药品质量控制中的生物检定课件

药品质量控制中的生物检定上海市食品药品检验所药理毒理室/药物安全评价中心主任唐黎明药品质量控制中的生物检定药品质量控制中的生物检定一、药品质量控制中的生物检定概述二、效价测定的基本原理和技术要求三、生物检定中安全性检查制定原则四、安全性检查的基本原理和技术要求五、生物检定的发展药品质量控制中的生物检定一、药品质量控制中的生物检定概述

一、药品质量控制中的生物检定概述

生物检定（bioassay）的定义

生物检定法是利用生物体包括整体、离体组织、器官、细胞和微生物等评估药物生物活性的一种方法。它以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计在一定条件下比较供试品和相当的标准品或对照品所产生的特定反应，通过等反应剂量间比例的运算或限值剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的效价、生物活性或杂质引起的毒性。

一、药品质量控制中的生物检定概述

生物检定（bioass产品生物活性的信息（

与临床疗效一致）评价批与批之间稳定性和一致性监测不曾预料、不易发现的构象变化所有变化的综合效应工艺与方法验证一、概述：作用

产品生物活性的信息（与临床疗效一致）一、概述：作用

药品质量控制项目性状、鉴别、检查和含量生物检定------检查类和含量类。药品（生化药品、中药）生物制品（疫苗、血液制品）

一、概述：应用范围

药品质量控制项目

一、概述：应用范围

体内检测：以整体动物为生物体，能反映药物对人体的作用方式，是最经典的生物效价检测方法体内测定法的有蛋白质、肽类激素等

一、概述：生物检定的方法体内检测：

一、概

体外检测离体动物器官测定法细胞培养（促进细胞生长、抑制细胞生长、间接保护细胞）测定法生化酶促反应测定法免疫学活性测定法

一、概述：生物检定的方法

体外检测

一、概述：定性（鉴别）

对能用理化方法测定的药品，生物效价检测可降为鉴别项的定性测定

一、概述：生物检定的方法定性（鉴别）

一、概述：生半定量法（活性检查）理化测定占主导地位效价测定可归于活性检查项采用半定量方法设定限值，不需精密生物统计尽可能减少实验动物或其他生物体用量

一、概述：生物检定的方法

半定量法（活性检查）

一、概述：生物定量法效价（potency）测定是生物检定的主要内容

一、概述：生物检定的方法定量法

一二、效价测定的基本要求和基本方法二、效价测定的基本要求和基本方法二、效价测定的基本要求原则：相关性重复性灵敏性适用性定性定量二、效价测定的基本要求原则：二、效价测定的基本要求

生物检定标准品(Ｓ)标准品都有标示效价，以效价单位（u）表示，其含义和相应的国际标准品的效价单位一致二、效价测定的基本要求生物检定标准品(Ｓ)二、效价测定的基本要求实验设计与生物统计：

等反应剂量对比可靠性测验

可信限和可信限率二、效价测定的基本要求实验设计与生物统计：二、效价测定的基本方法直接测定法：直接测得药物对各个动物最小有效量或最小致死量的检定方法洋地黄及其制剂的效价测定------鸽最小致死量法二、效价测定的基本方法二、效价测定的基本方法量反应平行线测定法：要求在一定剂量范围内，S和T的对数剂量x和反应或反应的特定函数y呈直线关系当S和T的活性组分基本相同时，两直线平行二、效价测定的基本方法量反应平三、生物检定中安全性检查制定原则

三、生物检定中安全性检查制定原则

三、安全性检查制定原则1.静脉注射细菌内毒素（或热原）三、安全性检查制定原则1三、安全性检查制定原则1.静脉注射异常毒性检查所用原料系动物来源或微生物发酵液提取物，组分结构不清晰或有可能污染毒性杂质，且又缺乏有效的理化分析方法的静脉用注射剂，应考虑设立异常毒性检查三、安全性检查制定原则三、安全性检查制定原则1.静脉注射过敏反应检查所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时，组分结构不清晰，且有可能污染异源蛋白或未知过敏反应物质的静脉用注射剂，如缺乏相关的理化分析方法且临床发现过敏反应，应考虑设立过敏反应检查项三、安全性检查制定原则三、安全性检查制定原则1.静脉注射降压物质或组胺类物质所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时,组分结构不清晰或有可能污染组胺、类组胺样降血压物质的静脉用注射剂，应考虑设立降压物质或组胺类物质检查项三、安全性检查制定原则三、安全性检查制定原则2.肌内注射异常毒性检查过敏反应检查细菌内毒素检查临床用药剂量较大，生产工艺易污染细菌内毒素的肌内注射用注射剂，应考虑设细菌内毒素检查项三、安全性检查制定原则2三、安全性检查制定原则3.特殊途径的注射剂椎管内、腹腔、眼内等特殊途径的注射剂，其安全性检查项目一般应符合静脉用注射剂的要求必要时增加其它安全性检查项目，如刺激性检查、细胞毒性检查三、安全性检查制定原则3.特殊三、安全性检查制定原则4.注射剂辅料注射剂辅料使用面广，用量大，来源复杂，与药品的安全性直接相关应根据辅料来源、性质、用途、用法用量，配合理化分析方法，设立必要的安全性检查项目三、安全性检查制定原则三、安全性检查制定原则5.其它原料和生产工艺特殊的注射剂必要时应增加特殊的安全性检查项目，如病毒检查、细胞毒性检查等三、安全性检查制定原则三、安全性检查制定原则

中药注射剂安全性检查项目热原（或细菌内毒素）异常毒性过敏反应溶血与凝聚降压物质检查（功能主治中具有与升压相关内容的注射剂除外）三、安全性检查制定原则

中药注射剂安全性检查项目热原（或细菌三、安全性检查制定原则方法适用性（设定限值前研究）确定限值应进行三批以上供试品的检查验证三、安全性检查制定原则方法适用性（设定限值前研究）四、安全性检查的基本原理和技术要求四、安全性检查的基本原理和技术要求（一）热原检查法本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定（一）热原检查法本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，（一）热原检查法动物：家兔，健康合格，体重1.7kg以上体温：38.0~39.6℃的范围内，且最高与最低体温相差不超过0.4℃的家兔结果判断：＜0.6℃总和＜1.3℃（一）热原检查法动物：家兔，健康合格，体重1.7kg以上（一）热原检查法热原检查限值的确定一般为人用每公斤体重每小时最大供试品剂量的3～5倍供试品注射体积每公斤体重一般不少于0.5mL，不超过10mL限值剂量应不影响正常体温（一）热原检查法热原检查限值的确定（二）细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法的分类①定性法：凝胶法②半定量法：凝胶半定量试验③定量法：光度测定法浊度法（终点浊度法、动态浊度法）显色基质法（终点显色法、动态显色法）（二）细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法的分类（二）细菌内毒素检查法确定内毒素限值L=K/ML为供试品的细菌内毒素限值M为人用每公斤体重或每平方米每小时的临床最大用药剂量注射剂K=5EU/（kg·h）放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg·h）鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h）K=194EU/（m2·h）（二）细菌内毒素检查法确定内毒素限值（二）细菌内毒素检查法干扰试验新药的内毒素检查试验前建立内毒素检查法时鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验（二）细菌内毒素检查法干扰试验（二）细菌内毒素检查法凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法（二）细菌内毒素检查法凝胶法（二）细菌内毒素检查法光度测定法浊度法利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法终点浊度法动态浊度法（二）细菌内毒素检查法光度测定法

（二）细菌内毒素检查法光度测定法显色基质法利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法终点显色法动态显色法（二）细菌内毒素检查法光度测定法（三）异常毒性检查法本法系给予小鼠一定剂量的供试品溶液，在规定时间内观察小鼠出现的死亡情况，以判定供试品是否符合规定的一种方法（三）异常毒性检查法本法系给予小鼠一定剂量的供试品溶液，在规（三）异常毒性检查法小鼠，体重17～20g，5只

分别给予供试品溶液0.5ml结果判断全部小鼠在给药后48小时内不得有死亡（三）异常毒性检查法小鼠，体重17～20g，5只

分别给予供（三）异常毒性检查法限值确定急性毒性数据（LD50或LD1）限值至少应小于LD1可信限下限的1/3（建议采用1/3～1/6）静脉注射最大剂量0.8ml/20g仍未见毒性反应或死亡，可以此作为检查限值（三）异常毒性检查法限值确定

（四）溶血与凝聚检查法本法系将一定量供试品与2%的家兔红细胞混悬液混合，温育一定时间后，观察其对红细胞状态是否产生影响的一种方法（四）溶血与凝聚检查法本法系将一定量供试品与2%的家兔红细

（四）溶血与凝聚检查法结果判断当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生，若供试品管中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚，判定供试品符合规定；若供试品管的溶液在3小时内发生溶血和（或）凝聚，判供试品不符合规定（四）溶血与凝聚检查法

（四）溶血与凝聚检查法限值一般对注射剂原液和稀释液进行溶血与凝聚实验研究一般应高于临床最大使用浓度（四）溶血与凝聚检查法限值

（五）过敏反应检查法

本法系将一定量的供试品溶液注入豚鼠体内，间隔一定时间后静脉注射供试品溶液进行激发，观察动物出现过敏反应的情况，以判定供试品是否引起动物全身过敏反应（五）过敏反应检查法

本法系将一定量的供试品溶液注入豚鼠体

（五）过敏反应检查法检查法

豚鼠6只，隔日每只每次腹腔注射供试品溶液0.5ml，共3次，进行致敏均分为2组，每组3只，分别在首次注射后第14日和第21日，由静脉注射供试品溶液1ml进行攻击（五）过敏反应检查法

（五）过敏反应检查法结果判断

静脉注射供试品溶液30分钟内，不得出现过敏反应。如有竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏3声、连续咳嗽3声、紫疳和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现二便失禁、步态不稳或倒地、抽搐、休克、死亡现象之一者，判供试品不符合规定（五）过敏反应检查法结果判断

（五）过敏反应检查法限值确定测定供试品对豚鼠腹腔（或皮下）和静脉给药的无毒性反应剂量在首次给药后14、21、28天中选择最佳激发时间致敏和激发剂量应小于该途径的急性毒性反应剂量,适当参考临床剂量一般激发剂量大于致敏剂量（五）过敏反应检查法限值确定

（六）降压物质检查法

本法系比较组胺对照品（S）与供试品（T）引起麻醉猫血压下降的程度，以判定供试品中所含降压物质的限度是否符合规定

（六）降压物质检查法

本法系比较组胺对照品（S）与供试品

（六）降压物质检查法方法：体重2kg以上的猫供试品按一定注射速度静脉注射不同剂量，观察供试品对猫血压反应的剂量反应关系（六）降压物质检查法方法：

（六）降压物质检查法结果判断

dT反应平均值不大于ds反应平均值，并且dT反应平均值任何一次反应值不大于组胺高剂量反应值，即判定供试品降压物质检查符合规定（六）降压物质检查法结果判断

（六）降压物质检查法限值和要求供试品与对照品注射体积应相同，通常为0.1～1ml/kg临床单次用药剂量的1/5～5倍作为降压反应物质检查剂量限值如供试品有一定降压作用，则可按最大无降压反应剂量的1/2-1/4作为限值剂量供试品原液静脉注射1ml/kg剂量未见降压反应，该剂量可作为给药限值（六）降压物质检查法限值和要求

（七）组胺检查法本法系将一定浓度的供试品和组胺对照品分别观察豚鼠离体回肠出现的收缩反应幅度并加以比较，以判定供试品是否符合规定的一种方法（七）组胺检查法本法系将一定浓度的供试品和组胺对照品分别观五、生物检定的发展五、生物检定的发展

（一）现状

生物检定的优缺点生测法的优点：

生测法的缺点：

（一）现状

生物检（二）效价测定品种和范围的变化

1．仪器的改进2．抗生素的含量测定3．删除生物检定品种4．取消的生物效价测定5．简化与减少6．需要改进提高的生化药品种（二）效价测定品种和范围的变化1．仪器的改进（三）安全性检查的变化细菌内毒素替代家兔热原检查增订异常毒性增订过敏反应增订无菌/微生物限度增订降压物质检查增订制法要求和特殊的安全性检查（三）安全性检查的变化细菌内毒素替代家兔热原检查

（四）中药质量控制体系中生物检定的应用不应苛求中药生物检定指标的代表性不要以理化检定的方法学质量苛求中药生物检定方法中药质量生物检定不等于中药药理实验须具备定量药理学与药检分析的双重属性和要求（四）中药质量控制体系中生物检定的应用不应苛求中药生物检定

（四）中药质量控制体系中生物检定的应用存在的问题应用的局限性造模型的选择：功能主治多成本高，时间相对长生物误差较大对照品的选择难度（四）中药质量控制体系中生物检定的应用存在的问题药品质量控制中的生物检定上海市食品药品检验所药理毒理室/药物安全评价中心主任唐黎明药品质量控制中的生物检定药品质量控制中的生物检定一、药品质量控制中的生物检定概述二、效价测定的基本原理和技术要求三、生物检定中安全性检查制定原则四、安全性检查的基本原理和技术要求五、生物检定的发展药品质量控制中的生物检定一、药品质量控制中的生物检定概述

一、药品质量控制中的生物检定概述

生物检定（bioassay）的定义

生物检定法是利用生物体包括整体、离体组织、器官、细胞和微生物等评估药物生物活性的一种方法。它以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计在一定条件下比较供试品和相当的标准品或对照品所产生的特定反应，通过等反应剂量间比例的运算或限值剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的效价、生物活性或杂质引起的毒性。

一、药品质量控制中的生物检定概述

生物检定（bioass产品生物活性的信息（

与临床疗效一致）评价批与批之间稳定性和一致性监测不曾预料、不易发现的构象变化所有变化的综合效应工艺与方法验证一、概述：作用

产品生物活性的信息（与临床疗效一致）一、概述：作用

药品质量控制项目性状、鉴别、检查和含量生物检定------检查类和含量类。药品（生化药品、中药）生物制品（疫苗、血液制品）

一、概述：应用范围

药品质量控制项目

一、概述：应用范围

体内检测：以整体动物为生物体，能反映药物对人体的作用方式，是最经典的生物效价检测方法体内测定法的有蛋白质、肽类激素等

一、概述：生物检定的方法体内检测：

一、概

体外检测离体动物器官测定法细胞培养（促进细胞生长、抑制细胞生长、间接保护细胞）测定法生化酶促反应测定法免疫学活性测定法

一、概述：生物检定的方法

体外检测

一、概述：定性（鉴别）

对能用理化方法测定的药品，生物效价检测可降为鉴别项的定性测定

一、概述：生物检定的方法定性（鉴别）

一、概述：生半定量法（活性检查）理化测定占主导地位效价测定可归于活性检查项采用半定量方法设定限值，不需精密生物统计尽可能减少实验动物或其他生物体用量

一、概述：生物检定的方法

半定量法（活性检查）

一、概述：生物定量法效价（potency）测定是生物检定的主要内容

一、概述：生物检定的方法定量法

一二、效价测定的基本要求和基本方法二、效价测定的基本要求和基本方法二、效价测定的基本要求原则：相关性重复性灵敏性适用性定性定量二、效价测定的基本要求原则：二、效价测定的基本要求

生物检定标准品(Ｓ)标准品都有标示效价，以效价单位（u）表示，其含义和相应的国际标准品的效价单位一致二、效价测定的基本要求生物检定标准品(Ｓ)二、效价测定的基本要求实验设计与生物统计：

等反应剂量对比可靠性测验

可信限和可信限率二、效价测定的基本要求实验设计与生物统计：二、效价测定的基本方法直接测定法：直接测得药物对各个动物最小有效量或最小致死量的检定方法洋地黄及其制剂的效价测定------鸽最小致死量法二、效价测定的基本方法二、效价测定的基本方法量反应平行线测定法：要求在一定剂量范围内，S和T的对数剂量x和反应或反应的特定函数y呈直线关系当S和T的活性组分基本相同时，两直线平行二、效价测定的基本方法量反应平三、生物检定中安全性检查制定原则

三、生物检定中安全性检查制定原则

三、安全性检查制定原则1.静脉注射细菌内毒素（或热原）三、安全性检查制定原则1三、安全性检查制定原则1.静脉注射异常毒性检查所用原料系动物来源或微生物发酵液提取物，组分结构不清晰或有可能污染毒性杂质，且又缺乏有效的理化分析方法的静脉用注射剂，应考虑设立异常毒性检查三、安全性检查制定原则三、安全性检查制定原则1.静脉注射过敏反应检查所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时，组分结构不清晰，且有可能污染异源蛋白或未知过敏反应物质的静脉用注射剂，如缺乏相关的理化分析方法且临床发现过敏反应，应考虑设立过敏反应检查项三、安全性检查制定原则三、安全性检查制定原则1.静脉注射降压物质或组胺类物质所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时,组分结构不清晰或有可能污染组胺、类组胺样降血压物质的静脉用注射剂，应考虑设立降压物质或组胺类物质检查项三、安全性检查制定原则三、安全性检查制定原则2.肌内注射异常毒性检查过敏反应检查细菌内毒素检查临床用药剂量较大，生产工艺易污染细菌内毒素的肌内注射用注射剂，应考虑设细菌内毒素检查项三、安全性检查制定原则2三、安全性检查制定原则3.特殊途径的注射剂椎管内、腹腔、眼内等特殊途径的注射剂，其安全性检查项目一般应符合静脉用注射剂的要求必要时增加其它安全性检查项目，如刺激性检查、细胞毒性检查三、安全性检查制定原则3.特殊三、安全性检查制定原则4.注射剂辅料注射剂辅料使用面广，用量大，来源复杂，与药品的安全性直接相关应根据辅料来源、性质、用途、用法用量，配合理化分析方法，设立必要的安全性检查项目三、安全性检查制定原则三、安全性检查制定原则5.其它原料和生产工艺特殊的注射剂必要时应增加特殊的安全性检查项目，如病毒检查、细胞毒性检查等三、安全性检查制定原则三、安全性检查制定原则

中药注射剂安全性检查项目热原（或细菌内毒素）异常毒性过敏反应溶血与凝聚降压物质检查（功能主治中具有与升压相关内容的注射剂除外）三、安全性检查制定原则

中药注射剂安全性检查项目热原（或细菌三、安全性检查制定原则方法适用性（设定限值前研究）确定限值应进行三批以上供试品的检查验证三、安全性检查制定原则方法适用性（设定限值前研究）四、安全性检查的基本原理和技术要求四、安全性检查的基本原理和技术要求（一）热原检查法本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定（一）热原检查法本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，（一）热原检查法动物：家兔，健康合格，体重1.7kg以上体温：38.0~39.6℃的范围内，且最高与最低体温相差不超过0.4℃的家兔结果判断：＜0.6℃总和＜1.3℃（一）热原检查法动物：家兔，健康合格，体重1.7kg以上（一）热原检查法热原检查限值的确定一般为人用每公斤体重每小时最大供试品剂量的3～5倍供试品注射体积每公斤体重一般不少于0.5mL，不超过10mL限值剂量应不影响正常体温（一）热原检查法热原检查限值的确定（二）细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法的分类①定性法：凝胶法②半定量法：凝胶半定量试验③定量法：光度测定法浊度法（终点浊度法、动态浊度法）显色基质法（终点显色法、动态显色法）（二）细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法的分类（二）细菌内毒素检查法确定内毒素限值L=K/ML为供试品的细菌内毒素限值M为人用每公斤体重或每平方米每小时的临床最大用药剂量注射剂K=5EU/（kg·h）放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg·h）鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h）K=194EU/（m2·h）（二）细菌内毒素检查法确定内毒素限值（二）细菌内毒素检查法干扰试验新药的内毒素检查试验前建立内毒素检查法时鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验（二）细菌内毒素检查法干扰试验（二）细菌内毒素检查法凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法（二）细菌内毒素检查法凝胶法（二）细菌内毒素检查法光度测定法浊度法利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法终点浊度法动态浊度法（二）细菌内毒素检查法光度测定法

（二）细菌内毒素检查法光度测定法显色基质法利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法终点显色法动态显色法（二）细菌内毒素检查法光度测定法（三）异常毒性检查法本法系给予小鼠一定剂量的供试品溶液，在规定时间内观察小鼠出现的死亡情况，以判定供试品是否符合规定的一种方法（三）异常毒性检查法本法系给予小鼠一定剂量的供试品溶液，在规（三）异常毒性检查法小鼠，体重17～20g，5只

分别给予供试品溶液0.5ml结果判断全部小鼠在给药后48小时内不得有死亡（三）异常毒性检查法小鼠，体重17～20g，5只

分别给予供（三）异常毒性检查法限值确定急性毒性数据（LD50或LD1）限值至少应小于LD1可信限下限的1/3（建议采用1/3～1/6）静脉注射最大剂量0.8ml/20g仍未见毒性反应或死亡，可以此作为检查限值（三）异常毒性检查法限值确定

（四）溶血与凝聚检查法本法系将一定量供试品与2%的家兔红细胞混悬液混合，温育一定时间后，观察其对红细胞状态是否产生影响的一种方法（四）溶血与凝聚检查法本法系将一定量供试品与2%的家兔红细

（四）溶血与凝聚检查法结果判断当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生，若供试品管中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚，判定供试品符合规定；若供试品管的溶液在3小时内发生溶血和（或）凝聚，判供试品不符合规定（四）溶血与凝聚检查法

（四）溶血与凝聚检查法限值一般对注射剂原液和稀释液进行溶血与凝聚实验研究一般应高于临床最大使用浓度（四）溶血与凝聚检查法限值

（五）过敏反应检查法

本法系将一定量的供试品溶液注入豚鼠体内，间隔一定时间后静脉注射供试品溶液进行激发，观察动物出现过敏反应的情况，以判定供试品是否引起动物全身过敏反应（五）过敏反应检查法

本法系将一定量的供试品溶液注入豚鼠体

（五）过敏反应检查法检查法

豚鼠6只，隔日每只每次腹腔注射供试品溶液0.5ml，共3次，进行致敏均分为2组，每组3只，分别在首次注射后第14日和第21日，由静脉注射供试品溶液1ml进行攻击（五）过敏反应检查法

（五）过敏反应检查法结果判断

静脉注射供试品溶液30分钟内，不得出现过敏反应。如有竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏3声、连续咳嗽3声、紫疳和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现二便失禁、步态不稳或倒地、抽搐、休克、死亡现象之一者，判供试品不符合