生态学实验技术第三讲-分子生态学实验方法与技术课件

第三讲分子生态学实验方法与技术

分子生态学是上世纪90年代初新兴的一门生态学分支学科，应用分子生物学的原理和方法来研究生命系统与环境系统相互作用的生态机理及其分子机制的科学，阐明自然种群和引进种群与环境之间的联系，评价重组生物体释放对环境的影响（Smith,1993)。

分子生态学主要研究内容：物种起源与进化、转基因生物的生态学效应评估、濒危物种的保护、有害动物的控制、医学方面的应用等。第三讲分子生态学实验方法与技术

分子生态分子生态学的研究方法

主要包括两大类：基于DNA层次的研究方法和基于蛋白质层次的研究方法。

DNA层次的主要研究对象是线粒体DNA、叶绿体DNA、核糖体DNA、基因组DNA；蛋白质层次的研究多采用多位点等位酶技术。分子生态学的研究方法主要包括两大类：分子标记的种类与历史蛋白质：同工酶(等位酶)：六十年代以来核苷酸序列和片段：tRNA（1965）1980年以来：RFLP(限制性片段长度多态）1984年以来：SSR(短重复序列标记)1990年以来：RAPD(随机扩增长度多态)1993年以来：AFLP(扩增片段长度多态)分子标记的种类与历史蛋白质：同工酶(等位酶)：六十年代以来一等位酶技术酶是基因编码的产物，在电场中迁移率的改变可反映酶蛋白的大小、构形和肽链氨基酸的序列变化，即编码DNA顺序上的变化，通过分析酶谱的变化可获得所需的遗传信息。在酶谱分析中，等位酶是常用的分析工具。等位酶是同一基因位点的不同等位基因所编码的同一种酶的不同形式，等位酶作为基因表达的产物间接反映酶基因位点及等位基因的变化，是衡量遗传变异的重要遗传标记。一等位酶技术

在种内水平上，

等位酶可作为一种稳定的遗传标记。根据等位酶谱带的遗传分析确定出每种等位基因在居群中的频率，从而计算出它们的遗传相似度或遗传距离，对种群的遗传学结构做出估计，测量种群的遗传多样性以及各种群间的遗传距离。等位酶技术主要应用于居群的遗传结构及其时空变化、居群分化和物种形成、种间关系、遗传育种、生物多样性、推断杂种或多倍体的亲本、类群间的亲缘性等领域。在种内水平上，等位酶可作为一种稳定的遗传标等位酶技术优点：操作相对简单，花费少，统计方法标准，并且有大量的前人资料可以借鉴。缺点：但对一些狭域分布的地方种群，往往缺乏多态性的位点，无法进行等位酶分析（至少需分析10-20个独立分离的多态性位点，才能达到统计的可信度)。另外分析时一定要保持酶的活性。等位酶技术材料的采集研磨和酶的提取酶的保存凝胶制备电泳凝胶切片酶的组织化学染色酶谱的记录与分析数据分析等位酶分析的过程材料的采集研磨和酶的提取酶的保存凝胶制备电泳凝胶切片酶的组织1材料采集和提取液的选择

植物体任何有活性的部位都可用来进行等位酶分析，因幼嫩组织酶活性最高，故一般采集幼嫩叶片进行实验。进行等位酶分析首先要把有功能的可溶性酶蛋白质从植物细胞中提取出来，并保证这些酶的活性。常用提取液：简单磷酸提取缓冲液和复杂磷酸提取缓冲液。多数栽培植物和花粉可用简单缓冲液提取，而大多数野生植物由于含有较多酚类等有害于酶蛋白质的物质，一般用复杂提取缓冲液。其中，Tris-HCl提取缓冲液最常用。1材料采集和提取液的选择

当研磨植物样品材料时，细胞结构被破坏，许多影响酶活性的干扰物质，如酚类、萜类、果胶、树脂、香豆素和一些色素等释放出来，与酶相互作用，导致酶失活。因此在提取液中必须添加提取缓冲液(简称提取液)，防止酶在提取过程中被破坏。

其中，酚类物质的影响最大。酚类易被氧化成醌类，与蛋白质的硫氢基(-SH)反应，发生褐变，此为提取样品时酶失活的一个标志。添加的保护物质多用来消除酚类物质对酶的破坏作用，一般用竞争性抑制剂，如PVP、二硫苏糖醇、抗坏血酸钠(Vc钠盐)和β-巯基乙醇等，或抑制酚氧化酶活性的物质，如偏重亚硫酸钠和四硼酸钠等，可抑制或逆转酚氧化成醌。另外，二乙基二硫代氨基甲酸可通过作用于含铜活性中心抑制酚氧化酶。当研磨植物样品材料时，细胞结构被破坏，许多影响酶活性注意：并不是各种添加剂对酶都是有益的。如：二乙基二硫代氨基甲酸影响SOD的铜-锌辅酶，偏重亚硫酸钠抑制某些脱氢酶系统，

PVP可能抑制谷氨酰胺合成酶(GS)。因此，确定合适的保护物质时，最好先进行预备实验。如果材料宝贵又缺乏经验，使用复杂提取液比较保险。但如果材料所含干扰物质少，应尽量选用简单提取液，防止提取液抑制酶的活性。注意：并不是各种添加剂对酶都是有益的。如：复杂提取缓冲液以Tris-HCl

提取缓冲液最常用

，配方如下：

0.01g乙二胺四乙酸四钠盐(EDTANa4)

0.019g氯化钾(KCl)0.05g氯化镁(MgCl2·6H2O)1~5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)1.25g蔗糖25.00mLTris-HCl缓冲液(0.1mol/L,pH7.5)把PVP放入溶液搅拌溶解，或者水合过夜。放入冰箱保存。使用前按1-2%（v/v）加入2-巯基乙醇。复杂提取缓冲液以Tris-HCl提取缓冲液最常用，配方如2酶系统的选择

酶系统的选择：

对酶谱作正确的分析，必须了解该酶蛋白分子的四级结构。对于酶分子结构清楚的电泳图谱，一般可以结合染色体的倍性水平可靠地判定位点和等位基因。许多种酶分子的亚基数目已基本上清楚，而且在不同的类群中保持恒定。在选择酶系统时应优先考虑植物系统学研究常选用的酶系统，这些酶的结构基本清楚。有些酶(如ACP、EST、PER等)的结构尚不清楚。这些酶系统的位点数目很多，酶谱相当复杂，酶谱的解释如无可靠的遗传分析为基础，会产生多种可能的解释，其结果往往不可靠。2酶系统的选择生态学实验技术第三讲-分子生态学实验方法与技术课件3电泳胶的制备酶电泳的介质有多种，最常用：淀粉凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。

与聚丙烯酰胺比较，淀粉无毒，且显色效果和聚丙烯酰胺胶显色效果差不多。

1）制备淀粉胶淀粉胶通常用煮沸水解淀粉和相应的缓冲液的混合物配制。电泳缓冲系统包括两种缓冲溶液：胶缓冲液:用于胶的制备；电极缓冲液:在电泳迁移的时候用来连接电极和胶。3电泳胶的制备制胶程序：1、在三角烧瓶里放入48g水解淀粉和400ml胶缓冲液，用保鲜膜盖住瓶口。用微波炉加热混合物，每间隔10～20秒摇一下，以防结块。胶粘稠之后，再继续煮会变得透明、均一。连续煮开两次。2、接上真空泵抽气约20秒。待胶稍冷后，将胶倒在调好水平的玻璃板上的框子里。约30分钟后胶冷却，即成淀粉胶。制好的胶若当时不用，最好用塑料保鲜膜将它覆盖起来，以防止水分蒸发后胶干裂。否则，蛋白在电泳迁移过程中会产生变形。制胶程序：生态学实验技术第三讲-分子生态学实验方法与技术课件4缓冲液系统的选择

缓冲液系统的选择是等位酶电泳分析中的重要一环。因为不同的酶蛋白的分子结构和电荷不同，使用不同的缓冲液分离效果也不一样。目前，用于淀粉凝胶电泳的缓冲液系统很多，常用以下几种：TC(Tris-Citrate)缓冲液、TBE(Tris-Borate-EDTA)缓冲液、TBE(Tris-Borate-Na２EDTA)缓冲液、Borate-NaOH缓冲液4缓冲液系统的选择Ⅰ.TC(Tris-Citrate)缓冲液：

pH值7.0，适用于LDH，MDH，ME，IDH，EsD，6PGD，ACO，ADA，HBDH，HK，ACP，AK，CK，PER，GOT，PGM，ALD，CEs，GPI，SUDH，SOD等酶。电泳条件：恒流35～40mA，3～4小时。电极缓冲液：Tris（三羟甲基氨基甲烷）16.35g+Citricacid（柠檬酸）9.04g加蒸馏水至1000ml，用Tris或柠檬酸调pH值至7.0胶缓冲液：稀释66.7ml电极缓冲液至1000mlⅠ.TC(Tris-Citrate)缓冲液：Ⅱ．TBE(Tris-Borate-EDTA)缓冲液，pH值8.6,适用于CAR，CAT，Dia，FK，GDA，GLO等酶。电泳条件：恒流60mA，5小时贮存液：0.9mol／dm3Tris109g0.5mol／dm3Boricacid（硼酸）30g0.02mol／dm3EDTA（乙二胺四乙酸）7.6g加蒸馏水至1000ml电极缓冲液：pH值8.61:4稀释贮存液（用3次）用1mol／dm3Tris或1mol／dm3硼酸调pH值至8.6胶缓冲液：pH值8.61:39稀释贮存液用1mol／dm3Tris或1mol／dm3硼酸调pH值至8.6Ⅱ．TBE(Tris-Borate-EDTA)缓冲液，III.TBE(Tris-Borate-Na２EDTA)缓冲液:

pH值8.0,

适用于G6PD，NP，PK，ADH，GAPD，GPD，GLC，GLD，XDH，FUM，PEP-B，PEP-A等酶。电泳条件：恒压250V，3小时电极缓冲液：Tris60.6g+硼酸40g+Na２EDTA6g加蒸馏水至1000ml，pH值8.0胶缓冲液：Tris6.06g+硼酸6g+Na２EDTA0.6g加蒸馏水至1000ml，pH值8.0III.TBE(Tris-Borate-Na２EDTA)缓Ⅳ．Borate-NaOH缓冲液:

pH值8.7,适用于Tf，AIB，ALP(AKP)，Sa２，PA，Es电泳条件：恒压250V，4小时电极缓冲液：pH值8．70.3mol/dm３硼酸18.6g0.005mol/dm３

NaOH2～4g加水至1000ml，用NaOH调pH值至8．7胶缓冲液：pH值7.5Tris9.4g柠檬酸1.05g硼酸2g加水至1000ml，调pH值至7.5Ⅳ．Borate-NaOH缓冲液:

缓冲条件的选择对电泳的效果有较大的影响，其中pH值与离子强度是两个重要因素。只有pH值和离子强度条件选择合适，才能既得到较好的分辨率又不降低酶的活性。pH值提高缓冲系统的pH值，可加快电泳速度，使凝胶的pH值与电极缓冲液的pH值之间有一定差距，使电泳时跑在后面的蛋白质分子因电泳基质环境的pH值先降低而前进速度减慢，而在前面的蛋白质分子仍以高速前进，从而拉开距离以提高分辨率。离子强度

增加离子强度，会使酶蛋白离子因吸引缓冲液中电荷相反的离子而降低泳动速度，形成较窄的条带，有利于提高分辨率；反之，则泳动速率快，分辨率不高。缓冲条件的选择对电泳的效果有较大的影响，其中5染色方法的选择

酶的染色原理基于酶的组织化学法，常用液染和胶染两种方法。常用染料为噻唑蓝(MTT

1%)或吩嗪钾硫酸(PMS

1%)。

液染是传统的染色方法，将胶浸泡在配制好的染液中。这种染色方法使凝胶与染液充分接触，染色效果好，但药品用量大。胶染是在少量染液中加入受热溶解的琼脂或琼脂糖溶液，混匀后将混合液平铺并固定在淀粉凝胶的表面，从而大大节省了化学药品的用量(常为液染的三分之一)，且铺盖的热染液有利于加快酶的反应。胶染时，使用琼脂较好，因为琼脂价格便宜，谱带不易扩散，反应速度和酶的活性也没有明显的降低。5染色方法的选择电泳仪电泳槽6电泳电泳仪电泳槽6电泳7酶谱分析

等位酶分析的关键是通过对电泳后所获得的酶谱的分析来推断和确定基因位点和等位基因。7酶谱分析☛酶谱照片☛酶谱照片二DNA分析技术特点：

具有更丰富的变异，多态性高，且所需材料少，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，但取材时需严格控制DNA的污染，否则分析结果误差较大。基本过程包括：

DNA提取、限制性酶切、PCR扩增、分子杂交、基因文库构建、DNA测序或指纹谱带测定。二DNA分析技术RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphisms)、RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)、AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphisms)、SSR(Simplesequencerepeats)、STS(Sequenc-taggedSite序列位点标记)、SNP(SingleNucleotidePolymorphism单核苷酸多态性)、GISH(Genomicinsituhybridization--基因组原位杂交)、mRNADD(mRNADifferentialDisplay--mRNA差别显示)、SSH(SuppressionSubtractionHybridization--抑制差减杂交

)、AP-PCR(Arbitray-primerPCR—任意引物PCR)、DAF(DNAamplifiedfingprinting—DNA扩增指纹)、SPARs(Singleprimeramplificationreactions)、AMO(AnchoredMicrosatelliteOligonucleotides--加锚微卫星寡核苷酸）

目前，常用分子标记技术包括:RFLP(RestrictionFragmentLe1DNA的提取

1)核酸的理化性质

A.DNA为白色类似石棉样的纤维状物，RNA纯品呈白色粉末或结晶。

B.DNA、RNA一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。

C.天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，除去蛋白

，再除去细胞中的糖、RNA及无机离子等，分离DNA。

1DNA的提取DNA的变性与复性DNA变性：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链。监测指标为A260增加，并与解链程度有一定的关系。常用的变性方法为加热。解链温度：DNA变性从开始到完全解链是在一个相当窄的范围内完成的。这一范围内A260达到最大值的50%时的温度称为解链温度，又称为融解温度（meltingtemperature，Tm）。复性:变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，称为复性。热变性DNA经缓慢冷却后即可复性，也称为退火（annealing）。

DNA复性速度受温度的影响，复性时温度缓慢下降才可使其重新配对复性；如加热后将其迅速冷却至4℃以下，则不可能发生复性。DNA的变性与复性DNA变性：在某些理化因素作用下，D2)材料的选择与提取方法*

DNA分子在生物体内的分布及含量不同。一般来说植物种子的胚DNA含量丰富。也可选用幼嫩的叶片进行提取。*不同材料提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。*DNA分子量较小的低等生物的DNA提取比较容易，提取时易保持其结构完整性。*从高等动植物中提取DNA难度大一些。其DNA分子量较大，因此易被机械张力剪断。细菌的DNA，除核DNA外，还有质粒DNA等。2)材料的选择与提取方法

高等动植物DNA主要存在于细胞核与线粒体和叶绿体中，在提取时有两个困难：

①破碎细胞难；从处死动物、分离组织器宫到破碎细胞费时长，在此时期间DNA可能会被DNase降解，而动物组织，特别是肌肉组织很难破碎，即使是较易破碎的肝、肾等组织也往往因使用组织匀浆器，易造成DNA断裂。

②分子量大：一般比细菌的大2—3个数量级，比病毒的大4—5个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。高等动植物DNA主要存在于细胞核与线粒体和叶3)DNA提取方法(1)浓盐法

DNP在1MNaCL溶液中溶解度较大，而在0.15mol/LNaCl溶液中溶解度很低(几乎不溶)；但RNP的溶解度受盐浓度影响较小，在0.15mol/LNaCl溶液中溶解度仍较大，故可利用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP，再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白，再按氯仿---异戊醇法除去蛋白。提取DNA时，加入适量去污剂，如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。3)DNA提取方法（2）阴离子去污剂法:

细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，阴离子去污剂能够破坏这种价键，所以常用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。（3）苯酚抽提法:

苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键断裂，蛋白分子表面含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。

DNA呈十分粘稠状，可用玻璃慢慢绕成一团取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。（2）阴离子去污剂法:好的DNA分离程序应符合以下三个主要标准：（1）所得DNA纯度应满足下游操作要求：用于RFLP分析的DNA，其纯度要求可用限制性内切酶完全酶解并可成功地转移到膜上进行Southern杂交；用于PCR分析的DNA则不应含干扰PCR反应的污染物。（2）所得DNA应当完整，电泳检查时可出现精确性高、重复性好的迁移带型。（3）所得的DNA应有足够的量。如研究多个遗传标记在某一植物居群中的分离情况，要求单株植物中提取的DNA可作100次分析；而从大量植株中筛选一个单一遗传标记时，只需在一个Eppendorf管中微量提取得到的DNA就足够。如果进行大规模筛选，操作程序还应当快速、简便、价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂。好的DNA分离程序应符合以下三个主要标准：

在野外时，常常采用脱水处理来保存植物材料的DNA。最常用的是用硅胶快速干燥保存样品，并且干燥后的组织很容易研磨成粉。植物材料中，特别是老的或是经逆境处理的材料，含有大量的酚类化合物，这些酚类化合物氧化后易与DNA共价结合，使DNA带棕色或褐色，并能抑制DNA的酶解反应。为防止这类情况出现，可以向提取缓冲液中加入2%（W/V）的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或抽提缓冲液中的巯基乙醇的浓度可以提高到2～5%。在野外时，常常采用脱水处理来保存植物材料的4)实验室常用DNA提取方法（1）CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法CTAB可以溶解细胞膜，能与核酸形成复合物。CTAB核酸复合物在高盐(

>0.7mM

)浓度下可溶，在低盐浓度(

0.1-0.5mM)下

因溶解度降低而沉淀。植物材料研磨后，在

CTAB的处理下，

65℃水浴可使细胞裂解、蛋白质变性，

DNA

被释放出来并

与CTAB

形成复合物。氯仿

/

异戊醇

(24:1)

抽提可去除蛋白质、多糖、色素等。降低盐浓度时，CTAB核酸复合物沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶于溶液中。因此通过离心就可将其分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，除去CTAB。4)实验室常用DNA提取方法EDTA能螯合Mg2+或Mn2+，抑制DNA酶的活性。PVP是酚的络合物，能与酚形成一种不溶的络合物质，有效的去除多酚，减少DNA中酚的污染，同时它也能与多糖结合，有效的去除多糖。

β-巯基乙醇是抗氧化剂，可有效的阻止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。用酚-氯仿抽提，去除蛋白、多糖、单宁、色素等杂质，得到的DNA溶液经异丙醇沉淀。Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCL是生物化学一种常用的缓冲液。EDTA能螯合Mg2+或Mn2+，抑制DNNaCl可提供高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中。另外，高盐可溶解多糖。氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。乙醇洗剂主要用来除去盐离子，乙醇会夺取DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。NaCl可提供高盐环境，使DNP充分溶解，存母液配制（除标注外，均需高压灭菌）。1）1MTris-HCl（pH8.0）12.11gTris溶于100mlH2O加浓HCl调pH至8.0（约5.25ml浓HCl）2）0.5MEDTA-Na2（pH8.0）23.26gEDTA-Na2·2H2O+100mlH2O（磁力搅拌）加NaOH（片状）调pH至8.0（约2.5gNaOH）在调pH至8.0以前，EDTA-Na2不溶解3）5MNaCl29.2gNaCl+100mlH2O4）β-巯基乙醇（BME）通常为14.4M（勿高压灭菌）母液配制（除标注外，均需高压灭菌）。配制10mlCTAB提取液1MTris-HCl 1ml0.5MEDTA-Na2 0.4ml5MNaCl 2.8mlCTAB 0.2gBME 20μl（使用前加入）ddH2O 5.78ml配制30mlTE（pH8.0）（可防止DNA发生酸解）1MTris-HCl 300μl0.5MEDTA-Na2 60μlddH2O 29.64ml配制10mlCTAB提取液实验步骤：1．取新鲜叶片放入研钵，加入液氮研磨成细粉状。转移至1.5mlEppendorf管中，加入0.5ml65℃预热的CTAB提取液，65℃恒温水浴30-60min（CTAB在低于15℃时会析出沉淀，因此在将其加入冷冻的植物材料中之前必须预热），其间不时轻缓颠倒混匀。如果降解严重或得率太低，可以使用37℃–45℃区域水浴。2．加入等体积24:1CHCl3/异戊醇，混匀，4℃冷藏静置10min。3．4℃，10000r/min离心10min，取上清液至新Eppendorf管中。再用等体积24:1酚/氯仿/异戊醇抽提，取上清液。实验步骤：4.上清液至新的Eppendorf管中，加入2/3倍体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，-20℃静置至沉淀析出。用玻璃棒(细)挑出成团的DNA。5．将DNA挑入Eppendorf管中，用70%乙醇(或无水乙醇)洗涤3次，风干。6．将DNA溶于1mlTE中。7．取150μlDNA溶于20倍(或更高倍)体积TE(或ddH2O)中，用TE(或ddH2O)做空白校正。8．测260nm、280nm、310nm处的OD[dsDNA]=50(OD260–OD310)×稀释倍数(μg/ml)DNAOD260/OD280=1.8，大于1.9表明有RNA污染，小于1.6表明有蛋白质或酚类污染。4.上清液至新的Eppendorf管中，加入2/3倍体积预冷（2）SDS法

SDS可溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀。

将分散好的生物组织细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚：异戊醇抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。相对而言，过程长，纯度高。而CTAB法相对简便、快速，

DNA

产量高

；但

纯度稍次，适用于一般分子生物学操作

。（2）SDS法SDS法流程图

（以动物组织为例）

动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－SDS法SDS法流程图（以动物组织为例）动物组织细胞裂解上层溶2RNA的提取

RNA的制备与分析对于了解基因表达在转录水平上的调节是必不可少的，也是最常使用的通过cDNA途径分析细胞基因表达的前提。

RNA分析其实是对组织细胞总RNA中的mRNA进行分析。通常一个典型的哺乳动物细胞约含10-5μgRNA，但其中大部分为rRNA及tRNA，而mRNA仅占1%～5%。由于mRNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性。2RNA的提取RNA酶

RNA实验的最关键因素是分离到全长的RNA。而实验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，反应一般不需要辅助因子，并且可耐受多种处理（如煮沸、高压灭菌等）而不被灭活。

RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。

RNA酶

在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。外源性RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其他分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。

在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的一)防止RNA酶污染的措施

1．所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃高温下干烤6h或更长时间。

2．塑料器皿可用01%DEPC水(焦磷酸二乙酯)浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具容易被氯仿腐蚀，故不能使用)。

3．有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。一)防止RNA酶污染的措施

1．所有的玻璃器皿均应在使用4．配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。

5．操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

6．设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。4．配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37℃处理12h二)常用的RNA酶抑制剂1．焦磷酸二乙酯(DEPC)：

是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

2．异硫氰酸胍(GITC)

：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

二)常用的RNA酶抑制剂3．氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

4．RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin)

：从大鼠肝或人胎盘中提取来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

5．其他

SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。3．氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和

细胞内总RNA制备方法很多，如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒，可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA可利用mRNA3’末端含有多聚(A)+的特点，当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

细胞内总RNA制备方法很多，如异硫氰酸胍热（一）常用总RNA提取-Trizol法

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA无蛋白和DNA污染。

Trizol的主要成分是异硫氰酸胍和酚，还有8-羟基喹啉、β-巯基乙醇。异硫氰酸胍可溶解蛋白质，主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质得以释放，酚可使蛋白变性，但不能完全抑制RNA酶活性，8-羟基喹啉、β-巯基乙醇可抑制内源和外源RNA酶。（一）常用总RNA提取-Trizol法

Trizol法

操作步骤1、将组织在液氮中磨成粉末，每50-100mg组织加入1mlTrizol液进行裂解。注意：样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10╳106个细胞加1mlTrizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2、将Trizol裂解液转入EP管中，在室温15~30℃下放置5分钟

，然后加入氯仿(按1mlTrizol液加入0.2ml的比例)，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，在室温下放置2～3分钟后，12000g(2℃～8℃)离心15分钟；

操作步骤3、取上层水相置于新的离心管，加入异丙醇（Trizol液体积的1/2)，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。4、弃上清液，按1mlTrizol液加入1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟，弃上清

。5、然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。注意：

1、整个操作带口罩及一次性手套，尽可能在低温下操作。

2、加氯仿前的匀浆液在-70℃可保存一个月，RNA沉淀在70%乙醇中在4℃可保存一周，-20℃保存一年。3、取上层水相置于新的离心管，加入异丙醇（Trizol液体总RNA定量

RNA在260nm波长处有最大吸收峰。常用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用双蒸水稀释RNA样品n倍并以双蒸水为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:RNA(mg/ml)=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000。

RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高则提示RNA有降解。

总RNA定量

RNA在260nm波长处有

3PCR反应

聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，PCR能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR的最早设想

1971年Korana提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。3PCR反应PCR的实现

1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件：-----摸板DNA-----寡核苷酸引物-----DNA聚合酶-----合适的缓冲体系-----DNA变性、复性及延伸的温度与时间

PCR的实现MullisdiscoveredthePCRprocedure,forwhichhewasawardedtheNobelprizein1993.Theprocedurehedevisedhasrevolutionizedmolecularbiology,forensics,andDNAbasedidentificationtechnology.

PCR是生物医学领域中的革命性创举和里程碑MullisdiscoveredthePCRprocPCR的改进与完善

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。PCR的改进与完善1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(Thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶，将此酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。

TaqDNA多聚酶的特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，提高了其灵敏性。且增加了扩增长度(2.0Kb)。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020耐热DNA聚合酶Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶OldFaithfulGeyser-YellowstoneNationalParkAnalienandinhospitableplace,characterizedbyextremeheat,spewingsteamintothefrigidair‚suchisthesceneofoldfaithfulgeyserinYellowstoneNationalpark.ThisseeminglyprohibitivehabitatishometoThermusaquaticus,thebacteriumfromwhichtheheatstableDNApolymeraseessentialtoPCRisobtained.

OldFaithfulGeyser-Yellowst预变性(92-95C,2-5m)变性(92-95C,30s)复性(40-60C,30s)延伸

(72C,30-60s)总延伸

(72C,7m)(25-35)PCR的一般过程经过30次循环,扩增的DNA片段可达100万倍以上。1）PCR技术基本原理预变性变性复性延伸

(72C,30-60s)总延伸

(72PCR技术基本原理

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCR技术基本原理

PCR由变性--退火--延③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。③引物的延伸：PCR仪PCR仪PCR原理１变性5’3’5’3’PCR原理１变性5’3’5’3’１复性PCR原理引物１引物２5’3’5’3’１复性PCR原理引物１引物２5’3’5’3’１延伸PCR原理１延伸PCR原理２变性PCR原理２变性PCR原理２复性PCR原理２复性PCR原理２延伸PCR原理２延伸PCR原理３变性PCR原理３变性PCR原理３复性PCR原理３复性PCR原理３延伸PCR原理３延伸PCR原理生态学实验技术第三讲-分子生态学实验方法与技术课件PCR反应可使DNA扩增量呈指数上升，最终的DNA扩增量可用公式计算：

Y＝(1＋X)n

其中，Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

PCR反应可使DNA扩增量呈指数上升，最终的DNA2）PCR反应体系与反应条件

以DNA为模板的PCR反应体系：

模板DNA0.1～2ug

4种dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmolTaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L10×扩增缓冲液10ul

加双蒸水或三蒸水至100ul。2）PCR反应体系与反应条件

以DNA为模板的PCR反应体参加PCR反应的物质主要有五种，即：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。参加PCR反应的物质主要有五种，即：引物设计原则：

（1）引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

（2）引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

（3）引物量：每条引物的浓度0.1～1umol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。（4）引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。引物设计原则：

（1）引物长度：15-30b(5)避免引物内部出现二级结构，避免两条引物之间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

(6)引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

(7)引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

(8)引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。(5)避免引物内部出现二级结构，避免两条酶及其浓度：

目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。酶及其浓度：dNTP的质量与浓度：

dNTP粉呈颗粒状，使用时常配成高浓度溶液，由于dNTP溶液呈酸性，以1MNaOH或1MTris-HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP的质量与浓度：单、双链DNA均可。注意模板的完整性，模板降解会导致PCR扩增无产物。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应。RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为扩增的模板。DNA模板一般100ng/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板单、双链DNA均可。注意模板的完整性，模板降解会导致PCR扩模板核酸：

DNA通常采用SDS和蛋白酶K来纯化；RNA一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+浓度：

Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。

Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

模板核酸：PCR反应条件

1）变性温度与时间：一般情况下，93℃～94℃1分钟足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间.

变性温度低，解链不完全；温度过高对酶的活性有影响。2）退火温度与时间：对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。

PCR反应条件

1）变性温度与时间：

引物的退火温度可通过以下公式计算：

Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)

复性温度=Tm值-(5～10℃)

在引物长度大于20bp时：复性温度=

62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般30～60sec，足以使引物与模板完全结合。

引物的退火温度可通过以下公式计算：

3）延伸温度与时间：延伸温度一般在70～75℃之间，常用72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。（70～80℃150核苷酸/S/酶分子；70℃60核苷酸/S/酶分子；55℃24核苷酸/S/酶分子）延伸时间，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

4）循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

3）延伸温度与时间：PCR反应特点：

1）特异性强PCR反应的特异性决定因素为：

①引物与模板DNA特异正确的结合；

②碱基配对原则；

③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；

④靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。PCR反应特点：

1）特异性强2）灵敏度高

PCR反应能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

3）简便、快速

一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

4）对标本的纯度要求低

不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。2）灵敏度高4PCR产物分析PCR产物的分析，依据研究对象和目的可采用以下分析方法：

凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB染色，紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预计的大小。

琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。

酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。4PCR产物分析分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。

Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。

斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测RFLP技术限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphisms)是最早应用的一种DNA标记技术，该方法利用限制性内切酶识别双链DNA分子中的特定序列，并在特定位点将DNA切开。不同种生物的同一基因碱基组成和序列是不同的，从而使限制性内切核酸酶识别的序列发生变化，结果产生新的特定酶切位点，酶切后产生不同的DNA片段。RFLP技术不同个体DNA的提取酶切凝胶电泳分开DNA片段转膜

Southern杂交

数据分析技术路线不同个体DNA的提取酶切凝胶电泳分开DNA片段转膜Sout基本步骤1、用限制性内切酶消化从生物中提取的DNA模板DNA为不同长度的片段；2、用琼脂糖电泳分离开并转移到硝酸纤维素或尼龙膜上，然后用专一序列的标记DNA探针DNA在膜上与模板DNA杂交，3、最后用自显影或显色或发光分析显示与探针同源的DNA片段；基本步骤

因为限制酶识别专一的碱基序列，因此DNA序列的变异会导致酶切点的消失或增加，限制片段的长度发生变化，显示多样性。缺点

RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制因为限制酶识别专一的碱基序列，因此DNA序RFLP原理图RFLP原理图生态学实验技术第三讲-分子生态学实验方法与技术课件生态学实验技术第三讲-分子生态学实验方法与技术课件RAPD技术随机扩增长度多态性(randomamplifiedpolymorphicDNAs)特点：对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。利用随机选择的寡聚核苷酸（一般10bp)作引物，通过对基因组DNA的PCR扩增，在琼脂糖胶上电泳分离，银染或溴化乙锭（EB）染色，得到DNA的多态性标记。优点：操作简单，快速成本低

缺点：可重复性差RAPD技术DNA的提取

PCR反应

凝胶电泳

选择随机引物

图谱分析

DNA的提取PCR反应凝胶电泳选择生态学实验技术第三讲-分子生态学实验方法与技术课件生态学实验技术第三讲-分子生态学实验方法与技术课件AFLP技术

扩增片段长度多态性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism）是建立在基因组限制性片段基础上的PCR扩增。由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。与RFLP的主要区别是用PCR代替Southern杂交，它兼有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性，且具有快速、灵敏、稳定、所需DNA量少、多态性检出率高、重复性好的特点。AFLP技术

使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对摸板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检出多态性.使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作

AFLP的原理

DNA提取两种限制性内切酶酶切DNA寡聚核苷酸接头的连接对限制性酶切片段的选择性扩增扩增产物的电泳分析AFLP的AFLP技术优点

1、所需DNA量少，AFLP反应对模板浓度的变化不敏感。2、可重复性好。高质量的DNA和过量的酶可以克服因DNA酶切不完全而产生的失真，PCR中较高的退火温度和较长的引物可将扩增中的错误减少到最低限度。

3、多态性强。AFLP通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目，来调节扩增的条带数，具有较强的多态分辨能力。

4、分辨率高。AFLP扩增片段短，适合于变性序列凝胶上电泳分离，因此片段多态性检出率高。缺点1、试剂盒价格昂贵，试验成本高。2、对DNA的纯度和内切酶的质量要求很高，应用受到限制。AFLP技术优点缺点

微卫星SSR（simplesequencerepeats）原理：微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列，每个重复单元的长度在1—10bp之间，常见的微卫星如TGTG……TG=(TG)n或AATAAT……AAT=(AAT)n等，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性。在基因组中，因每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大，从而形成其座位的多态性。而且每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物，其关键是首先要了解SSR座位的侧翼序列(FlankingRegion)，寻找其中的特异保守区。微卫星SSR（simplesequencerepe生态学实验技术第三讲-分子生态学实验方法与技术课件技术路线：建立DNA文库，筛选鉴定微卫星DNA克隆，然后测定这些克隆的序列，设计特异性引物来扩增SSR序列。经聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色，通过比较谱带的相对迁移距离，便可知不同个体在某个SSR座位上的多态性。技术路线：生态学实验技术第三讲-分子生态学实验方法与技术课件微卫星SSR的优点：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因。据估计，在基因组中平均30—50kb就存在一个微卫星。（2）微卫星DNA具有丰富的多态性。与RFLP标记相比SSR检测的多态性频率要高得多

。（3）微卫星检测容易、重复性较好、省时，适合于进行自动化分析。一个位点的检测一般可在24h内完成，且可同时进行多位点的检测。（4）所需DNA量少，对DNA质量要求不高。微卫星SSR的优点：微卫星的缺点：由于创建新的标记时需要知道重复序列两端的序列信息，要克隆足够数量的SSR，并对基因进行测序和设计引物，没有足够的投资、人力和时间，是不可能实现的。原位杂交（GISH或FISH）利用生物素或地高辛等非放射性物质标记探针的DNA探针与染色体上的DNA杂交，在染色体上直接进行检测的分子标记技术。标记物：脱氧尿嘧啶三磷酸

Bio-dUTP(生物素)

Dig-dUTP(地高辛)微卫星的缺点：染色体FISH探针整条染色体涂染探针染色体重复序列探针染色体专一位点探针基本过程：1、染色体标本制备2、探针制备3、杂交4、显微观察染色体FISH探针整条染色体涂染探针基本过程：整条染色体涂染整条染色体涂染通过整条染色体涂染判断易位染色体通过整条染色体涂染判断易位染色体染色体重复序列探针染色体重复序列探针染色体专一位点探针染色体专一位点探针

第三讲分子生态学实验方法与技术

分子生态学是上世纪90年代初新兴的一门生态学分支学科，应用分子生物学的原理和方法来研究生命系统与环境系统相互作用的生态机理及其分子机制的科学，阐明自然种群和引进种群与环境之间的联系，评价重组生物体释放对环境的影响（Smith,1993)。

分子生态学主要研究内容：物种起源与进化、转基因生物的生态学效应评估、濒危物种的保护、有害动物的控制、医学方面的应用等。第三讲分子生态学实验方法与技术

分子生态分子生态学的研究方法

主要包括两大类：基于DNA层次的研究方法和基于蛋白质层次的研究方法。

DNA层次的主要研究对象是线粒体DNA、叶绿体DNA、核糖体DNA、基因组DNA；蛋白质层次的研究多采用多位点等位酶技术。分子生态学的研究方法主要包括两大类：分子标记的种类与历史蛋白质：同工酶(等位酶)：六十年代以来核苷酸序列和片段：tRNA（1965）1980年以来：RFLP(限制性片段长度多态）1984年以来：SSR(短重复序列标记)1990年以来：RAPD(随机扩增长度多态)1993年以来：AFLP(扩增片段长度多态)分子标记的种类与历史蛋白质：同工酶(等位酶)：六十年代以来一等位酶技术酶是基因编码的产物，在电场中迁移率的改变可反映酶蛋白的大小、构形和肽链氨基酸的序列变化，即编码DNA顺序上的变化，通过分析酶谱的变化可获得所需的遗传信息。在酶谱分析中，等位酶是常用的分析工具。等位酶是同一基因位点的不同等位基因所编码的同一种酶的不同形式，等位酶作为基因表达的产物间接反映酶基因位点及等位基因的变化，是衡量遗传变异的重要遗传标记。一等位酶技术

在种内水平上，

等位酶可作为一种稳定的遗传标记。根据等位酶谱带的遗传分析确定出每种等位基因在居群中的频率，从而计算出它们的遗传相似度或遗传距离，对种群的遗传学结构做出估计，测量种群的遗传多样性以及各种群间的遗传距离。等位酶技术主要应用于居群的遗传结构及其时空变化、居群分化和物种形成、种间关系、遗传育种、生物多样性、推断杂种或多倍体的亲本、类群间的亲缘性等领域。在种内水平上，等位酶可作为一种稳定的遗传标等位酶技术优点：操作相对简单，花费少，统计方法标准，并且有大量的前人资料可以借鉴。缺点：但对一些狭域分布的地方种群，往往缺乏多态性的位点，无法进行等位酶分析（至少需分析10-20个独立分离的多态性位点，才能达到统计的可信度)。另外分析时一定要保持酶的活性。等位酶技术材料的采集研磨和酶的提取酶的保存凝胶制备电泳凝胶切片酶的组织化学染色酶谱的记录与分析数据分析等位酶分析的过程材料的