第十章-植物种质资源的离体保存课件

第十章植物种质资源的离体保存陈观水生命科学学院jimchen7909@163.com1390591445第十章植物种质资源的离体保存陈观水1第十章植物种质资源的离体保存主要内容：第一节植物种质资源的常温限制生长保存第二节植物种质资源的低温保存第三节植物种质资源的超低温保存学习的目标与要求：了解植物种质离体保存的类型与特点，及其基本操作技术。了解植物人工种子的概念与发展概况、特点与制备方法。具备利用植物组织培养技术进行种质资源保存的认知，具有人工种子制备基础能力。第十章植物种质资源的离体保存主要内容：2植物种质资源的离体保存种质资源的重要作用种质资源或称基因库是选育新品种的最基本的原始材料。有人说：“人类的命运将取决于人类理解和发觉植物种质资源的能力。”选育新品种时利用的材料单位是性状，如颜色、高矮、早熟性和抗病性等。选育新品种需要原始材料——已有的栽培品种、半栽培类型和有关野生植物。只要其具有一些能结合到栽培品种上的有用性状，就都可以作为原始材料。植物种质资源的离体保存种质资源的重要作用3植物种质资源的离体保存种质(germplasm)是亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。

植物种质资源(plantgermplasmresources)即为携带各种不同遗传物质的植物总称，又称遗传资源或品种资源，包括栽培，野生及人工创造的各种植物的品种或品系。

种质资源保存(germplasmconservation)是指在天然或人工创造的适宜环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与遗传性的技术。植物种质资源的离体保存种质(germplasm)是亲代通4植物种质资源的离体保存种质资源的保存方式有两种，即原生境保存和非原生境保存。原生境保存：将植物的遗传材料保存在它们的自然环境中。原生境保存的地方多是植物保护区，另一种方法为农田种植保存。非原生境保存：将植物的遗传材料保存在不是它们的自然生境的地方。非原生境保存方式有植物园、种质圃、种子(质)库、试管苗库、超低温库等。具体保存方法有四种：种植保存、贮藏保存、离体保存和基因文库保存。植物种质资源的离体保存种质资源的保存方式5植物种质资源的离体保存种质资源的离体保存(germplasmconservationinvitro)：是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理措施使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。离体保存的意义可使一些无性繁殖作物种质资源低温长期保存，避免资源的丢失。节省土地和劳力，方法简单，花费少并能在保存中脱毒。一旦利用可快速繁殖；也利于种质交换。植物种质资源的离体保存种质资源的离体保存(germ6植物种质资源的离体保存离体保存的方法：常温限制生长低温保存超低温保存植物种质资源的离体保存离体保存的方法：7一、植物种质资源的常温限制生长保存1.常温限制生长保存的概念正常条件下由于材料生长很快，需经常继代，增加了工作量及费用，不适合种质资源保存。通过提高渗透压、添加生长延缓剂或抑制剂、干燥、降低气压、改变光照条件等，限制培养物的生长，使转移继代的间隔时间延长达到保存种质的方法。一、植物种质资源的常温限制生长保存1.常温限制生长保8一、植物种质资源的常温限制生长保存2.常温保存的方法和原理1)高渗保存法利用培养基的高渗透压，减少离体培养物吸收养分和水分的量，减缓生理代谢过程，从而减缓生长速度，达到抑制离体培养材料生长的种质保存方法。高渗物质：甘露醇、蔗糖、PEG等

高渗保存配合低温效果更明显如：6~10℃低温下，培养基中加4%甘露醇，可保存马铃薯1~2年，存活率最高可达90%以上。一、植物种质资源的常温限制生长保存2.常温保存的方法和原理9一、植物种质资源的常温限制生长保存1.常温保存的方法和原理2)生长抑制剂保存法在培养基中加入生长抑制剂以减缓培养材料的生长，达到长期保存种质材料的保存方法。

生长延缓剂：ABA、青鲜素、CCC、多效唑、B9等使试管苗生长缓慢，生长健壮、叶色浓绿、移栽成活率高。一、植物种质资源的常温限制生长保存1.常温保存的方法和原10一、植物种质资源的常温限制生长保存1.常温保存的方法和原理3)抑制生长的其他保存法

低压保存法：降低培养材料周围气压，达到抑制生长的目的，分为低气压与低氧压两种，保存原理相似。

饥饿法：从培养基中减去1~2种营养元素，使植株缺乏相关营养而处于最小生长量

干燥保存法：减少培养材料的含水量

矿物油覆盖法：使培养材料与空气隔绝，延缓生长

低光照培养：适当减弱光照强度，缩短光照时间，进而减缓试管苗生长一、植物种质资源的常温限制生长保存1.常温保存的方法和原理11二、植物种质资源的低温保存1.低温保存的概念用离体培养的方式在非冻结程度的低温下(一般为1-9℃)保存种质的方法。方法简单，存活率高2.低温保存的方法和原理

低温使植物生长速度就会受到抑制而减慢，老化程度延缓，因而延长了继代的时间间隔而达到保存种质的目的二、植物种质资源的低温保存1.低温保存的概念12三、植物种质资源的超低温保存1.种质资源超低温保存的发展概况20世纪70年，Nag和Street首先证明胡萝卜悬浮培养细胞在液氮中保存后能恢复生长。

植物超低温种质保存(cryopreservation)是指将植物的离体材料包括茎尖（芽）、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方法处理后在超低温（-196℃液氮）条件下进行保存的方法。三、植物种质资源的超低温保存1.种质资源超低温保存的发展概况13三、植物种质资源的超低温保存1.种质资源超低温保存的发展概况

极端低温温度下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止。因此，细胞、组织和器官在超低温保存过程中不会引起遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的潜能。同时，由于超低温条件下，生物的代谢和衰老过程大大减慢，甚至完全停止，因此可以长期保存植物材料。三、植物种质资源的超低温保存1.种质资源超低温保存的发展概况14三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理离体种质在液氮中几乎所有的细胞代谢活动、生长都停止，因而排除了遗传性状的变异，同时保存了细胞的活力和形态发生潜能。低温冰冻过程中，细胞内水分结冰会直接破坏细胞结构。因此在冰冻过程中，通过避免或尽量减少其细胞内水分结冰而达到冰冻保存的目的。三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理15三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理超低温冷冻保存为什么没有把细胞冻死？

细胞冰冻结冰保护性脱水理论溶液的玻璃化理论三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理16三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理细胞冰冻结冰保护性脱水理论常温下，细胞及其溶液处于渗透平衡的状态，当温度降到冰点以下时，首先是细胞外溶液部分“冻结”出冰；胞外溶液的浓度升高，破坏了细胞内外溶液的平衡，水分由胞内通过细胞膜向外渗透，细胞收缩，细胞内浓度提高；当温度不断降低时，冻结和渗透过程不断进行，这种过程称为保护性脱水。当复温时，温度升高，冻结的冰不断融化，水分由胞外向胞内渗透，使收缩的细胞膨胀，可能恢复原状。精确控制上述过程，能使细胞在降温、复温、渗透过程中不被损伤而死亡。三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理17三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理溶液的玻璃化理论溶液在降温时，如果没有均一晶核或晶核生长缺乏足够的时间，就首先形成过冷溶液。继续降温，均一晶核形成。如果降温速度不够快，就形成尖锐的冰晶。降温速度足够快，均一晶核很少或几乎没有形成，或均一晶核生长缺乏足够的时间，溶液就进入无定型的玻璃化状态。它是一种透明的固态，与液态相比，分子没有发生重排，因此与晶态不同。被称为玻璃态，此时的温度叫玻璃化形成温度。在玻璃化形成过程中，既没有溶液效应对细胞的损伤，也没有冰晶的形成对细胞造成的机械伤害。三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理18三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理提高超低温冷冻保存的措施由于植物细胞含水量比动物细胞高，冰冻保存难度大，如果直接将保存材料放入液氮中，组织和细胞由于细胞内水分结冰，引起组织和细胞死亡，因而，超低温保存的植物材料必须借助于冷冻防护剂(cryoprotectant)。三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理19三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理

冷冻防护剂防护机理：在水溶液中能强烈地结合水分子，水合作用的结果使溶液的黏稠度增加。当温度下降时，溶液冰点下降，即冰的结晶中心增长速度下降，使水的固化程度减弱。因而对于降低培养基冰点和植物组织、细胞冰点起重要作用。冷冻防护剂的使用提高了培养基渗透压，导致细胞的轻微质壁分离，相对提高了组织和细胞的抗寒力。三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理20三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理常用的冷冻防护剂

渗透型冷冻防护剂:

多为小分子中性物质，在溶液中易结合水分子发生水合作用，使溶液粘性增加，弱化水的结晶过程，达到保护的目的。包括二甲亚砜（DMSO)、甘油、甘露醇、脯氨酸、乙二醇、丙二醇三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理21三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理常用的冷冻防护剂

非渗透型冰冻保护剂:是聚合分子物质，能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，从而起到保护作用。此类冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效果。常见的：聚乙烯吡咯烷酮(Polyvingylpyrollidone,PVP)葡聚糖(Dextrane)聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)羟乙基淀粉(Hydroxyethylstarch,HES)三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理22三、植物种质资源的超低温保存3.超低温保存的基本程序植物材料（培养物）的选取材料的预处理降温冷冻及超低温保存解冻：分快速解冻、慢速解冻再培养超低温保存后细胞或组织活力检测三、植物种质资源的超低温保存3.超低温保存的基本程序23三、植物种质资源的超低温保存3.超低温保存的基本程序

植物材料（培养物）的选取物种、基因型、器官、抗寒性、年龄、生理状态等。植物细胞培养物的生理状态是决定冻后细胞成活率的重要因素。一般指数生长期和生长延滞后期的细胞抗冻力强，存活率高。三、植物种质资源的超低温保存3.超低温保存的基本程序24三、植物种质资源的超低温保存3.超低温保存的基本程序

植物材料（培养物）的预处理预处理对于调整植物离体材料的生理状态非常有效。通过预处理的植物材料，减少了细胞内自由水的含量，使细胞能经受低温胁迫，减少或避免冷冻伤害，可大大提高材料的抗冻力。预处理包括：增加培养基糖浓度、提高渗透压、减少细胞内自由水的含量，添加诱导抗寒力的物质或冰冻保护剂，如0.3M~1.0M蔗糖、甘露醇、山梨醇等渗透调节剂，5%~10%DMSO等冰冻保护剂。三、植物种质资源的超低温保存3.超低温保存的基本程序25三、植物种质资源的超低温保存3.超低温保存的基本程序

降温冷冻及超低温保存传统的降温冷冻方法(快速冷冻法、慢速冷冻法、两步冷冻法、逐级冷冻法)玻璃化保存法包埋脱水法超低温保存包埋玻璃化法超低温保存三、植物种质资源的超低温保存3.超低温保存的基本程序26三、植物种质资源的超低温保存3.超低温保存的基本程序

解冻

超低温保存效果与化冻速度有密切关系，不同的材料应采取不同的化冻方式。液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），可采用快速化冻的方法。液泡大、含水量多的细胞采用慢速化冻法生长季节中的材料，一般在37℃～40℃水浴中慢速化冻法比室温下慢速化冻要好，而木本植物的冬芽，在超低温保存后，必须在0℃下进行慢速化冻玻璃化冻存的材料在保存终止后，要求快速化冻，以防止由于次生结冰对组织细胞造成的伤害。三、植物种质资源的超低温保存3.超低温保存的基本程序27三、植物种质资源的超低温保存3.超低温保存的基本程序

再培养经冻存的材料会不可避免地受到不同程度的伤害。冻存的材料一般在黑暗或弱光下培养1～2周，在转入正常光下培养。再培养所用的培养基一般是与保存前的相同，但有时需将大量元素或琼脂含量减半，有时则在培养基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等以利于生长的恢复。三、植物种质资源的超低温保存3.超低温保存的基本程序28思考题1．植物离体超低温保存的概念及常用的超低温方法。2．植物材料超低温保存的原理。3．超低温保存的方法及其技术要点。4．影响超低温保存效果的主要因素及调控措施。思考题1．植物离体超低温保存的概念及常用的超低温方法。29第十章植物种质资源的离体保存陈观水生命科学学院jimchen7909@163.com1390591445第十章植物种质资源的离体保存陈观水30第十章植物种质资源的离体保存主要内容：第一节植物种质资源的常温限制生长保存第二节植物种质资源的低温保存第三节植物种质资源的超低温保存学习的目标与要求：了解植物种质离体保存的类型与特点，及其基本操作技术。了解植物人工种子的概念与发展概况、特点与制备方法。具备利用植物组织培养技术进行种质资源保存的认知，具有人工种子制备基础能力。第十章植物种质资源的离体保存主要内容：31植物种质资源的离体保存种质资源的重要作用种质资源或称基因库是选育新品种的最基本的原始材料。有人说：“人类的命运将取决于人类理解和发觉植物种质资源的能力。”选育新品种时利用的材料单位是性状，如颜色、高矮、早熟性和抗病性等。选育新品种需要原始材料——已有的栽培品种、半栽培类型和有关野生植物。只要其具有一些能结合到栽培品种上的有用性状，就都可以作为原始材料。植物种质资源的离体保存种质资源的重要作用32植物种质资源的离体保存种质(germplasm)是亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。

植物种质资源(plantgermplasmresources)即为携带各种不同遗传物质的植物总称，又称遗传资源或品种资源，包括栽培，野生及人工创造的各种植物的品种或品系。

种质资源保存(germplasmconservation)是指在天然或人工创造的适宜环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与遗传性的技术。植物种质资源的离体保存种质(germplasm)是亲代通33植物种质资源的离体保存种质资源的保存方式有两种，即原生境保存和非原生境保存。原生境保存：将植物的遗传材料保存在它们的自然环境中。原生境保存的地方多是植物保护区，另一种方法为农田种植保存。非原生境保存：将植物的遗传材料保存在不是它们的自然生境的地方。非原生境保存方式有植物园、种质圃、种子(质)库、试管苗库、超低温库等。具体保存方法有四种：种植保存、贮藏保存、离体保存和基因文库保存。植物种质资源的离体保存种质资源的保存方式34植物种质资源的离体保存种质资源的离体保存(germplasmconservationinvitro)：是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理措施使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。离体保存的意义可使一些无性繁殖作物种质资源低温长期保存，避免资源的丢失。节省土地和劳力，方法简单，花费少并能在保存中脱毒。一旦利用可快速繁殖；也利于种质交换。植物种质资源的离体保存种质资源的离体保存(germ35植物种质资源的离体保存离体保存的方法：常温限制生长低温保存超低温保存植物种质资源的离体保存离体保存的方法：36一、植物种质资源的常温限制生长保存1.常温限制生长保存的概念正常条件下由于材料生长很快，需经常继代，增加了工作量及费用，不适合种质资源保存。通过提高渗透压、添加生长延缓剂或抑制剂、干燥、降低气压、改变光照条件等，限制培养物的生长，使转移继代的间隔时间延长达到保存种质的方法。一、植物种质资源的常温限制生长保存1.常温限制生长保37一、植物种质资源的常温限制生长保存2.常温保存的方法和原理1)高渗保存法利用培养基的高渗透压，减少离体培养物吸收养分和水分的量，减缓生理代谢过程，从而减缓生长速度，达到抑制离体培养材料生长的种质保存方法。高渗物质：甘露醇、蔗糖、PEG等

高渗保存配合低温效果更明显如：6~10℃低温下，培养基中加4%甘露醇，可保存马铃薯1~2年，存活率最高可达90%以上。一、植物种质资源的常温限制生长保存2.常温保存的方法和原理38一、植物种质资源的常温限制生长保存1.常温保存的方法和原理2)生长抑制剂保存法在培养基中加入生长抑制剂以减缓培养材料的生长，达到长期保存种质材料的保存方法。

生长延缓剂：ABA、青鲜素、CCC、多效唑、B9等使试管苗生长缓慢，生长健壮、叶色浓绿、移栽成活率高。一、植物种质资源的常温限制生长保存1.常温保存的方法和原39一、植物种质资源的常温限制生长保存1.常温保存的方法和原理3)抑制生长的其他保存法

低压保存法：降低培养材料周围气压，达到抑制生长的目的，分为低气压与低氧压两种，保存原理相似。

饥饿法：从培养基中减去1~2种营养元素，使植株缺乏相关营养而处于最小生长量

干燥保存法：减少培养材料的含水量

矿物油覆盖法：使培养材料与空气隔绝，延缓生长

低光照培养：适当减弱光照强度，缩短光照时间，进而减缓试管苗生长一、植物种质资源的常温限制生长保存1.常温保存的方法和原理40二、植物种质资源的低温保存1.低温保存的概念用离体培养的方式在非冻结程度的低温下(一般为1-9℃)保存种质的方法。方法简单，存活率高2.低温保存的方法和原理

低温使植物生长速度就会受到抑制而减慢，老化程度延缓，因而延长了继代的时间间隔而达到保存种质的目的二、植物种质资源的低温保存1.低温保存的概念41三、植物种质资源的超低温保存1.种质资源超低温保存的发展概况20世纪70年，Nag和Street首先证明胡萝卜悬浮培养细胞在液氮中保存后能恢复生长。

植物超低温种质保存(cryopreservation)是指将植物的离体材料包括茎尖（芽）、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方法处理后在超低温（-196℃液氮）条件下进行保存的方法。三、植物种质资源的超低温保存1.种质资源超低温保存的发展概况42三、植物种质资源的超低温保存1.种质资源超低温保存的发展概况

极端低温温度下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止。因此，细胞、组织和器官在超低温保存过程中不会引起遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的潜能。同时，由于超低温条件下，生物的代谢和衰老过程大大减慢，甚至完全停止，因此可以长期保存植物材料。三、植物种质资源的超低温保存1.种质资源超低温保存的发展概况43三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理离体种质在液氮中几乎所有的细胞代谢活动、生长都停止，因而排除了遗传性状的变异，同时保存了细胞的活力和形态发生潜能。低温冰冻过程中，细胞内水分结冰会直接破坏细胞结构。因此在冰冻过程中，通过避免或尽量减少其细胞内水分结冰而达到冰冻保存的目的。三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理44三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理超低温冷冻保存为什么没有把细胞冻死？

细胞冰冻结冰保护性脱水理论溶液的玻璃化理论三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理45三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理细胞冰冻结冰保护性脱水理论常温下，细胞及其溶液处于渗透平衡的状态，当温度降到冰点以下时，首先是细胞外溶液部分“冻结”出冰；胞外溶液的浓度升高，破坏了细胞内外溶液的平衡，水分由胞内通过细胞膜向外渗透，细胞收缩，细胞内浓度提高；当温度不断降低时，冻结和渗透过程不断进行，这种过程称为保护性脱水。当复温时，温度升高，冻结的冰不断融化，水分由胞外向胞内渗透，使收缩的细胞膨胀，可能恢复原状。精确控制上述过程，能使细胞在降温、复温、渗透过程中不被损伤而死亡。三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理46三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理溶液的玻璃化理论溶液在降温时，如果没有均一晶核或晶核生长缺乏足够的时间，就首先形成过冷溶液。继续降温，均一晶核形成。如果降温速度不够快，就形成尖锐的冰晶。降温速度足够快，均一晶核很少或几乎没有形成，或均一晶核生长缺乏足够的时间，溶液就进入无定型的玻璃化状态。它是一种透明的固态，与液态相比，分子没有发生重排，因此与晶态不同。被称为玻璃态，此时的温度叫玻璃化形成温度。在玻璃化形成过程中，既没有溶液效应对细胞的损伤，也没有冰晶的形成对细胞造成的机械伤害。三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理47三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理提高超低温冷冻保存的措施由于植物细胞含水量比动物细胞高，冰冻保存难度大，如果直接将保存材料放入液氮中，组织和细胞由于细胞内水分结冰，引起组织和细胞死亡，因而，超低温保存的植物材料必须借助于冷冻防护剂(cryoprotectant)。三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理48三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理

冷冻防护剂防护机理：在水溶液中能强烈地结合水分子，水合作用的结果使溶液的黏稠度增加。当温度下降时，溶液冰点下降，即冰的结晶中心增长速度下降，使水的固化程度减弱。因而对于降低培养基冰点和植物组织、细胞冰点起重要作用。冷冻防护剂的使用提高了培养基渗透压，导致细胞的轻微质壁分离，相对提高了组织和细胞的抗寒力。三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理49三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理常用的冷冻防护剂

渗透型冷冻防护剂:

多为小分子中性物质，在溶液中易结合水分子发生水合作用，使溶液粘性增加，弱化水的结晶过程，达到保护的目的。包括二甲亚砜（DMSO)、甘油、甘露醇、脯氨酸、乙二醇、丙二醇三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理50三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理常用的冷冻防护剂

非渗透型冰冻保护剂:是聚合分子物质，能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，从而起到保护作用。此类冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效果。常见的：聚乙烯吡咯烷酮(Polyvingylpyrollidone,PVP)葡聚糖(Dextrane)聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)羟乙基淀粉(Hydroxyethylstarch,HES)三、植物种质资源的超低温保存2.种质资源超低温保存的原理51三、植物种质资源的超低温保存3.超低温保存的基本程序植物材料（培养物）的选取材料的预处理降温冷冻及超低温保存解冻：分快速解冻、慢速解冻再培养超低温保存后细胞或组织活力检测三、植物种质资源的超低温保存3.超低温保存的基本程序52三、植物种