基因工程菌发酵工艺过程与操作技术

4.4工程菌发酵的工艺过程与操作技术工程菌的筛选与鉴定发酵培养4.4.2操作技术生产菌种建立灭菌工艺培养基的4.4.1工艺过程4.4.2.1

生产菌株的建立（1）生产菌的自然分离来源：大陆土壤、海洋水体样品 ：表层土壤（0－10cm），海洋（0－100m）预处理：根据分离目的和微生物的特性。①温度：较高温度（40－120℃）处理几十分钟至几小时，甚至几天，可分离到不同种类的放线菌。②化学试剂SDS－酵母膏，CaCO3、NaOH处理，减少细菌，有利于放线菌分离；乙酸乙酯、氯仿、苯处理，除去真菌。③离心、膜过滤适宜的培养基：满足微生物营养需要和pH条件添加抑制剂，有利于目标微生物的富集。加入抗真菌试剂和抗细菌抗生素，可以富集放线菌。分离方法：①稀释法：用无菌水、生理盐水、缓冲液等稀释后涂布平板。②

滤膜法：0.22

－0.45

µm。细菌在膜上，放线菌菌丝可

，进入培养基。培养条件：温度放线菌：25－30℃，32－37℃，45－50℃；7－14天至1月。活性测定非致病菌为对象，采用琼脂扩散法测定活性，筛选生物活性物质。可以使用耐药和超敏菌种。HPLC、LC－MS等分析鉴定活性物质。其他现代的筛选技术如靶向筛选、高通量筛选、高内涵筛选等可以结合使用。自然选育诱变育种杂交育种•工程技术育种分子定向育种组合生物（2）菌种选育定义：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。常用方法：单菌落分离应用：工业上生产的所有菌种几乎都是诱变后得到的突变株。过程：（2）菌种选育-自然选育的目的。缺点：生

比野生菌株弱，遗传特性不稳定，效率低，增产幅度不会很大。优点：简单易行，可达到纯化菌种、防止、稳定生产水平和提高产量定义：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种发生变异，从中筛选优良

，淘汰劣质

。特点：速度快、收效大、方法相对简单。缺点：缺乏定向性，要配合大规模的筛选工作。诱发突变因素：物理、化学和生物。物理因素包括各种射线，紫外线、快中子、X射线、R射线、激光、太空射线等。化学因素包括碱基类似物；与碱基发生反应的物质；DNA嵌合剂，亚硝酸等。生物因素包括噬菌体、质粒和转座子等。（2）菌种选育-诱变育种诱变育种方案的设计整个过程涉及出发菌株的选择、诱变处理和筛选突变株三个阶段，甚至不断多轮重复。①出发菌株的选择出发菌株是用于诱变的原始菌株，对提高育种效率有重要意义。选择依据：（a)

出发菌株的稳定性，尽量挑选纯系菌株，以排除异核体系与异菌株，因此出发菌株需要通过自然选育进一步纯化。选用具备某种优良特性的菌株。选用对诱变剂敏感的菌株，以提高突变频率。菌种的生理状态及生长发育时间，因为诱变剂对处于转录或翻译状

态的菌种效应要比 或休眠状态的菌种敏感得多。细菌处于营养体比出于对数生长期的菌体为佳。真菌和放线菌则以它们的孢子，或出于刚开始萌发状态的孢子为佳。为了保证菌体和诱变剂均匀接触，出发菌株必须

成单细胞（孢子）悬浮液，严格控制单孢子的分散度在95%以上。②诱变处理：多种诱变剂交叉使用，合理组合。中等剂量（80％致死率，既能增加变异范围，又有大量的正向变异

）。有随机筛选和半理性化筛选2种。

其中通过添加一定的选择压（如抗生素、基质浓度等，或生理作用），效果显著。目标菌株：高产，生长速度快，产孢子多，有效利用廉价碳源等。③筛选突变株（2）菌种选育-杂交育种定义：两个不同

型的菌株通过接合或原生融合使遗传物质重新组合，从中分离筛选出具有优良性状的新菌株。特点：有一定的定向性。种类：体细胞重组接合原生

融合采用

工程技术即克隆与表达技术，过量表达或抑制表达某一个或一组目标产物的高效表达。，调控代谢过程，实现一般希望外源

整合到

中，以便稳定遗传。在传统抗生素、氨基酸、维生素发酵的育种中具有重要意义。（2）菌种选育-工程技术育种（2）菌种选育-分子定向育种概念：在分子水平，体外模拟自然进化机制，是突变、重组、选择的重复循环。获得有益突变，淘汰有害突变，使进化向有益的方向发展。原理与操作过程：突变：产生多样性。随机突变，诱变重组：产生新功能。同源重组，非同源重组选择和筛选：表面展示，活性检测野生型随机突变1－2循环，积累有益突变。多轮循环，组合有益突变，消除有害突变。组shuffling技术①

随机突变获得单个性状优良的菌株②

多个菌株的原生

混合、融合、再生，形成第一个融合库（F1）③ 再次重复循环融合，得到融合库F2、F3、F4④筛选鉴定关键是起始突变体的选择、遗传重组的效率、选择方法的灵敏性。已经在泰乐霉素生产菌的改造、蛋氨酸生物途径的进化等方面取得明显效果。概念：将控制不同产物的生物进行有矢组合，形成新的模块，从而新化合物。例如，国外学者Yeo

Joon

Yoon等人利用委内瑞拉链霉菌产生的苦霉素系统，把编码PikAⅣ的 敲除，并将泰乐霉素的TylGⅤ

利用质粒为载体，转入PikAⅣ敲除的变异株，使来源于和质粒的互补产生杂交的酶系统了新的大环内酯类物质，其具有明显的生物活性，能显著抑制枯草芽孢杆菌的生长。（2）菌种选育-组合生物小结生产菌的分离：自然分离与筛选菌种选育：自然选育、诱变育种、杂交育种、定向育种习题如何进行生产菌的分离与筛选？比较各种菌种选育方法的优缺点。4.4.2.2

培养基的培养基（medium）是按一定比例人工配制的供微生物生长繁殖和 各种代谢产物所需要的多种营养物质的混合物。培养基为 工程菌提供了渗透压、pH值等营养作用以外的其他生长所必需的环境条件。培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量等。(1)培养基的成分(2)培养基的种类(3)培养基质量的控制(4)制药生产用培养基的配制培养基的制备（1）培养基的成分碳源氮源无机盐和微量元素水生长因子前体与促进剂消泡剂概念：凡是构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称为碳源。作用：为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物质和代谢产物的 提供碳骨架。种类：糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜脂肪：豆油、棉籽油和猪油醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白类：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖类、有机酸迟效碳源：酪蛋白水解产生的脂肪酸碳源(carbon

sources)概念：凡是构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质均称为氮源。作用：为生长和代谢主要提供氮素来源。种类：氮源（nitrogen

sources）有机氮源无机氮源概念：生理活性物质的组成成分或具有生理调节作用。作用方式：低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。种类：盐离子磷、硫、钾、钠、镁、钙，常常添加；

铁、锌、铜、钼、钴、锰、氯，一般不加微生物对磷酸盐的需要量较大，但在不同阶段是不同的。微生物生长的磷酸盐对次级代谢产物 有重要影响。对于特殊的菌株和产物，不同的元素具有独特作用。无机盐（mineral

salt）和微量元素(trace

element）菌体细胞的主要成分营养传递的介质良好导体，调节细胞生长环境温度培养基的主要成分之一。水（water)概念：微生物生长不可缺少的微量有机物，不起碳氮源的作用。包括氨基酸、维生素、核苷酸、脂肪酸等。一般天然成分中含有，无需添加。对于营养缺陷型（氨基酸、核苷酸）菌株，必需添加。生长因子(growth

factor)概念：加入到发酵培养基中的某些化合物，被直接参与产物的生物组成产物分子的一部分，而自身的结构没有发生多大的变化。作用：明显提高产品产量和质量，一定条件下还能控制菌体代谢产物的方向。添加方式：

性，被菌体分解，多次少量流加工艺。前体可以是产物的 ，也可以是其中的一部分。前体（precursor）概念：是促进产物生成的物质，加入后能提高产量。但不是营养物，也不是前体的一类化合物。作用：诱导产物生成、促进产物由胞内 到胞外。种类：氯化物有利于灰黄霉素、金霉素

。表面活性剂吐温、 剂，脂溶性小分子化合物等。促进剂（accelerant

）概念：

降低 的液膜强度和表面黏度，使合物。破裂的化种类：表面活性剂，低表面张力，天然动植物油脂类高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯类、聚醚类、硅酮类）作用：消除 ，防止逃液和染菌。消泡剂（defoaming

agent）按用途分类：选择性、鉴别性、富营养培养基按物理性质分类：固体，半固体，液体培养基按组成分类：

，天然，半 培养基按发酵过程中所处位置和作用分类：斜面或平板固体培养基、培养基、发酵培养基、补料培养基。特殊用途的培养基：分离纯化培养基、原生 再生培养基、鉴别培养基、生物检测培养基（测定抗生素生物效价）。（2）培养基的种类①固体培养基（solid

medium）细菌和酵母的固体斜面或平板培养基，链霉菌和丝状真菌的孢子培养基。：液体培养基添加1.0-2.0%琼脂粉。作用：提供菌体的生长繁殖，形成孢子。质量要求：单细胞培养基：营养丰富，满足菌体生长迅速，不能引起变异。孢子培养基：基质浓度较低，无机盐浓度适量，以利于孢子形成。营养不宜太丰富，否则不易产生孢子。概念：供孢子发芽和菌体生长繁殖，包括摇瓶和一级、二级罐培养基，为液体。扩大培养，增加细胞数目，生长形成强壮、健。作用：使康和高活性的质量要求：培养基成分必须完全，营养丰富。含有速效性、容易被利用的碳、氮源和无机盐等，但总体浓度不宜高。培养基要与发酵培养基相适应，主要成分接近，不能差异太大。缩短发酵的延滞期。②

培养基（seed

medium）概念：提供微生物进行目标产物发酵生产的培养基。作用：不仅要满足菌体的生长和繁殖，还要满足菌体目标产物，是发酵生产中最关键和最重要的培养基。质量要求：组成丰富完整营养物质浓度和粘度适中不同菌种和不同产物，对培养基的要求差异很大，组成和配方需要优化③发酵培养基(fermentation

medium)概念：发酵过程中添加补充的培养基。作用：稳定工艺条件，有利于微生物的生长和代谢，延长发酵周期，提高目标产物产量组成：各种必要的营养物质，碳源、氮源、前体

：按单一成分配制，各自独立控制，或按一定比例制成复合补料培养基。经常采用前期培养基稀薄一些，从一定时间开始，间歇或连续补加各种必要的营养物质，如碳源、氮源、前体等。④补料培养基(fed

medium）控制培养基原料的质量控制水质控制培养基的黏度控制灭菌操作(3)培养基质量的控制①控制培养基原料的质量条件不同而质来源、种类和纯度。来源丰富、价格低廉、质量稳定、纯度达标。农产副品：因品种、产地、加工、量差异较大。化学原料：杂质含量也不相同。措施：保持稳定的原料来源。原料的选择试验：对原料进行试验，选择满足发酵要求的来源。更换原料时，必需再进行一系列试验，确保产量和质量的控制和稳定性。碳氮浓度与配比：适宜（

碳源过多，有机酸形成多，pH降低；碳源过少，引起菌 老和自溶。氮源过多，营养生长过旺，pH偏高，不利于产物积累；反之，氮源不足，菌体量生长少，也会影响产物生产。）速效和缓效成分：相互配合，发挥综合优势。pH：配制时加入酸碱性物质搭配，甚至使用缓冲剂。目标 表达载体调控原件的影响：lac启动子，葡萄糖产生阻遏效应，乳糖有诱导效应。trp启动子，色氨酸有调控作用。葡萄糖为碳源时，代谢副产物较多，酪蛋白水解物有利于产物的

与

。培养基配制的注意事项水是培养基的主要成分，恒定水源和恒定的水质很重要。深井水、自来水、地表水、蒸馏水。对水质定期化验检查，使用符合要求的水质配制各种培养基。措施：检测和控制水质参数。水质的主要参数包括pH、溶解氧、可溶性固体、污染程度、各种矿物特别是重金属的种类和含量。优良 工程菌有时不能高产，可能是劣质水造成的，生产中要注意。菌种和

培养基可以用蒸馏水，而生产用水必需使用超纯水，可避免相应的污染。②控制水质③控制培养基的黏度对发酵的影响：高黏度的培养基，不易彻底灭菌影响发酵的通气搅拌等物理过程直接影响菌体对营养的利用目标产物的分离提取造成措施：固体不溶性成分，淀粉、黄豆粉等增加培养基的黏度，生产中可用精料发酵、基础原料用酶水解，降低大分子物质，或补加灭菌水，来降低黏度。④控制灭菌操作高压蒸汽灭菌影响培养基的有效成分甚至是活性。糖类物质在高温灭菌时产生焦化现象，营养成分破坏，甚至产生物质。产生的有色物质相对分子质量较大，引起微生物代谢途径的改变。糖类应单独湿热灭菌，基本消除焦化现象。磷酸盐与碳酸钙、镁盐、铵盐也能反应，生成沉淀或配位络合物，降低了对磷酸根和铵离子的利用。维生素、蛋白质等在高温下被分解破坏、失活。灭菌引起培养基的pH变化。培养基设计一般原则培养基设计基本思路理论计算与定量配制优化(4)制药生产用培养基的配制①培养基设计一般原则生物学原则：根据不同微生物的营养和反应需求，设计培养基。营养物质组成较丰富，浓度适当，满足菌体生长和

产物的需求，酸碱性物质搭配，具有适宜的pH和渗透压。各种成分之间比例恰当，特别是有机氮和无机氮源，C/N比适宜。一定条件下各种原材料之间不能产生化学反应。工艺原则：不影响通气和搅拌，不影响产物的分离精制和废物处理，过程容易控制。低成本原则：原材料要因地制宜，来源方便，丰富，质量稳定，质优价廉，成本低。高效经济原则：生产安全，环境保护，高质量，最高得率，最小副产物。起始培养基：根据他人的经验和沿用的成分。单因素实验：确定最适宜的培养基成分。多因素实验：各成分之间浓度优化和最佳配比。正交试验、响应面法、遗传算法等放大实验：摇瓶、小型发酵罐，到中试，最后放大到生产罐。综合考虑各种因素，产量、纯度、成本等后，确定一个适宜的生产配方。②培养基设计基本思路③理论计算和定量配制微生物生长和生产可用下列表达式表示：碳源和能源＋氮源＋其他营养物质→细胞＋产物＋CO2＋H2O＋热量如果能进行定量表达，可计算得到一定细胞生物量所需最小的营养物质。如果已知生物量与产物之间的特殊表达关系，可计算获得一定产量的最小底物浓度。初步计算培养基配方：参考微生物的化学和元素组成。由于培养基成分的复杂性和所起作用的差异，一般针对碳源和氮源进行转化率计算和分析。转化率是单位质量的原料生产的产物量或细胞量。理论转化率是理想状态下，根据代谢途径的物料衡算结果，实际转化率是发酵过程中实际测量得到的数值。理论转化率高于实际转化率，而使实际转化率靠近理论转化率是发酵控制的最终目标。理论衡算是建立代谢过程非常清楚的基础之上，但实际上很困难，所以需要对代谢过程简化后，基于代谢通量定量计算。④优化由于培养基成分的复杂，目前还无法从生化反应的基本原理来推断和计算出最佳培养基配方。根据生理学和生物化学的基本理论参照前人所用的经验培养基结合菌的特殊生物学和产品特征要求

一种好的培养及配方应随菌种的改良，发酵控制条件和发酵设备的变化而作相应调整。小结培养基组成与作用：C、N、无机盐和微量元素、水、生长因子、前体与促进剂、消泡剂培养基种类：固体、 、发酵、补料培养基培养基质量控制：原料、水质、培养基黏度、灭菌操作生产用培养基

：原则、思路、优化习题培养基组成成分有哪些，有何作用？前体的定义及其作用，发酵过程中采用怎样的策略，为什么？消泡剂的的定义、种类及其作用。简述如何进行培养基的质量控制。培养基原料进行选择时要应注意什么，为什么？为什么要进行原料选择实验，实验过程中要注意什么？简述制药生产用培养基配制的一般原则和设计基本思路，如何研制生产用培养基？4.4.2.3

灭菌工艺①杂菌：除生产菌以外的任何微生物。②

污染：

杂菌的培养或发酵体系。制药工业发酵时纯种发酵，污染会带来严重的。杂菌消耗营养物质，干扰发酵过程，改变培养条件，引起溶解氧和培养基黏度等变化；还会

一些

物质，抑制生产菌生长；杂菌 酶，分解目标产物或使之失活，产量大幅度下降；噬菌体的污染引起溶菌；杂菌污染直接影响后续工序的有效进行，甚至是产品的质量。③到：指用物理或化学方法杀灭或清除病原微生物，达程度的过程，只能杀死营养体，而不能杀灭芽孢体，杀灭率99.9%以上。④杀菌：杀灭或清除病所有微生物的过程，杀灭率99.9999%以上⑤灭菌：是指用物理或化学方法杀灭或清除物料或设备中所有生命物质，达到无活微生物存在的过程，微生物杀灭率99.999999%以上。灭菌包括培养基、发酵设备及局部空间的彻底灭菌、通入空气的净化除菌。。化学灭菌概念：用化学物质杀灭生物细胞的灭菌操作。常用化学灭菌剂：氧化剂类，卤化物类，有机化合物。机理：使蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性，细胞应用：主要适合用于皮肤表面、器具、 和工厂的无菌区域的台面、地面、墙壁及局部空间或某些器械的。灭菌方法与原理物理灭菌使用各种物理条件如高温、辐射、超声波及过滤等进行灭菌。效果好，操作方便，广泛使用。物理灭菌——紫外线等射线：局部灭菌、表面灭菌。常用于一定空间的空气灭菌，如无菌室、超净工作台等的灭菌。物理灭菌——干热灭菌：机理：在高温120℃以上，蛋白质、酶、核酸、生物膜等生物大分子变性、凝聚破坏，甚至是降解，生物细胞破裂，内容物

，生物体

。对于干热灭菌，足够长的时间和足够高的温度，都可以杀灭生物体。干热灭菌效果没有湿热灭菌好，工业采用160℃、2h，或170℃、1h干热空气。温度越高，时间相应缩短。应用：常用的器皿（如培养皿、三角瓶等玻璃器皿和接种针等金属用具），也适用于工业要求灭菌后保持干燥状态的物料（如细胞固定化载体、填料等）。物理灭菌——高压蒸汽灭菌：高压条件下，热力强。湿热灭菌效果优于干热灭菌。由于蒸汽价格低廉，来源方便，效果可靠，操作控制简便，因此湿热灭菌常用于培养基和设备容器的灭菌。常用条件为115℃～121℃，压力1×105Pa，维持15～30分钟。设计灭菌操作时，经常以杀死芽孢的温度和时间为指标。为了确保彻底灭菌，实际操作中往往增加50％的保险系数。灭菌过程中，高温会使营养成分受到一定程度破坏。高温短时灭菌可达到相同灭菌效果，而营养物质破坏大大减少。有些培养基成分受热容易分解破坏，不能使用蒸汽灭菌，怎么办？过滤灭菌：受热易分解的成分，0.22μm,

溶液过滤除菌高压蒸汽灭菌是生产中常用的培养基灭菌方法，但控制不当，很容易直接影响培养基的有效成分含量甚至活性。较高温度下长时间灭菌，一方面营养成分会破坏，另一方面高温产生有害物质（糖焦化），此外，培养基pH也发生变化。培养基的灭菌操作微生物受热 过程的一级动力学反应：－dX/dt=kdX微生物浓度与灭菌时间成正比，浓度越高，灭菌时间越长。灭菌时间与比 速率之间的关系：kd与微生物种类、生理状态、灭菌温度有关。以杀死芽孢的温度和时间为指标。确保彻底灭菌，实际操作中增加50％的保险系数。①分批灭菌操作（间歇灭菌或实罐灭菌）概念：将配制好的培养基输入发酵罐内，直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一段时间，再冷却至发酵要求的温度。特点：培养基与发酵罐一起灭菌，不需其他附属设备，操作简便，国内外常用。缺点：加热和冷却时间较长，营养成分有一定损失，罐利用低。适合小批量生产规模。分批灭菌操作的工艺过程排放夹套或蛇形管中冷水，开启排气阀，由空气管通入蒸汽，对培养基加热。夹套通入蒸汽进行间接加热。在70℃左右，从取样管、放料管通入蒸汽，关闭夹套阀门。在120℃，罐压1*105Pa时，打开接种管、补料管、消沫管、酸碱管等阀门，进行排气，并调节进蒸汽和排气量，进行保温维持。料液下的管道都应通入蒸汽，料液上的的管道都应排放蒸汽。达到121℃开始计算维时间，生产中常用30min。保温结束后，依次关闭排气、进气阀门。罐压低于空气压力后，通入无菌空气，以维持罐压，夹套通入冷却水快速冷却，以减少营养物质的破坏，使培养基降到所需温度。灭菌时间夹套、蛇管中通入蒸汽直接加热，或在培养基中直接通入蒸汽加热75%20%5%分批灭菌时间包括加热升温、保温和降温冷却三个阶段，灭菌主要在保温阶段实现，但升温和降温阶段也有一定贡献。

每个阶段的贡献大小取决于升温和降温时间，时间越长，贡献越大。消耗蒸汽体积：对于热量计算，涉及所需蒸汽量。可用温度、传热系数、培养基质量、比热、换热面积进行衡算。空罐灭菌的消耗蒸汽体积为罐体积的4－6倍。通常以耐热芽孢杆菌为对象，根据微生物浓度和比速率计算灭菌时间。总体完成灭菌的周期约3-5h。概念：培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。高温短时灭菌操作：培养基与高压蒸汽直接混匀，达到灭菌温度（130-140℃）。加热升温、维持灭菌温度和冷却降温三个阶段由不同设备执行：②连续灭菌操作（连消）加热器：塔式加热器：一根多孔蒸汽导管和套管组成。培养基从下端进入，流速0.1m/s，蒸汽从塔顶进入，从小孔中喷出，与培养基激烈混合。塔高2－3m，培养基的停留时间20－30s。喷射式加热器：培养基从中间管进入，蒸汽从料管周围的环隙进入，在喷嘴处快速混合。国内大多数企业采用。保温设备：维持罐和管式维持器两种。用保温材料不直接通入蒸汽。，维持罐：料液从维持罐上端连续通入到罐底，维持一定时间后，靠罐压流入冷却器。返混严重。管式维持器：蛇管状，培养基在管内处于湍流区，活塞流动状态，返混为零。冷却器：喷淋式冷却器为主，还有螺旋板式换热器，板式换热器，真空冷却器等。连续灭菌操作流程图连续灭菌操作的工艺过程配料：配料罐，配制培养基。预热罐：定容和预加热。70-90℃。加热器：预热的培养基与蒸汽混合，快速升温达到灭菌温度，130-140℃。维持罐：维持培养基的一定的保温灭菌时间。一般数分钟。冷却管：从维持罐出来的料液进入冷却管冷却至40-50℃，输入灭菌底发酵罐中。采用高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少；热能利用合理，易于自动化控制；连续灭菌的缺点：不适合粘度大或固形物含量高的培养基的灭菌；增加了连续灭菌设备及操作环节，增加染菌几率。对压力要求高，不小于0.45

MPa，一般为0.45-0.8

MPa。发酵罐利用率低；连续灭菌的优点：③空气过滤灭菌发酵工业中，大多采用过滤介质灭菌方法 无菌空气。微生物体积很小，空气中附着在尘埃上的微生物大小为0.5-5μm。过滤介质可以除去游离的微生物和附着在其他物质上的微生物。原理:空气通过过滤介质时，颗粒在离心场产生沉降，同时惯性碰撞产生摩擦黏附，颗粒的布朗运动使微粒之间相互集聚成大颗粒，颗粒接触介质表面，直接被截留。气流速度越大，惯性越大，截留效果越好。惯性碰撞截留起主要作用，另外静电引力也有一定作用。膜过滤技术已得到发展，膜过滤器也用来空气除菌。常用的滤膜有硝酸纤维酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龙膜等。其原理在于微生物和微粒（约0.5-20μm）等大于滤膜的网眼直径(0.3μm)，被直接截留于表面。沉降作用和静电吸附