胶体金快速免疫诊断技术课件

胶体金快速免疫诊断技术

层析法技术优势:简单\现场\快速1.打开包装取出试纸条2.直接插入待测样品中3.目测读出结果（3-10分钟内）

与常规诊断方法相比

优点缺点快速：全部检测过程仅需3-10分钟。简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，无需专业人员，携带方便，可随时随地进行。廉价：单个测试条成本极低

可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，可立刻拿到结果，不必等待。

稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存。

检测标本种类多：既可用于查血，又可用于检尿或唾液，因而适合各种检查定量问题灵敏度问题

技术应用类别应用领域检测的物质人类医学各级医院,血站,CDC,防疫站,诊断中心；家庭自检；商检系统；边检口岸；公安系统.传染病（乙肝五项,HIV,SARS等）标志物（AFP、肌钙蛋白、粪便血红蛋白等）女性妊娠（hCG(早孕),LH,FSH)毒品（吗啡,K粉,摇头丸,冰毒）农牧业畜牧兽医站,商检系统,边检口岸,农牧类院系和研究所传染病（禽流感,兽瘟疫等）环境环保监测部门,研究机构有害物质超标食品安全食品安全检测中心,各监管部门农兽药残留（磺胺类、瘦肉精等）,大肠杆菌,黄曲霉素试纸条组成结构测试线（T线）控制线（C线）胶体金垫吸水滤纸样品垫NC膜（硝酸纤维素膜）层析方向PVC底板有4个组分：⑴、吸水纸（样品垫）。⑵、玻璃纤维膜（胶体金垫）。膜上吸附着干燥的金标抗体（流动带）。⑶、硝酸纤维素膜，膜上包被着抗原或抗体条带和能与标记物直接起反应的质控物条带（检测带）。⑷、吸水纸。以上各组份首尾互相衔接。

基本原理是将已知的特异性抗原或抗体固定于硝酸纤维素膜上某一区带作为检测带，在样品区滴加样品后，借助毛细作用，样品泳动至玻璃纤维膜，金标复合物溶解，并与样品进行抗原抗体反应，形成复合物，继续泳动至硝酸纤维素膜的检测区，带有金标记的复合物被检测区抗原或抗体捕获，呈现红色条带。如样品中没有待测抗原或抗体，则不发生结合，即不显色。在硝酸纤维素膜检测区附近一般再固定上针对金标结合物相应的抗原或抗体作为质控带，无论样品中有无待测物，质控线都应显示，如无，则检测失败。整个过程一般在15分钟内完成，操作简单、快速，且不需任何仪器。免疫层析法检测原理分类介绍

胶体金免疫层析法检测流脑抗体（间接法）

胶体金标记的兔抗人IgG，样品中的流脑抗体与胶体金标记的抗人IgG结合，沿硝酸纤维素膜移动，在包被有流脑抗原结合，出现红色反应线。

免疫层析法检测原理分类介绍

（双抗体夹心）（以HCG检测为例）HCG-β亚基抗体Y2，羊抗鼠二抗固定于硝酸纤维素膜上，金标HCG-α亚基单抗Y1固定于玻璃纤维素膜上。免疫层析法检测原理分类介绍

（竞争反应）（以吗啡检测为例）吗啡偶联物和胶体金标记的抗吗啡单克隆抗体固定于膜上测试区。通过吗啡偶联物和尿液中的吗啡竞争结合金标单克隆抗体，最小检出量300ng/ml。

结果判定：

阳性（+）：吗啡300ng/ml以上，质控区出现一条紫红色条带，测试区内不出现紫红色条带。吗啡浓度高于300ng/ml时，胶体金抗体与吗啡全部结合，从而不与吗啡偶联物结合而不出现紫红色条带。阴性（-）：吗啡在300ng/ml以下。出现两条紫红色条带，一条在测试区内，另一条在质控区内。吗啡浓度低于300ng/ml时，胶体金抗体不能与吗啡全部结合。这样，胶体金抗体在层析过程中会被固定在膜上的吗啡偶联物结合，测试区内会出现一条紫红色条带。无效：质控区未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。

抗体Antibody来源差异:鼠抗,兔抗和羊抗种类差异:单抗,多抗浓度:浓缩溶解液:不含盐

抗原抗体生物原料抗原Antigen全病毒抗原重组抗原

胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。容器硅化处理：玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗、硅化。将玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。胶体金的制备

胶体金的制备

枸橼酸三钠还原法

15nm、18nm～30nm、40nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、41nm和50nm颜色与颗粒的关系.最佳标记颗粒大小40nm.1％柠檬酸三钠ml0.300.450.701.001.502.00

金溶胶颜色蓝灰紫灰紫红红橙红橙

吸收峰(nm)220240535525522518

径粒(nm)14797.571.54024.515

胶体金的鉴定1.肉眼观察：在日光下仔细观察胶体金颜色，可以大致估计金颗粒大小。同时良好的胶体金应该是清澈透明的，若浑浊或有漂浮物提示有较多的凝集颗粒。2.分光光度计扫描吸收峰时光波长来估计金颗粒的大小。3.电镜可见精确测定金颗粒的大小。

免疫胶体金的制备

胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。

蛋白质的预处理:

1.蛋白质应先对低离子强度的水透析，去除盐类成份。盐类成份能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在。

2.用微孔滤膜或超速离心除去蛋白质溶液中的细小微粒。

3.胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或略偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。

蛋白质最适用量测定:将待标记的蛋白质（鼠抗人IgG）储存液作系列稀释后，分别取0.1ml加到1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1ml10％NaCl溶液，混匀后静置2小时。123

4576胶体金(ml)1111111蛋白质(ug)010152025303510%NaCl0.10.10.10.10.10.10.1

结果判断:对照管或加入蛋白量不足，胶体金出现由红变蓝的凝聚现象；加入蛋白质量达到或超过稳定量，则胶体金保持红色不变不稳定的金溶胶将发生聚沉，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。

胶体金与蛋白质偶联后，加入稳定剂，以避免产生凝集。一般选用PEG（分子量为20000）和牛血清白蛋白作稳定剂。加入的量：5％BSA使溶液终浓度为1%；1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。①用0.1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCl调节金溶胶至所需pH。

②于100ml金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液搅拌2～3分钟。

③加入5ml1%PEG20000溶液。

④于10000～100000g离心30～60分钟小心吸去上清液（切忌倾倒）。

⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/mlPEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以A540nm=1.5左右为宜，防腐置4℃保存。

⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于SephadexG-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2。

以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。

胶体金蛋白结合物的质量鉴定

平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。OD520nm值测定：用PBS液（含1%BSA）将胶体金蛋白试剂作1:20稀释，OD520＝0.25左右。一般应用液的OD520应为0.2～0.4。金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法。将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。

胶体金蛋白结合物玻璃纤维素膜制备胶体金标记的鼠抗人IgG放入玻璃纤维素膜浸泡10分钟，取出至37度烤箱中烤干，热合封口，置4摄氏度冰箱备用。(实验阶段）用喷点仪将胶体金标记的鼠抗人IgG喷在玻璃纤维素膜上,真空干燥2h。（生产阶段）选择NC膜NC膜的选择爬速(???秒/4cm)对灵敏度的影响通过同一T线喷点位置时,金溶液通过的速度是快速膜>慢速膜.那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短,读数快,那么灵敏度也就越低.反之,反应时间长,读数慢,也就灵敏度高。同时还有一个问题是,反应时间越长,发生非特异性结合的可能性就越大,所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度.。所以这里就有一个读数时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡.不同膜厂家的产品(Whatman,Millipore,Sartorius)大致为:135s和180s抗原、抗体包被固相NC膜的制备包被流脑抗原浓度筛选（T线）抗原用PBS梯度稀释,释后用1μl移液器点在NC膜上,37℃干燥1h备用。包被抗鼠IgG浓度筛选（C线）抗鼠IgG抗体用PBS梯度稀释,释后用1μl移液器点在NC膜上,37℃干燥1h备用。溶液喷点

(喷点演示:BIODOTXYZ系列喷点仪器)C\T线溶液前处理:1.过滤,0.22um孔径滤膜2.离心1万转10分钟C\T线喷点工艺与接触划点工艺比较因划膜式为软管将抗体划到膜表面,而膜本身的物理性质为软脆,划管会在其表面留下印痕.划痕容易对层析的金标复合物形成阻力,导致假阳性。干燥干燥方法的比较37度干燥４h：颗粒感较强，易中间白，周边深;低温真空干燥３h：颜色均一，只是两端稍浅，有一定的柔性。试纸条组装

在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4mm宽的试纸条。再将试纸条密封于铝箔袋中，完成产品的组装。切条\包装切条(演示:BIODOTCM4000切条机)包装质量控制1．特异性用30份阴性参考血清进行检测，结果不得出现假阳性；2．敏感性用30份阳性（包括强阳性、中阳性、弱阳性）参考血清进行检测，假阴性率不得超过3份,并用已知抗体效价血清系列稀释测试其最小检出量。3．精密度观察批间、批内差异，CV（%）应不高于10%。4．稳定性检测

37℃放置3天，鉴定指标应达到以上标准。灵敏度＝A/A+C×100%特异度＝D/B+D×100%假阳性率＝B/B+D×100%假阴性率＝C/A+C×100%质量评价试验真阳性真阴性合计阳性ABA＋B阴性CDC＋D总数A＋CB+DA＋B+C+D历史ⅱ岳麓版第13课交通与通讯的变化资料精品课件欢迎使用[自读教材·填要点]一、铁路，更多的铁路1．地位铁路是

建设的重点，便于国计民生，成为国民经济发展的动脉。2．出现1881年，中国自建的第一条铁路——唐山

至胥各庄铁路建成通车。1888年，宫廷专用铁路落成。交通运输开平3．发展(1)原因：①甲午战争以后列强激烈争夺在华铁路的

。②修路成为中国人

的强烈愿望。(2)成果：1909年

建成通车；民国以后，各条商路修筑权收归国有。4．制约因素政潮迭起，军阀混战，社会经济凋敝，铁路建设始终未入正轨。修筑权救亡图存京张铁路二、水运与航空1．水运(1)1872年,

正式成立，标志着中国新式航运业的诞生。(2)1900年前后，民间兴办的各种轮船航运公司近百家，几乎都是在列强排挤中艰难求生。2．航空(1)起步：1918年，附设在福建马尾造船厂的海军飞机工程处开始研制

。(2)发展：1918年，北洋政府在交通部下设“

”；此后十年间，航空事业获得较快发展。轮船招商局水上飞机筹办航空事宜处三、从驿传到邮政1．邮政(1)初办邮政：1896年成立“大清邮政局”，此后又设

，邮传正式脱离海关。(2)进一步发展：1913年，北洋政府宣布裁撤全部驿站；1920年，中国首次参加

。邮传部万国邮联大会2．电讯(1)开端：1877年，福建巡抚在

架设第一条电报线，成为中国自办电报的开端。(2)特点：进程曲折，发展缓慢，直到20世纪30年代情况才发生变化。3．交通通讯变化的影响(1)新式交通促进了经济发展，改变了人们的通讯手段和

，

转变了人们的思想观念。(2)交通近代化使中国同世界的联系大大增强，使异地传输更为便捷。(3)促进了中国的经济与社会发展，也使人们的生活

。台湾出行方式多姿多彩[合作探究·提认知]

电视剧《闯关东》讲述了济南章丘朱家峪人朱开山一家，从清末到九一八事变爆发闯关东的前尘往事。下图是朱开山一家从山东辗转逃亡到东北途中可能用到的四种交通工具。依据材料概括晚清中国交通方式的特点，并分析其成因。提示：特点：新旧交通工具并存(或：传统的帆船、独轮车，近代的小火轮、火车同时使用)。

原因：近代西方列强的侵略加剧了中国的贫困，阻碍社会发展；西方工业文明的冲击与示范；中国民族工业的兴起与发展；政府及各阶层人士的提倡与推动。[串点成面·握全局]一、近代交通业发展的原因、特点及影响1．原因(1)先进的中国人为救国救民，积极兴办近代交通业，促进中国社会发展。(2)列强侵华的需要。为扩大在华利益，加强控制、镇压中国人民的反抗，控制和操纵中国交通建设。(3)工业革命的成果传入中国，为近代交通业的发展提供了物质条件。2．特点(1)近代中国交通业逐渐开始近代化的进程，铁路、水运和航空都获得了一定程度的发展。(2)近代中国交通业受到西方列强的控制和操纵。(3)地域之间的发展不平衡。3．影响(1)积极影响：促进了经济发展，改变了人们的出行方式，一定程度上转变了人们的思想观念；加强了中国与世界各地的联系，丰富了人们的生活。(2)消极影响：有利于西方列强的政治侵略和经济掠夺。1．李鸿章1872年在上海创办轮船招商局，“前10年盈和，成为长江上重要商局，招商局和英商太古、怡和三家呈鼎立之势”。这说明该企业的创办 (

)A．打破了外商对中国航运业的垄断B．阻止了外国对中国的经济侵略C．标志着中国近代化的起步D．使李鸿章转变为民族资本家解析：李鸿章是地主阶级的代表，并未转化为民族资本家；洋务运动标志着中国近代化的开端，但不是具体以某个企业的创办为标志；洋务运动中民用企业的创办在一定程度上抵制了列强的经济侵略，但是并未能阻止其侵略。故B、C、D三项表述都有错误。答案：A二、近代以来交通、通讯工具的进步对人们社会生活的影响(1)交通工具和交通事业的发展，不仅推动各地经济文化交流和发展，而且也促进信息的传播，开阔人们的视野，加快生活的节奏，对人们的社会生活产生了深刻影响。(2)通讯工具的变迁和电讯事业的发展，使信息的传递变得快捷简便，深刻地改变着人们的思想观念，影响着人们的社会生活。2．清朝黄遵宪曾作诗曰：“钟声一及时，顷刻不少留。虽有万钧柁，动如绕指柔。”这是在描写 (

)A．电话B．汽车C．电报 D．火车解析：从“万钧柁”“动如绕指柔”可推断为火车。答案：D[典题例析][例1]上海世博会曾吸引了大批海内外人士利用各种交通工具前往参观。然而在19世纪七十年代，江苏沿江居民到上海，最有可能乘坐的交通工具是 (

)A．江南制造总局的汽车B．洋人发明的火车C．轮船招商局的轮船D．福州船政局的军舰[解析]由材料信息“19世纪七十年代，由江苏沿江居民到上海”可判断最有可能是轮船招商局的轮船。[答案]

C[题组冲关]1．中国近代史上首次打破列强垄断局面的交通行业是(

)A．公路运输 B．铁路运输C．轮船运输 D．航空运输解析：根据所学1872年李鸿章创办轮船招商局，这是洋务运动中由军工企业转向兼办民用企业、由官办转向官督商办的第一个企业。具有打破外轮垄断中国航运业的积极意义，这在一定程度上保护了中国的权利。据此本题选C项。答案：C2.右图是1909年《民呼日报》上登载的一幅漫画，其要表达的主题是(

)A．帝国主义掠夺中国铁路权益B．西方国家学习中国文化C．西方列强掀起瓜分中国狂潮D．西方八国组成联军侵略中国解析：从图片中可以了解到各国举的灯笼是火车形状，20世纪初的这一幅漫画正反映了帝国主义掠夺中国铁路权益。B项说法错误，C项不能反映漫画的主题，D项时间上不一致。答案：A[典题例析][例2]

(2010·福建高考)上海是近代中国茶叶的一个外销中心。1884年，福建茶叶市场出现了茶叶收购价格与上海出口价格同步变动的现象。与这一现象直接相关的近代事业是(

)A．电报业 B．大众报业C．铁路交通业 D．轮船航运业[解析]材料主要反映了信息交流的快捷，故选A。[答案]

A[题组冲关]3．假如某爱国实业家在20世纪初需要了解全国各地商业信息，可采用的最快捷的方式是 (

)A．乘坐飞机赴各地了解B．通过无线电报输送讯息C．通过互联网D．乘坐