试验一质粒DNA的提取-西安医学院基础医学试验教学中心课件

DNA质粒DNA的提取西安医学院生化教研室DNA质粒DNA的提取西安医学院生化教研室质粒DNA的提取了解碱法提取质粒的原理；掌握碱法提取质粒的方法。实验目的质粒DNA的提取了解碱法提取质粒的原理；实验目的特点：超螺旋共价闭环结构,小的2-3kb，大的可达数百kb可插入外源DNA片段，≤15kb含有标记基因，可使宿主菌获得某些性状，如：amp抗性，tet抗性。分为紧密型和松弛型质粒质粒：存在于细菌染色体之外的、具有自我复制能力的环状双链DNA分子。特点：超螺旋共价闭环结构,小的2-3kb，大的可达数百kplasmidmapplasmidmapExperimentMaterialExperimentMaterial碱裂解法抽提质粒DNA的原理：——染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异质粒DNA的提取条件染色体DNA质粒DNApH=12.6变性不完全变性pH=中性不能复性复性离心沉淀（染色体DNA+RNA+蛋白-SDS复合物）存在于上清中碱裂解法抽提质粒DNA的原理：质粒DNA的提取条件染色体DN在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构质粒的超螺旋结构质粒的超螺旋结构培养细菌，收集与裂解细菌，质粒DNA的分离除去细菌染色体DNA、RNA和蛋白质。无水乙醇沉淀质粒DNA。实验原理质粒DNA的提取培养细菌，收集与裂解细菌，质粒DNA的分离实验原理质粒DNA主要试剂：solutionⅠ：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-Cl（pH8.0）

10mmol/LEDTAsolutionⅡ:0.2mol/LNaOH1%SDS（新鲜配制）solutionⅢ:3mol/L醋酸钾2mol/L醋酸TE缓冲液：10mmol/LTris-Cl（pH8.0）1mmol/LEDTA

主要试剂：（1）取1.5ml细菌培养液至epp管中，10000rpm离心1min。（2）弃上清，重复一次，倒扣在滤纸片上使液体流尽。（3）加入100μl溶液Ⅰ，用枪吹散重悬菌体，振荡器上剧烈振荡60s。（4）加入200μl溶液Ⅱ，快速温和颠倒epp管5次，以混匀内容物（千万不要振荡），室温放置3分钟。（5）加入150μl溶液Ⅲ，颠倒epp管5次，使沉淀混匀，放置3分钟。

实验步骤（1）取1.5ml细菌培养液至epp管中，10000rpm离（6）12000rpm离心5分钟，转移上清液至一新epp管中。（7）加入等体积的酚/氯仿（1:1）

，振荡混匀，12000rpm离心3分钟，吸取上清转移至另一新epp管中。（8）加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀，室温放置3分钟，12000rpm离心5分钟。（9）弃上清，加入1ml70%乙醇，漂洗沉淀一次，12000rpm离心2分钟。（10）弃上清，将管倒置于滤纸上使液体流尽，干燥10分钟。（11）加入20-50μl蒸馏水(按沉淀大小而定)，溶解DNA，-20℃冰箱中储存。

（6）12000rpm离心5分钟，转移上清液至一新epp管超螺旋开环线性超螺旋开环线性实验步骤挑取单菌落接种到100mlLB液体培养基中（含amp）放入37℃振荡培养箱内培养过夜取1.5mL菌液加入epp管倒掉上清扣干，加入solutionI100uL离心10000rpm/1min质粒DNA的提取剧烈振荡打散菌体加入solutionII200uL，温和颠倒混匀放置3min重复一次实验步骤挑取单菌落接种到100mlLB液体培养基中（含amp实验步骤加入solutionIII150uL,立即混匀放置3min离心12000rpm，5min小心将含有质粒的DNA上清液移至另一epp管中（以下需轻微操作）加入等体酚/氯仿，振荡混匀离心12000rpm，3min质粒DNA的提取转移上清液至新epp管加入2倍体积冰冷无水乙醇，混匀室温放置3min实验步骤加入solutionIII150uL,立即混匀实验步骤离心12000rpm，5min弃上清液，加入1ml70%乙醇洗涤沉淀加入蒸馏水20-50uL溶解质粒，取5uL做酶切实验（液体尽量倒净并晾干）离心12000rpm，2min质粒DNA的提取实验步骤离心12000rpm，5min弃上清液，加入1mDNA质粒DNA的提取西安医学院生化教研室DNA质粒DNA的提取西安医学院生化教研室质粒DNA的提取了解碱法提取质粒的原理；掌握碱法提取质粒的方法。实验目的质粒DNA的提取了解碱法提取质粒的原理；实验目的特点：超螺旋共价闭环结构,小的2-3kb，大的可达数百kb可插入外源DNA片段，≤15kb含有标记基因，可使宿主菌获得某些性状，如：amp抗性，tet抗性。分为紧密型和松弛型质粒质粒：存在于细菌染色体之外的、具有自我复制能力的环状双链DNA分子。特点：超螺旋共价闭环结构,小的2-3kb，大的可达数百kplasmidmapplasmidmapExperimentMaterialExperimentMaterial碱裂解法抽提质粒DNA的原理：——染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异质粒DNA的提取条件染色体DNA质粒DNApH=12.6变性不完全变性pH=中性不能复性复性离心沉淀（染色体DNA+RNA+蛋白-SDS复合物）存在于上清中碱裂解法抽提质粒DNA的原理：质粒DNA的提取条件染色体DN在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构质粒的超螺旋结构质粒的超螺旋结构培养细菌，收集与裂解细菌，质粒DNA的分离除去细菌染色体DNA、RNA和蛋白质。无水乙醇沉淀质粒DNA。实验原理质粒DNA的提取培养细菌，收集与裂解细菌，质粒DNA的分离实验原理质粒DNA主要试剂：solutionⅠ：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-Cl（pH8.0）

10mmol/LEDTAsolutionⅡ:0.2mol/LNaOH1%SDS（新鲜配制）solutionⅢ:3mol/L醋酸钾2mol/L醋酸TE缓冲液：10mmol/LTris-Cl（pH8.0）1mmol/LEDTA

主要试剂：（1）取1.5ml细菌培养液至epp管中，10000rpm离心1min。（2）弃上清，重复一次，倒扣在滤纸片上使液体流尽。（3）加入100μl溶液Ⅰ，用枪吹散重悬菌体，振荡器上剧烈振荡60s。（4）加入200μl溶液Ⅱ，快速温和颠倒epp管5次，以混匀内容物（千万不要振荡），室温放置3分钟。（5）加入150μl溶液Ⅲ，颠倒epp管5次，使沉淀混匀，放置3分钟。

实验步骤（1）取1.5ml细菌培养液至epp管中，10000rpm离（6）12000rpm离心5分钟，转移上清液至一新epp管中。（7）加入等体积的酚/氯仿（1:1）

，振荡混匀，12000rpm离心3分钟，吸取上清转移至另一新epp管中。（8）加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀，室温放置3分钟，12000rpm离心5分钟。（9）弃上清，加入1ml70%乙醇，漂洗沉淀一次，12000rpm离心2分钟。（10）弃上清，将管倒置于滤纸上使液体流尽，干燥10分钟。（11）加入20-50μl蒸馏水(按沉淀大小而定)，溶解DNA，-20℃冰箱中储存。

（6）12000rpm离心5分钟，转移上清液至一新epp管超螺旋开环线性超螺旋开环线性实验步骤挑取单菌落接种到100mlLB液体培养基中（含amp）放入37℃振荡培养箱内培养过夜取1.5mL菌液加入epp管倒掉上清扣干，加入solutionI100uL离心10000rpm/1min质粒DNA的提取剧烈振荡打散菌体加入solutionII200uL，温和颠倒混匀放置3min重复一次实验步骤挑取单菌落接种到100mlLB液体培养基中（含amp实验步骤加入solutionIII150uL,立即混匀放置3min离心12000rpm，5min小心将含有质粒的DNA上清液移至另一epp管中（以下需轻微操作）加入等体酚/氯仿，振荡混匀离心1