分子发光分析法课件

第五章分子发光分析法分析化学

第五章分子发光分析法分析化学1物质分子吸收了一定能量后,其电子由基态跃迁至激发态,当激发态分子以辐射形式将其能量释放返回基态时,便产生分子发光。根据这种现象建立的分析方法称为发光分析法。物质分子吸收了一定能量后,其电子由基态跃迁至激发态,当激2根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：

光致发光：以光源来激发而发光电致发光：以电能来激发而发光生物发光：以生物体释放的能量激发而发光化学发光：以化学反应能激发而发光根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：3分子荧光和磷光分析化学发光分子荧光和磷光分析4一、基本原理1、荧光和磷光的产生室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变为基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象成为“发光”。由于吸收光能而导致的发光称为光致发光。一、基本原理1、荧光和磷光的产生5处于基态的分子吸收能量后发生跃迁：处于基态的分子吸收能量后发生跃迁：6激发态分子的去活化过程

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁（发光）和无辐射跃迁等方式失去能量，称为去活化过程。去活化非辐射跃迁化学反应发射光子振动驰豫内转换系间跨越外转换熄灭或猝灭荧光磷光激发光去除后，磷光不会立即消失激发光去除后，荧光立即消失激发态分子的去活化过程电子处于激发态是不稳定状态，返回基7荧光和磷光体系能级图荧光和磷光体系能级图82、激发光谱和发射光谱激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）激发光谱形状与吸收光谱形状极为相似，经校正后二者完全相同！发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。2、激发光谱和发射光谱激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长9分子发光分析法课件10激发光谱和发射光谱的关系A.Stokes位移B.发射光谱的形状与激发波长无关C.镜像规则激发光谱和发射光谱的关系A.Stokes位移11A.基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似。激发：基态→第一激发态各振动能级，振动能级越高，能级差越大，波长就越短。

发射荧光：从第一激发态的最低振动能级→基态的各振动能级，基态的振动能级越高，其能量差越小，波长就越长。

吸收光谱中能级越高波长越短，发射光谱中能级越高，波长越长。互为镜像A.基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似124043211023404321102313B.基态上的零振动能级与第一激发态的振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。

B.基态上的零振动能级与第一激发态的振动能级之间的跃迁几率最14分子发光分析法课件153、荧光与分子结构的关系（内因）分子荧光产生的必备条件:分子必须具备与所照射的辐射频率相适应的结构吸收激发光的分子必须具有一定的荧光量子产率3、荧光与分子结构的关系（内因）分子荧光产生的必备条件:16影响因素：荧光产生过程中，辐射和无辐射过程；与每一过程的速率常数有关；Kf分子结构决定（内因）；主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。影响因素：荧光产生过程中，辐射和无辐射过程；17荧光与分子结构的关系（外因）（1）跃迁类型：具有电子跃迁类型的结构荧光与分子结构的关系（外因）（1）跃迁类型：具有电子18（2）、共轭效应具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程度越大，越易产生荧光;环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长（红移），发射的荧光强度越强（3）、刚性平面结构—较稳定的平面结构（2）、共轭效应19分子发光分析法课件20（4）取代基效应1）给电子取代剂加强荧光—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN产生p→π共轭相对荧光强度1018202020λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚2）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光（4）取代基效应1）给电子取代剂加强荧光相对荧光强度101821芳环上被F、Cl、Br、I取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。其原因是重原子的电子自旋和轨道运动间的相互作用变大，原子核附近产生磁场，使单重态向多重态系间跨越的几率增加。芳环上被F、Cl、Br、I取代后，使系间窜跃加强，磷光增强22分子发光分析法课件23分子发光分析法课件24(2)影响荧光强度的因素溶剂的影响（增大溶剂的极性荧光增强）温度的影响酸度的影响（芳香族化合物的官能团，金属与有机试剂螯合）内滤光和自吸收现象散射光的影响(2)影响荧光强度的因素溶剂的影响（增大溶剂的极性荧光增强）25(3)溶液荧光的猝灭

荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低或荧光强度不与浓度成线性关系的现象称为荧光猝灭。能引起荧光猝灭的物质叫荧光熄灭剂碰撞猝灭M+hv→M*,M*+Q→

M+热静态猝灭M+Q→

MQ非荧光物质转入三重态的猝灭引入碘、溴后，易发生体系间跨越荧光物质的自猝灭荧光物质浓度较高发生电荷转移反应的猝灭(3)溶液荧光的猝灭荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子26二、荧光（磷光）光谱仪荧光分光光度计的主要部件：光源、激发单色器、发射单色器、样品池、检测系统、显示系统。光源激发单色器样品池发射单色器检测器放大器指示器·记录器与分光光度计有两点不同：①两个单色器②检测器与激发光成直角二、荧光（磷光）光谱仪荧光分光光度计的主要部件：光源、激发单271.光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射365nm、405nm、436nm三条谱线以365nm的谱线最强应用最广泛的一种光源，可发射250~800nm很强的连续光源1.光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；282、单色器第一单色器作用：激发单色器，分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长ex。第二单色器作用：发射单色器，滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长em。2、单色器第一单色器作用：激发单色器，分离出所需要的激发光，293、样品池通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边。4、检测器荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管3、样品池30SK-2003A型荧光光谱仪(国内首创）SK-2003A型荧光光谱仪(国内首创）31磷光分析法与荧光相比，磷光的特点：1、磷光寿命比荧光长2、磷光辐射的波长比荧光长（一）磷光强度：Ip＝KC（二）温度对磷光强度的影响试样需在液氮温度（77K）或液氦（4K）下测定磷光分析法与荧光相比，磷光的特点：32磷光分析仪器与荧光分析仪器相似，主要差异如下：1.试样室试样需在液氮温度（77K）或液氦（4K）下测定－低温磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）

固体表面室温磷光分析需特制试样室2.磷光镜有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械切光装置——磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。磷光分析仪器与荧光分析仪器相似，主要差异如下：33磷光仪器在荧光仪样品池上增加磷光配件：低温杜瓦瓶和斩光片。如右图所示。斩光片的作用是利用其分子受激所产生的荧光与磷光的寿命不同获取磷光辐射（书中96页）磷光仪器在荧光仪样品池上增加磷光配件：低温杜瓦瓶和斩光片34室温磷光低温荧光需低温实验装置且受到溶剂选择的限制，1974年后发展了室温磷光（RTP）。1）固体基质室温磷光在室温下以固体基质（如纤维素等）吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。2）胶束增稳室温磷光利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性。3）敏化溶液室温磷光室温磷光35三、荧光分析方法和应用1、荧光分析法分类一、直接荧光法：芳香族有机化合物分析二、间接荧光法（衍生化法和荧光探针法）2、荧光分析法的特点：（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2~4个数量级，检测下限在0.1~0.001μg/mL（2）选择性好荧光法既能依据特定发射，又能依据特定吸收来鉴定物质（3）试样量少和方法简单（4）提供比较多的物理参数三、荧光分析方法和应用1、荧光分析法分类363、应用一、定性分析荧光物质的特征光谱有激发光谱和荧光光谱两种，可以将荧光物质的特征光谱与标准物质的光谱比较，以确定是否为同一物质。二、定量分析定量分析依据F=KC3、应用一、定性分析37三、无机化合物的分析无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定的为数不多，但与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，进行荧光分析的元素达几十种，其中较常采用荧光法测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法。可采用荧光猝灭法间接测定的离子有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等三、无机化合物的分析382.有机化合物的分析脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发荧光的很少，芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。但是为提高荧光分析的灵敏度和选择性，大多数采用荧光衍生化法。3.荧光检测与色谱分离联用4.荧光免疫分析2.有机化合物的分析39化学发光分析一、概述化学发光是吸收化学反应所释放化学能而使分子发光所建立的分析方法化学发光与荧光的主要区别：受激发时所需的能量来源不同，需要化学反应过程中所提供的化学能化学发光分析一、概述40化学发光分析具有以下特点灵敏度高——例：用荧光素酶和三磷酸腺苷ATP的化学发光反应，可测定低至2×10-17mol·L-1的ATP线性范围宽——一般有5~6个数量级仪器设备简单，成本低廉分析速度快，易实现自动化局限性：可供发光用的试剂有限发光机理有待进一步研究化学发光分析具有以下特点灵敏度高——例：用荧光素酶和三磷酸腺41二、化学发光分析的基本原理（一）化学发光反应的基本条件发光反应必须满足以下条件

1.化学反应必须产生足够的化学能化学发光基于化学反应提供足够的能量A+B→C*+D产物接受反应能被激发C*→C+h在可见光区观察化学发光，需170~300kJ·mol-1激发能。具有过氧化物中间产物的氧化还原反应可满足要求。化学反应多是在有O3、H2O2等参加的氧化还原反应中

2.要有有利的化学反应历程。3.处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态二、化学发光分析的基本原理（一）化学发光反应的基本条件42（二）化学发光效率和发光强度1、化学发光效率CL激发态分子的化学效率发光效率（二）化学发光效率和发光强度激发态分子的化学效率发光效率43三、化学发光反应类型1、直接化学发光和间接化学发光（1）直接化学发光A+B→C*+DC*→C+h产物接受反应能被激发三、化学发光反应类型1、直接化学发光和间接化学发光44（2）间接化学发光A+B→C*+DC*+F→F*+EF*→F+h

C*:能量给予体F:能量接收体例：罗丹明B-没食子酸的乙醇溶液测定大气中的O3没食子酸+O3→A*+O2A*+罗丹明B→罗丹明B*+B罗丹明B*→罗丹明B+hmax＝584nm（2）间接化学发光452.气相化学发光——广泛应用于大气污染监测、可监测空气中的O3；NO、NO2；SO2；H2S；CO；乙烯等。在气相中O3能氧化NO、乙烯等产生化学发光，原子氧也能氧化NO、SO2、CO等产生化学发光。例1：NO+O3→NO2*+O2NO2*→NO2+h（≥600nm）常温下产生化学发光，灵敏度可达1ng·mL-1测定范围0.01~10000g·mL-1

例1：CO+O（原子氧）→CO2*CO2*→CO2+h（=300~500nm）灵敏度为1ng·mL-12.气相化学发光——广泛应用于大气污染监测、可监测空气中的O463.液相化学发光研究和应用的比较广泛的有：鲁米诺、光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。鲁米诺是最常用的发光试剂，它可以测定Cl2、HClO、ClO-、H2O2、O2和NO2，产生化学发光反应时量子效率为0.01~0.05鲁米诺（3–氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中和H2O2等氧化剂反应生成最大波长为425nm的光辐射3.液相化学发光47425nm反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处于激发状态，返回基态时发射荧光可检测低至10-9mol·L-1的H2O2425nm反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处于48四、生物发光体系生物发光是化学发光的一种特殊体系，如水母、细菌、真菌、蠕虫还有萤火虫等。虫荧光素+ATP+O2在虫荧光素酶的催化下产生氧虫荧光素+ADP+发光五、电化学发光电解质溶液电解反应所产生的光发射称为电化学发光。四、生物发光体系49分子发光分析法课件50还原型谷胱甘肽(GSH)是一种具有重要生理功能的活性三肽，它由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成，广泛存在于自然界的生物体内，具有保护血管、抗HlV、保护神经、抗惊厥及镇痛等作用。敏度的检测方法的研究仍具有实际意义。本工作利用1，8一蒽二磺酰胺对Hg2+离子的高效选择性，通过加入GSH与Hg2+络合从而使1，8一蒽二磺酰胺荧光增强，据此测定GSH。还原型谷胱甘肽(GSH)是一种具有重要生理功能的活性三肽，它511、实验部分1．1仪器荧光分光光度计，HitachiF一4500型，日本日立公司；自动双重纯水蒸馏器，SZ-93型，上海亚荣生化仪器厂；酸度计，pH孓25型，上海雷磁仪器厂。1．2实验原理1，8一蒽二磺酰胺(以下简称磺酰胺，简写ASA)具有较强的荧光，加入Hg2+离子后，Hg2十与磺酰胺络合使其荧光猝灭。当向Hg2+一ASA体系中加入谷胱甘肽(GSH)时，GSH中的巯基(一SH)与Hg2+络合，释放出与H矿+结合的磺酰胺而使体系的荧光增强，据此达到测定GSH含量的目的，原理见图1。1、实验部分1．1仪器52分子发光分析法课件531．3实验方法1．3．1发射光谱的扫描分别向三支EP管中加入1．58×10-5mol/L磺酰胺溶液100微升，然后向第二支EP管中加入3．94×10-4mol/L的Hg2+溶液5微升，向第三支EP管中加入3.94x10-4mol·L-1的Hg2+溶液5微升和一定量的GSH溶液。分别用pH6．5的Na2HP04一NaH2P04缓冲液定容到1mL，放置5min后，在激发波长为250nm，激发和发射狭缝宽均为5．onm下，扫描发射光谱。最佳激发波长：250nm；最佳发射波长：460nm1．3实验方法542结果与讨论2．1缓冲溶液及其pH的选择在最佳激发波长下，考察了不同pH值的Na2HPO4一NaH2P04、Tris—HCl等缓冲溶液对ASA—Hg2+一GSH体系荧光强度的影响。结果表明：以pH6．5的Na2HPO4一NaH2P04缓冲溶液作介质，体系的荧光强度变化最明显，所以选择在pH6．5的Na2HPO4一NaH2P04缓冲溶液中测定。2结果与讨论2．1缓冲溶液及其pH的选择552．2Hg2+浓度的选择Hg2+的浓度对测定的灵敏度影响较大，因此考察了Hg2+的浓度对磺酰胺溶液荧光强度的影响，结果见图2。2．2Hg2+浓度的选择56分子发光分析法课件572．3反应时间的选择当向ASA中加入Hg2+时，体系的荧光强度迅速降到最低，说明ASA与Hg2+反应迅速。而当加入谷胱甘肽时，由于存在竞争反应，荧光逐渐增强，见图3。由图3可看出，当反应进行6min时，荧光强度达到最大稳定值，所以选反应时间为6min。2．3反应时间的选择58分子发光分析法课件592．4检测谷胱甘肽的线性范围及检测限考察了荧光强度的增强值与GSH浓度之间的关系见图4。谷胱甘肽的存在，夺取了和磺酰胺络合的Hg2+。由图4可看出，随着GSH浓度不断增大，体系荧光信号逐渐增强。荧光强度的增加值与GSH的浓度在5．0×10-5～5．O×10-4mol．L-1范围内呈线性关系，线性方程是△F=7．76866C(GsH)／(10-5mol·L-1)+3．84301，相关系数y是O．99l84。对空白溶液进行11次平行测定，根据3倍于噪声的信号计算，其检测限为4．16×10-6mol．L-1。2．4检测谷胱甘肽的线性范围及检测限60分子发光分析法课件61分子发光分析法课件623结论利用Hg2+离子猝灭磺酰胺的荧光，通过GSH还原荧光的方法来快速测定GSH的含量。实验结果表明该方法简便快速，灵敏度高，可用于实际样品中谷胱甘肽的测定。3结论利用Hg2+离子猝灭磺酰胺的荧光，通过GSH还原荧光63谢谢！请多多批评谢谢！请多多批评64第五章分子发光分析法分析化学

第五章分子发光分析法分析化学65物质分子吸收了一定能量后,其电子由基态跃迁至激发态,当激发态分子以辐射形式将其能量释放返回基态时,便产生分子发光。根据这种现象建立的分析方法称为发光分析法。物质分子吸收了一定能量后,其电子由基态跃迁至激发态,当激66根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：

光致发光：以光源来激发而发光电致发光：以电能来激发而发光生物发光：以生物体释放的能量激发而发光化学发光：以化学反应能激发而发光根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：67分子荧光和磷光分析化学发光分子荧光和磷光分析68一、基本原理1、荧光和磷光的产生室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变为基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象成为“发光”。由于吸收光能而导致的发光称为光致发光。一、基本原理1、荧光和磷光的产生69处于基态的分子吸收能量后发生跃迁：处于基态的分子吸收能量后发生跃迁：70激发态分子的去活化过程

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁（发光）和无辐射跃迁等方式失去能量，称为去活化过程。去活化非辐射跃迁化学反应发射光子振动驰豫内转换系间跨越外转换熄灭或猝灭荧光磷光激发光去除后，磷光不会立即消失激发光去除后，荧光立即消失激发态分子的去活化过程电子处于激发态是不稳定状态，返回基71荧光和磷光体系能级图荧光和磷光体系能级图722、激发光谱和发射光谱激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）激发光谱形状与吸收光谱形状极为相似，经校正后二者完全相同！发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。2、激发光谱和发射光谱激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长73分子发光分析法课件74激发光谱和发射光谱的关系A.Stokes位移B.发射光谱的形状与激发波长无关C.镜像规则激发光谱和发射光谱的关系A.Stokes位移75A.基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似。激发：基态→第一激发态各振动能级，振动能级越高，能级差越大，波长就越短。

发射荧光：从第一激发态的最低振动能级→基态的各振动能级，基态的振动能级越高，其能量差越小，波长就越长。

吸收光谱中能级越高波长越短，发射光谱中能级越高，波长越长。互为镜像A.基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似764043211023404321102377B.基态上的零振动能级与第一激发态的振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。

B.基态上的零振动能级与第一激发态的振动能级之间的跃迁几率最78分子发光分析法课件793、荧光与分子结构的关系（内因）分子荧光产生的必备条件:分子必须具备与所照射的辐射频率相适应的结构吸收激发光的分子必须具有一定的荧光量子产率3、荧光与分子结构的关系（内因）分子荧光产生的必备条件:80影响因素：荧光产生过程中，辐射和无辐射过程；与每一过程的速率常数有关；Kf分子结构决定（内因）；主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。影响因素：荧光产生过程中，辐射和无辐射过程；81荧光与分子结构的关系（外因）（1）跃迁类型：具有电子跃迁类型的结构荧光与分子结构的关系（外因）（1）跃迁类型：具有电子82（2）、共轭效应具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程度越大，越易产生荧光;环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长（红移），发射的荧光强度越强（3）、刚性平面结构—较稳定的平面结构（2）、共轭效应83分子发光分析法课件84（4）取代基效应1）给电子取代剂加强荧光—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN产生p→π共轭相对荧光强度1018202020λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚2）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光（4）取代基效应1）给电子取代剂加强荧光相对荧光强度101885芳环上被F、Cl、Br、I取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。其原因是重原子的电子自旋和轨道运动间的相互作用变大，原子核附近产生磁场，使单重态向多重态系间跨越的几率增加。芳环上被F、Cl、Br、I取代后，使系间窜跃加强，磷光增强86分子发光分析法课件87分子发光分析法课件88(2)影响荧光强度的因素溶剂的影响（增大溶剂的极性荧光增强）温度的影响酸度的影响（芳香族化合物的官能团，金属与有机试剂螯合）内滤光和自吸收现象散射光的影响(2)影响荧光强度的因素溶剂的影响（增大溶剂的极性荧光增强）89(3)溶液荧光的猝灭

荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低或荧光强度不与浓度成线性关系的现象称为荧光猝灭。能引起荧光猝灭的物质叫荧光熄灭剂碰撞猝灭M+hv→M*,M*+Q→

M+热静态猝灭M+Q→

MQ非荧光物质转入三重态的猝灭引入碘、溴后，易发生体系间跨越荧光物质的自猝灭荧光物质浓度较高发生电荷转移反应的猝灭(3)溶液荧光的猝灭荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子90二、荧光（磷光）光谱仪荧光分光光度计的主要部件：光源、激发单色器、发射单色器、样品池、检测系统、显示系统。光源激发单色器样品池发射单色器检测器放大器指示器·记录器与分光光度计有两点不同：①两个单色器②检测器与激发光成直角二、荧光（磷光）光谱仪荧光分光光度计的主要部件：光源、激发单911.光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射365nm、405nm、436nm三条谱线以365nm的谱线最强应用最广泛的一种光源，可发射250~800nm很强的连续光源1.光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；922、单色器第一单色器作用：激发单色器，分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长ex。第二单色器作用：发射单色器，滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长em。2、单色器第一单色器作用：激发单色器，分离出所需要的激发光，933、样品池通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边。4、检测器荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管3、样品池94SK-2003A型荧光光谱仪(国内首创）SK-2003A型荧光光谱仪(国内首创）95磷光分析法与荧光相比，磷光的特点：1、磷光寿命比荧光长2、磷光辐射的波长比荧光长（一）磷光强度：Ip＝KC（二）温度对磷光强度的影响试样需在液氮温度（77K）或液氦（4K）下测定磷光分析法与荧光相比，磷光的特点：96磷光分析仪器与荧光分析仪器相似，主要差异如下：1.试样室试样需在液氮温度（77K）或液氦（4K）下测定－低温磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）

固体表面室温磷光分析需特制试样室2.磷光镜有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械切光装置——磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。磷光分析仪器与荧光分析仪器相似，主要差异如下：97磷光仪器在荧光仪样品池上增加磷光配件：低温杜瓦瓶和斩光片。如右图所示。斩光片的作用是利用其分子受激所产生的荧光与磷光的寿命不同获取磷光辐射（书中96页）磷光仪器在荧光仪样品池上增加磷光配件：低温杜瓦瓶和斩光片98室温磷光低温荧光需低温实验装置且受到溶剂选择的限制，1974年后发展了室温磷光（RTP）。1）固体基质室温磷光在室温下以固体基质（如纤维素等）吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。2）胶束增稳室温磷光利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性。3）敏化溶液室温磷光室温磷光99三、荧光分析方法和应用1、荧光分析法分类一、直接荧光法：芳香族有机化合物分析二、间接荧光法（衍生化法和荧光探针法）2、荧光分析法的特点：（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2~4个数量级，检测下限在0.1~0.001μg/mL（2）选择性好荧光法既能依据特定发射，又能依据特定吸收来鉴定物质（3）试样量少和方法简单（4）提供比较多的物理参数三、荧光分析方法和应用1、荧光分析法分类1003、应用一、定性分析荧光物质的特征光谱有激发光谱和荧光光谱两种，可以将荧光物质的特征光谱与标准物质的光谱比较，以确定是否为同一物质。二、定量分析定量分析依据F=KC3、应用一、定性分析101三、无机化合物的分析无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定的为数不多，但与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，进行荧光分析的元素达几十种，其中较常采用荧光法测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法。可采用荧光猝灭法间接测定的离子有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等三、无机化合物的分析1022.有机化合物的分析脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发荧光的很少，芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。但是为提高荧光分析的灵敏度和选择性，大多数采用荧光衍生化法。3.荧光检测与色谱分离联用4.荧光免疫分析2.有机化合物的分析103化学发光分析一、概述化学发光是吸收化学反应所释放化学能而使分子发光所建立的分析方法化学发光与荧光的主要区别：受激发时所需的能量来源不同，需要化学反应过程中所提供的化学能化学发光分析一、概述104化学发光分析具有以下特点灵敏度高——例：用荧光素酶和三磷酸腺苷ATP的化学发光反应，可测定低至2×10-17mol·L-1的ATP线性范围宽——一般有5~6个数量级仪器设备简单，成本低廉分析速度快，易实现自动化局限性：可供发光用的试剂有限发光机理有待进一步研究化学发光分析具有以下特点灵敏度高——例：用荧光素酶和三磷酸腺105二、化学发光分析的基本原理（一）化学发光反应的基本条件发光反应必须满足以下条件

1.化学反应必须产生足够的化学能化学发光基于化学反应提供足够的能量A+B→C*+D产物接受反应能被激发C*→C+h在可见光区观察化学发光，需170~300kJ·mol-1激发能。具有过氧化物中间产物的氧化还原反应可满足要求。化学反应多是在有O3、H2O2等参加的氧化还原反应中

2.要有有利的化学反应历程。3.处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态二、化学发光分析的基本原理（一）化学发光反应的基本条件106（二）化学发光效率和发光强度1、化学发光效率CL激发态分子的化学效率发光效率（二）化学发光效率和发光强度激发态分子的化学效率发光效率107三、化学发光反应类型1、直接化学发光和间接化学发光（1）直接化学发光A+B→C*+DC*→C+h产物接受反应能被激发三、化学发光反应类型1、直接化学发光和间接化学发光108（2）间接化学发光A+B→C*+DC*+F→F*+EF*→F+h

C*:能量给予体F:能量接收体例：罗丹明B-没食子酸的乙醇溶液测定大气中的O3没食子酸+O3→A*+O2A*+罗丹明B→罗丹明B*+B罗丹明B*→罗丹明B+hmax＝584nm（2）间接化学发光1092.气相化学发光——广泛应用于大气污染监测、可监测空气中的O3；NO、NO2；SO2；H2S；CO；乙烯等。在气相中O3能氧化NO、乙烯等产生化学发光，原子氧也能氧化NO、SO2、CO等产生化学发光。例1：NO+O3→NO2*+O2NO2*→NO2+h（≥600nm）常温下产生化学发光，灵敏度可达1ng·mL-1测定范围0.01~10000g·mL-1

例1：CO+O（原子氧）→CO2*CO2*→CO2+h（=300~500nm）灵敏度为1ng·mL-12.气相化学发光——广泛应用于大气污染监测、可监测空气中的O1103.液相化学发光研究和应用的比较广泛的有：鲁米诺、光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。鲁米诺是最常用的发光试剂，它可以测定Cl2、HClO、ClO-、H2O2、O2和NO2，产生化学发光反应时量子效率为0.01~0.05鲁米诺（3–氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中和H2O2等氧化剂反应生成最大波长为425nm的光辐射3.液相化学发光111425nm反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处于激发状态，返回基态时发射荧光可检测低至10-9mol·L-1的H2O2425nm反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处于112四、生物发光体系生物发光是化学发光的一种特殊体系，如水母、细菌、真菌、蠕虫还有萤火虫等。虫荧光素+ATP+O2在虫荧光素酶的催化下产生氧虫荧光素+ADP+发光五、电化学发光电解质溶液电解反应所产生的光发射称为电化学发光。四、生物发光体系113分子发光分析法课件114还原型谷胱甘肽(GSH)是一种具有重要生理功能的活性三肽，它由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成，广泛存在于自然界的生物体内，具有保护血管、抗HlV、保护神经、抗惊厥及镇痛等作用