲和连接或免疫反应带入各种发光物质来检测杂交体的存在。因为有杂交信号放大作用，从而增加了杂交的敏感性，也降低了实验成本，故间接法FISH是目前使用较多的方法。87间接FISH使用非荧光标记的探针，如生物素或地高辛等标记探针间接FISH地高辛or生物素88间接FISH地高辛or生物素37Down(21三体)综合征间期细胞中的杂交信号89Down(21三体)综合征间期细胞中的杂交信号38多色FISH通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针结合(直接法)，在一个细胞核中可呈现多种颜色标记，同时检测多种染色体异常。90多色FISH通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针

Figure1.Uprightopticalsliceofanintactembryoinblastodermstage.DoublestainingformRNAandprotein.TargetmRNAsforinsituprobes(sogandsna)andproteinstainedbyprimaryantibody(anti-Dorsal)areindicatedinthefigure.DAPIwasusedtolabelthenuclei.Notethattheexpressionofsogandsnaarelocatedapicallyinthecytoplasm,whiletheexpressionofDorsalisnuclear.91

Figure1.Uprightopticalsli十二色荧光原位杂交技术鉴定食管癌KYSE450细胞系核型各染色体标记的探针池组合92十二色荧光原位杂交技术鉴定食管癌KYSE450细胞系核型各染FIBERFISH将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA纤维，然后用标记不同颜色荧光物质的探针与DNA纤维进行杂交，最后用荧光显微镜观察结果并分析.93FIBERFISH将细胞的全部DNA在玻片