BD-BACTEC呼吸代谢法助力无菌快检

BACTEC呼吸代谢法助力药品微生物快速无菌检测倪in.NI@©

2018

BD药典无菌检查法Pharmaceutical

Sterility

Testing⚫

CHP1101;USP71;EP2.6.1⚫

将待检材料放入适当的培养基中，在一定条件下培养一定时间，观察肉汤有否变混浊，以此判断是否有微生物生长。⚫

方法：薄膜过滤法或直接接种法检测对象培养基英文名称培养条件20～25℃14天+3天胰蛋白大豆液体培养Soybean-Casein

DigestMedium/Tr

yptic

Soy

Broth/Trypticase

SoyBroth真菌需氧菌基（TSB）液体硫乙醇酸盐培养需氧菌厌氧菌30～35℃*14天+3天基FluidThioglycolateMedium（FTM）*生物制品另置一份于20～25℃2©

2018

BD.微生物快速检验法

（RMM）Rapid

MicrobiologicalMethods常规方法微生物快速检验法培养时间⚫

100%

基于微生物生长⚫

目视检查生长微生物检测项目常规RMM微生物限度5-7天3天⚫

这意味着你必须耐心等待结果⚫

报告时间

=

样本运送到实验室

管理时间无菌检查14-17天3-5天7天有/无污染(IPC)

14-28天

样本准备内毒素检查微生物鉴定支原体检查1小时7天15分钟

样本培养

分析时间

核查时间

批准时间

报告结果快速方法45样本/次3-26小时28天7天3©

2018

BD.RMM相关法规及指南FDA鼓励采用RMM:⚫

2012年６月４日颁布的美国联邦法规21章600,

610和680款修正案⚫

该规定修改了对

CFR

21章Ｆ分章600-680款规定下大部分生物制品的无菌性要求ICHQ2(R1)分析方法验证⚫方法验证概括性指南⚫

促进无菌检查方法的改进和创新，给予生产商进行无菌检查时的灵活性⚫

鼓励生产商在无菌检查方法中采用先进的科学技术⚫

对验证参数信息的要求取决于方法类型USP通则<1223>⚫

微生物检验替代方法验证EP通则5.1.6⚫

微生物质量控制替代方法⚫

验证用作药典微生物检验方法的替代方法的指南⚫

讨论微生物检验方法变异性和与药典方法可比性方面所面临的挑战⚫

如果微生物检验替代方法能节约微生物检验的成本，同时提高对药品质量的保证，应推动实施和使用PDA

TR33微生物快速检验法和替代方法⚫

讨论微生物检验方法所面临的挑战：获得结果时间长，可能无法恢复微生物生长，尤其在不利环境中和休眠状态下《中国药典》2015年版

四部通则9201⚫

药品微生物检验替代方法

验证指导原则⚫

一般要求⚫

方法验证的概括性指南⚫

微生物学与QbD和质量风险管理原则⚫

指导文件，政策和法规变化，验证预期⚫

RMM的价值,

不断改进和风险⚫

对验证参数信息的要求取决于方法类型⚫

微生物定性检验方法验证⚫

微生物定量检验方法验证4©

2018

BD.RMM是制药企业实现最高质量、最短前置时间和最低成本的手段质量QC实验室自动化和效率缩短前置时间有风险时可选择不生产自动化快速确保缩短产品放行检验周期(条码监测自动读取)低或无生物负荷提高过程控制效率

–转换成FTE(频繁或实时监测)快速解决问题的工具/协助调查RMM可对微生物进行客观分析现场检测(排除人为因素)5©

2018

BD.企业的RMMs应用•

GeneDisc®

Cycler专属性、检查限、耐用性等2010年FDA批准Milliflex®Quantum15个环境菌+7个ATCC标准菌BDBACTECTMUSP

<1223>;

PhEur5.1.6;

PDATechnicalReport

#33;

四种属性验证2012年巴西FDA批准6©

2018

BD.药典无菌检查法面临挑战➢时间过长——不能实时发现产品生产过程中发生的污染，不能使产品快速放行，增加仓储时间和成本；➢无法快速复苏——微生物养分被剥夺，或抗菌剂（防腐剂、消毒剂、高温蒸汽）的浓度达到亚致死量，传统培养基上无法复制培养。➢灵敏度不高——通过肉眼观察，人为因素所占比重较高对开发出更快、更准的微生物快速检测技术有迫切需求。7©

2018

BD.药典无菌检查法替代方法的探索➢电阻抗技术——食品行业应用较多，培养基基质干扰严重，污染菌数较少时，结果不稳定➢二氧化碳比色——灵敏度较高，早在2004年，美国Genzyme就获得了FDA的批准，在无菌测试中应用该方法；➢ATP生物发光——主要用于限度实验和环境监测，基质中ATP会干扰计数结果，造成灵敏度不够高➢流式细胞技术；可以快速检测的方法，但硬件投入较大，对于基质的要求相对较高，高背景干扰导致LOD无法与药典无菌检查法相一致CO2比色技术由于干扰少，灵敏度较高，成为无菌替代方法中的首选8©

2018

BD.USP快速无菌检测❑

2017.10月药典论坛发布促进文章---USP专家委员会考虑加入快速无菌测试❑

2018.10月药典论坛发布《1071

rapidsterilitytesting

ofshort-lifeproducts:a

risk-based

approach》短寿命产品的快速无菌测试：一种基于风险的方法9©

2018

BD.快速无菌测试的候选技术10©

2018

BD.无菌检测发展趋势传统比色法血培养仪集菌仪套筒替代方法实时动态荧光增强技术⚫

一致性次世代⚫

快速⚫

免维护11©

2018

BD.技术局限：传统比色法⚫

浙江省食品药品检验研究院的研究课题➢

预实验：确认样本是否适用；专属性、检测限、重复性、耐用性⚫

预实验；选了三种样本，仅门冬氨酸钾镁注射液通过：➢

丹参注射液+5种细菌：3D系统培养7d仍为阴性：假阴性➢

鸦胆子油乳注射液：3D系统1d内报阳，转接传统方法阴性：假阳性⚫

实验结论：➢

针对BacTALERT®3D

系统，需要使用双温模式（Dual-T）才能通过专属性测试➢

黑曲霉即使在低温下（20.5

℃

）依然超过了预设的72hr检测时间➢

BacTALERT®3D

微生物检测系统在替代目前药典规定的无菌检查方法时，有其局限性，并非适用于所有品种，即便是制剂规格满足3D

系统的检验量并且样品本身经过无菌检查方法验证确认无抑菌性，也可能无法通过替代方法验证试验。12©

2018

BD.比色技术的一小步

无菌检测的一大步⚫

真正达到了药典无菌检测一致性的要求⚫

Limit

ofDetection

=1CFU

（37种运算法则、二期运算）⚫

BACTEC™单温单瓶：涵盖过程控制全部目标微生物的全部生长阶段⚫

树脂吸附、药品微生物过程优化（无菌包装、延迟放瓶、抗干扰）⚫

快速：8小时报阳、48小时产生结果：FX40

≥3D

240

DUAL-T⚫

免维护：荧光强度与波长相互自校准，内置质控突破肉眼局限荧光增强技术传统比色技术检测器37种运算法则13©

2018

BD.真正达到了药典无菌检测一致性LimitofDetection=1CFU⚫

传统比色法只有3种运算法则⚫

颜色变化的延迟：相对定量⚫

只看结果，无法实时检测生长过程迟缓期对数期稳定期衰亡期⚫

无法覆盖衰亡期⚫

外界/背景

干扰影响较大⚫

BACTEC™：超过37种运算法则⚫

实时反馈光强和波长：绝对定量⚫

基于代谢途径拟合生长曲线⚫

二期运算法则PHASEIII1III1IV3⚫

覆盖衰亡期微生物传统比色：

1BACTEC

:

11158⚫

不同的样本、培养基、生长期应用组合运算法则以补偿或抵消干扰14©

2018

BD.真正达到了药典无菌检测一致性LimitofDetection=1CFU❑

GrowthCurve

exampleofPseudomonas

spp.阈值法的检测阈值线BACTEC™二期运算法则⚫

部分微生物对数期依赖糖代谢，产生CO

；进入稳定期后，依赖2氮代谢产生NH

，CO

浓度下降42⚫

对数期末端CO

的含量若不超过2阈值，则传统比色技术出现漏检⚫

BACTEC™二期运算法则检测CO浓度下降导致的信号变弱，从而避免漏检2hrs1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18糖代谢期氮代谢期Klaemeret

al,JCMl15©

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BD.真正达到了药典无菌检测一致性LimitofDetection=1CFU16©

2018

BD.涵盖过程控制全部目标微生物只需BACTEC™单温单瓶兼性厌氧菌≥需氧菌专性厌氧菌35℃

35℃32.5

°C32.5

°C细菌需氧厌氧传统比色法产品：DUAL-T

双温四瓶无二期运算法则费时费力

漏检风险BACTEC™

Plus

Aerobic22.5

°C22.5

°C35

℃

覆盖全部目标微生物真菌需氧厌氧需氧/兼性厌氧

细菌/真菌BACTEC™

Lytic

Anaerobic补充：专性厌氧微生物35

℃17©

2018

BD.真正达到了药典无菌检测一致性树脂吸附技术⚫

吸附抗菌素，提高阳性检出率⚫

吸附营养物质在树脂表面，扩大附着的表面积⚫

撞破红细胞，释放细胞内营养物质⚫

撞破白细胞，释放被吞噬的微生物⚫

提供更清晰的镜下视野⚫

阳性样本直接涂片染色活性炭树脂真正达到了药典无菌检测一致性专为药品微生物过程优化⚫

双层环氧乙烷无菌包装的BACTEC™

培养瓶BACTEC™

PLUSmediumEtOdoublewrapped⚫

BACTEC™：延迟放入功能培养箱孵育允许延迟时间：20小时内于室温保存允许延迟时间：48小时内⚫

培养瓶取出后延续二次培养：5小时内系统可自动识别，生长曲线可延续19©

2018

BD.真正达到了药典无菌检测一致性专为药品微生物过程优化

–

抗干扰⚫

传统比色法：理论上只适用于人体血液样本⚫

颜色反应需要时间，仅能通过累计值判断生长与否⚫

灰尘、漏光的影响大，需要定期校准⚫

对色彩偏差较大、不透光、非牛顿流体等样本无效✓

免疫细胞

（包括CA）⚫

BACTEC™：荧光增强的代谢拟合技术⚫

实时反馈的荧光强度和波长信息绘制生长曲线⚫

BACTEC™生长曲线拟合微生物代谢途径⚫

而背景信号随时间的变化不可能与微生物代谢一致⚫

从而过滤背景，抗干扰✓

干细胞✓

人体组织液✓

细胞发酵液✓

疫苗和生物制品✓

蛋白药物✓

脂质体、脂肪乳✓

滤膜20©

2018

BD.全自动实时动态荧光快速无菌检测系统BD

BACTEC™FXFX

=

Fluorescence

X

generationBACTEC™

FX200BACTEC™

FX400BACTEC™

FX402017年上市21©

2018

BD.BD：专注快速无菌检测50年BACTEC™

FX第10代

实时动态荧光快速无菌检测系统BACTEC™

110BACTEC™

460

BACTEC™

9240世界首台无菌培养仪

检测结核分枝杆菌

第9代

采用荧光技术22©

2018

BD.全自动实时动态荧光快速无菌检测系统BACTEC™

FX40

可扩展23©

2018

BD.全自动实时动态荧光快速无菌检测系统BACTEC™

FX200

FX400可扩展24©

2018

BD.全自动实时动态荧光快速无菌检测系统独立温控主动强制空气流动系统预设状态下，任何瓶位中的各种培养瓶均保持35℃±1.5℃的孵育温度•

每个抽屉单独控制•

独立的鼓风机、加热器和温度传感器FX200可定制2个培养温度FX400可定制4个培养温度虽非必要，系统的每个抽屉可定制独立的培养温度25©

2018

BD.实验室全流程优化BACTEC™快速无菌

+

Phoenix™

M50快速微生物鉴定无菌检测

8小时

+

微生物鉴定

1.5小时26©

2018

BD.BD

Synapsys™微生物信息云管理系统集成化实验流程实时的仪器接入可追溯的云系统可随时随地访问27©应用案例定性检验方法的验证专属性检测限重复性耐用性微生物定性检验的重现性是指相同的样品在正常的实验条件（如实验地点、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。微生物定性检验的耐用性是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。微生物定性检验的检测限是指在替代方法设定的检验条件下，样品中能被检出的微生物的最低数量。微生物定性检验的专属性是指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力。28©

2018

BD.无菌注射药品---脂质体专属性测试：1.方法：20ml样本+1~10cfu/0.1ml菌液，重复进行三个批次样本，每批次平行5次。2.菌种：选择2种环境菌+2种ATCC标准菌株✓

短波单胞菌✓

少动鞘氨醇单胞菌✓

大肠埃细菌✓

枯草芽孢杆菌3.结论：4种菌种均能在12h之内检出29©

2018

BD.生物制品---细胞发酵收获液检测限：•

方法：分别取发酵液、培养基、纯化缓冲液、淋洗水（用灭菌注射用水进行替代）四种类型样品，每种类型样品平行制备三份，20ml/份，接入≤5cfu的菌液。•

菌种：铜绿假单胞菌；枯草芽孢杆菌；藤黄微球菌；金黄色葡萄球•

接受标准：均应检出，且同种微生物样本之间报阳时间差异应RSD≤5%30©

2018

BD.生物制品---细胞发酵收获液耐用性：方法：样品注入标准需氧培养瓶中，将其放入2-8℃冰箱进行保存。分别于0、2h、4h、6h不同时间进行上机测试，每次试验平行三次，考察其报阳时间是否存在差异。菌种：铜绿假单胞菌；枯草芽孢杆菌；藤黄微球菌；金黄色葡萄球菌接受标准：与0h报阳时间差异应RSD≤5%31©

2018

BD.细胞类产品---干细胞•

圣路易斯脐带血银行St

Louis

Cord

Blood

Bank(SLCBB)•

2013年FDA提交无菌检查替代验证方案获批•

sensitivity,

specificity,

reproducibility,

ruggednessrobustness•

ruggedness

or

robustness,32©

2018

BD.细胞类产品---Car-T省时70%快速无菌方法节省样本90%•

自体Cart产品时效短•

通用cart产品样本贵EP2.6.2733©

2018

BD.BDBACTEC™

FXadvancedCar-T

Solution

(FaCS)T细胞生产工艺该产品含有柠檬酸钠或肝素抗凝，液体密度介质和惰性凝胶屏障抽空，无菌血液收集管，它是用于全血收集和单核血细胞的体外诊断检测的目的，随后分离BD

Vacutainer

CPT(362761)单个核细胞获得BD

流式细胞仪+TBNK抗体PBMC

baseline检测BDMultitest™

withBDTrucount™

TubesBD

分选型流式细胞仪相关流式抗体完美的分选性能，分选纯度高，适合分析、分析分选T细胞亚群分选纯度高，操作方便，设备要求低，提供多种T细胞分选试剂盒。T细胞分选BD

Imag磁珠分选CD3cloneHIT3a

（555336）适用于可溶性培养方案，CD3cloneUCHT1

（555329）适用于固定培养刺激方案（提前包被）。均可配合共刺激分子CD28cloneCD28.2(555725)培养活化T细胞。CD3功能性抗体CD28功能性抗体T细胞的活化BD

分析型流式细胞仪相关流式抗体T细胞改造T

细胞扩增检测T细胞分型以及CAR表达情况相关细胞因子BDPharmingen提供了丰富的重组表达蛋白，可用于不同的T细胞扩增和分化试验。用户可以根据自己的需要自行搭配选择。如IL-2,IL-7,

IL-15等34©

2018

BD.BDBACTEC™

FXadvancedCar-T

Solution

(FaCS)过程控制细胞活力检测BD流式细胞仪+T细胞分选后质量检测T细胞活化后质量检测T细胞纯度检测BD

FixableViability

Stain

450CD3+/CD4+/CD8+流式抗体BD流式细胞仪+BD

FixableViability

Stain

450T细胞亚群表面抗体细胞活力检测T细胞及亚群分析BD

MAXqPCR检测基因拷贝数T细胞亚群及CAR分子表达情况分析细胞活力检测BD流式细胞仪+T细胞改造后质量检测T细胞亚群表面抗体panelCAR分子特异性流式抗体BD

FixableViability

Stain

450T细胞增