细胞工程-第五章 细胞融合与单克隆抗体10.25课件

第五章

细胞融合与单克隆抗体1本章主要内容：细胞融合的基本概念人工诱导细胞融合技术杂种细胞的筛选细胞杂交瘤技术与单克隆抗体人源单克隆抗体2细胞融合（cellfusion)，是指在离体条件下将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生！一、细胞融合3自发细胞融合（一）细胞膜融合

受精过程（二）体内细胞的自发融合

1、肌管的形成2、胚胎着床3、巨细胞和破骨细胞的形成4、肿瘤细胞的融合破骨细胞受精56细胞融合的意义理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。7二、人工诱导细胞融合

诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合化学融合剂诱导融合物理方法（电融合）

8灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞融合，形成杂种细胞（细胞膜具有一定的流动性）生物法：灭活的病毒（丧失感染性、保留抗原结构）10（三）物理方法诱导细胞融合电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。12三、杂种细胞的筛选根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种类型：异核细胞：非同源细胞的融合体。同核细胞：两个相同细胞的融合体。多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。14基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选具有所需性状杂种细胞的筛选常用的杂种细胞筛选方法15四、细胞杂交瘤技术与单克隆抗体16

免疫器官：免疫细胞生成、成熟或集中分布的场所，包括骨髓、胸腺、脾、淋巴结等

免疫细胞（发挥免疫作用的细胞）：1．吞噬细胞2．淋巴细胞（起源骨髓中的造血干细胞）T细胞（在胸腺中成熟）B细胞（在骨髓中成熟）

免疫活性物质：由免疫细胞或其他细胞产生的发挥免疫作用的物质，包括抗体、淋巴因子、溶菌酶等1718抗原（antigen，Ag），是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。抗原的基本性质具有异物性、大分子性和特异性。异物性是指进入机体组织内的抗原物质，必须与该机体组织细胞的成分不相同。大分子性是指构成抗原的物质通常是相对分子质量大于10000的大分子物质，分子量越大，抗原性越强。特异性是指一种抗原只能与相应的抗体或效应T细胞发生特异性结合。20抗体（antibody,Ab)是机体免疫系统在抗原刺激下，由B细胞或记忆细胞增殖分裂成浆细胞所产生的可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。21抗原决定簇（Antigenicdeterminant）是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(epitope).抗原以抗原决定簇与相应淋巴细胞的抗原受体结合而激活淋巴细胞引起免疫应答。淋巴细胞表面的抗原识别受体通过识别抗原决定簇而区分“自身”与“异己”。抗原也是以抗原决定簇与相应抗体特异性结合而发生反应的。23细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团24多克隆抗体（Polyclonalantibody,PcAb）：针对多种抗原决定簇的混合抗体26单克隆抗体（Monoclonalantibody,McAb）由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体27

28一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖杂种细胞动物细胞培养技术设计方案：动物细胞融合创始人：米尔斯坦单克隆抗体既能产生特异性抗体，又能大量繁殖30

单克隆和多克隆抗体的比较和用途特异性敏感性均一性McAbPcAb低差无高强有1、用于免疫学检测，辅助临床诊断2、McAb用于亲和层析，分离微量可溶性抗原3、标记的McAb用于基础研究，了解细胞分化等4、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗。31单克隆抗体在医学中的应用检验医学诊断试剂（1）病原微生物抗原抗体的检测（2）肿瘤抗原的检测（3）免疫细胞及其亚群的检测（4）激素测定（5）细胞因子的测定蛋白质的提纯肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术酶标仪32动物细胞融合技术B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有杂种细胞才能活动物细胞培养五、单克隆抗体制备过程获得产生相应抗体的B淋巴细胞筛选阳性杂交细胞HAT培养基单抗的纯化、检测33动物细胞融合技术B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有杂种细胞才能活动物细胞培养五、单克隆抗体制备过程获得产生相应抗体的B淋巴细胞筛选阳性杂交细胞HAT培养基单抗的纯化、检测34B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有目的杂种细胞才能活HAT培养基35HAT选择培养基HAT选择培养基组分

次黄嘌呤核苷酸（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A)（二氢叶酸还原酶抑制剂）胸腺嘧啶核苷酸（thymidine,T)36细胞DNA合成途径1.主要途径：

氨基酸谷氨酰胺尿核苷单磷酸

叶酸及其衍生物（必不可少的媒介）2.补救途径：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）

胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）原料：次黄嘌呤核苷酸（H）、胸腺嘧啶核苷酸（T）37B、B×B、B×瘤

—、瘤—×瘤—、瘤—只有目的杂种细胞才能活HAT培养基××××HGPRT—/TK—√388-杂氮鸟嘌呤Br-脱氧嘧啶核苷HGPRT—TK—39筛选阳性杂交细胞酶联免疫吸附测定ELISA4041免疫标记技术放射物标记技术酶标技术免疫荧光技术其他标记技术酶联免疫吸附技术酶免疫组化技术双抗体夹心法竞争法双抗原夹心法间接法双位一点法4243ELISA原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关44ELISA基本的实验过程包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色4546封闭474849505152535455动物细胞融合技术B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有杂种细胞才能活动物细胞培养五、单克隆抗体制备过程获得产生相应抗体的B淋巴细胞筛选阳性杂交细胞HAT培养基单抗的纯化、检测5657585960616263视频：单克隆抗体的制备64动物细胞融合技术B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有杂种细胞才能活动物细胞培养五、单克隆抗体制备过程获得产生相应抗体的B淋巴细胞筛选阳性杂交细胞HAT培养基单抗的纯化、检测65单抗纯化方法：盐析凝胶过滤离子交换层析亲和层析法66用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。

血清50%饱和度硫酸胺

上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）33%饱和度硫酸胺上清沉淀拟球蛋白r球蛋白（1）盐析法67（2）凝胶过滤法干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。交联葡聚糖凝胶(Sephadex)琼脂糖凝胶(Sepharose)68（3）离子交换层析法DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴离子交换剂CM纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离子交换剂69（4）亲和层析法将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原）70单克隆抗体特性理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于实验标准化和大量制备71单抗鉴定方法：效价（凝集反应、Elisa、放免）特异性（免疫荧光、Elisa、间接血凝、免疫印迹）72原理：WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。73聚丙烯酰胺凝胶电泳74考马斯亮蓝染色蛋白电泳结果7576（2）免疫组织化学技术77第五节人源单克隆抗体主要困难（1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力；（2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的；（3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。78EB病毒转化技术人鼠杂交瘤单克隆抗体人人杂交瘤单克隆抗体转基因动物制备单克隆抗体严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体人源单克隆抗体制备7980全球单抗市场情况812008年单抗药物销售前5位名单

全球单抗市场情况排名药品名称公司销售额/亿美元适应症1利妥兮单抗罗氏/基因泰克13.49非何杰淋巴瘤2英利昔单抗强生/先灵葆雅12.46类风湿等免疫性疾病3曲妥珠单抗 罗氏/基因泰克10.14乳腺癌4贝伐单抗罗氏/基因泰克8.9