IPP在草酸钙结晶评分中应用的可行性研究

IPP在草酸钙结晶评分中应用的可行性研究*基金支持：湖北省卫生厅科研重点项目*基金支持：湖北省卫生厅科研重点项目鄂卫通[2013]20号JX6A09湖北省医学领军人才培养工程专项经费资助作者简介：曹秋实（1986-）女，湖北中医药大学2012级博士。研究方向：中医药防治慢性肾脏疾病；杨柳（1987-）女，湖北中医药大学2012级硕士。研究方向：中医药防治慢性肾脏疾病；通讯作者简介：巴元明（1961--）男，湖北省中医院肾病科教授、主任医师，博士生导师。研究方向：中医药防治慢性肾脏疾病及名医经验传承研究。通讯地址：湖北省武汉市武昌区花园山4号湖北省中医院。邮编：430061FeasibilityCalculatingofthecalciumoxalatecrystallizationScorewithImage-ProPlus曹秋实1，杨柳1通讯作者：巴元明2湖北中医药大学，湖北武汉，430061；2.湖北省中医院，湖北武汉，430061)摘要：目的探究IPP图像分析软件评估结晶情况可行性、可靠性和稳定性。方法由A、B两位研究员分别对同一批草酸钙结晶照片进行人工评分和应用IPP评分，通过统计学方法检验A、B评分的一致性；一周后，A研究员再次进行人工评分和应用IPP评分，通过统计学方法检验A前后评分的一致性。结果人工评分草酸钙结晶，两位研究员及同一研究员前后所给的评分，其一致性均差；应用IPP评分，两位研究员及同一研究员前后所给的评分，其一致性均较高。结论应用IPP图像分析软件对草酸钙结晶情况进行评分是可行性，而且此方法具有可靠性和稳定性，适合广泛应用于尿路结石相关的实验研究中。关键词：Image-ProPlus；草酸钙结晶；评分Keywords:Image-ProPlus;CalciumOxalateCrystallization;Score尿路结石是一种常见的疾病，患病率估计在1%-15%[1]，治疗后易复发，10年复发率高达50%[2]，严重影响了人体的健康。尿路结石中75%～85%为含钙结石，而草酸钙结石又占含钙结石的92%[3]。在各种有关尿路结石的研究中，观察肾组织中草酸钙结晶形成情况，是目前较为客观的评价指标之一。通过对肾组织中草酸钙结晶的观察就可以直观判断草酸钙结石造模的成功与否，通过对结晶数目、形态、分布的可以探讨草酸钙结石的形成机制，通过判定结晶评分多少就可以就可评价不同药物在抑制结晶形成及促进结晶排出疗效。草酸钙结晶评分是尿路结石的实验研究中非常重要的内容，是对结石形成程度的量化评估，是由研究者在光学显微镜下观察肾脏切片中结晶情况，并按评分标准作出评分[4]。目前，实验中多采用人工评分法，通过形态分级[5]、计数分级[6]等判定标准进行评分，该方法受观察者主观因素影响较大，而且较为粗略，可靠性和稳定性并不理想。Image-Pro.Plus(IPP)[7]是MediaCybernetics公司研发的图像分析软件包，是一个集图象获取、处理、分析于一身的开发平台[8]，可以对所得图像进行客观、定量、准确分析。因此，为实现草酸钙结晶评分的客观化、定量化和精确化，我们采用IPP图像分析软件，对草酸钙结石大鼠模型的肾脏Von-Kossa’s染色切片进行分析处理，研究其能否在精确、客观、定量评估结晶情况，并分析其应用的可行性、可靠性和稳定性。1材料与方法1.1材料：(1)仪器及软件：Image-Pro.Plus(IPP)6.0，购自MediaCybernetics公司；NikonECLIPSE80i科研级显微镜其附带NIS-Elements专业图像分析软件。(2)实验试剂：乙二醇、氯化铵、草酸铵均为分析纯。乙二醇(批号20121206)，国药集团化学试剂有限公司生产；氯化铵(批号20120612)，天津永大化学试剂有限公司生产；\o"石蜡切片冯库萨（VONKOSSA）钙染色试剂盒"石蜡切片冯库萨（VONKOSSA）钙染色试剂盒，上海杰美基因医药科技有限公司。(3)实验动物：由湖北省实验动物研究中心提供SPF级雄性健康Wistar大鼠15只，体重180-220g，合格证SCXK(鄂)2008-0005。1.2方法：(1)分组及给药适应性饲养1周后，随机分为3组，每组5只。空白对照组(简称空白组)，给予常规饲料+去离子水喂养，每天灌胃1ml生理盐水；模型组，给予常规饲料+1%乙二醇自由饮水+每天2%氯化铵2ml灌胃[3]喂养；治疗组，在造模的基础上给予每天25%枸橼酸钾2ml灌胃。各组大鼠均在相同的条件下饲养，实验周期28天。实验结束后，大鼠称重后，10%水合氯醛0.4ml/100g腹腔注射麻醉，经腹取左肾置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，作常规切片(厚度为2μｍ)，每只大鼠选取5张切片，共75张。每张切片由研究人员在200倍视野、同一光源、亮度及对比度条件下，在肾皮质处随机选取5个视野进行拍照，以5个每视野的平均值来表示该片的结晶情况。(2)评分方法：分别采用人工评分法和IPP软件评分法进行评分，按国内多采用形态分级作为判定标准[5]，即0分=无结晶；1分=有散在的结晶亮点；2分=广泛的不成堆或局限结晶；3分=有成堆结晶散在不连接；4分=结晶成堆且互相连接；5分=广泛成堆结晶，连接成片。人工对草酸钙结晶评分：按照盲法要求，对375张切片图像进行随机编号，由两位研究员分别观察每张图像中的结晶分布和数量情况，按上述评分方法评分，记录每人观察评分的分值及所用时间。比较两人评分差异，并作一致性检验。一周后，其中一位研究员再次对图像观察评分，比较其两次评分的差异，检验其一致性。IPP软件对草酸钙结晶评分：1)确定IPP测量草酸钙结晶的最佳参数(如图1)：选出以上两位研究员评分一致的图像，按分值归类后，用IPP软件进行数据处理。计算各图像中结晶的面积、吸光度及两者乘积的均值和标准差，比较这些参数与人工评分分值的相关性，选出相关性高的最佳参数，用聚类分析方法将最佳参数数值范围与各人工评分分值所对应的，使IPP测量草酸钙结晶具有可行性。2)检验IPP测量草酸钙结晶可靠性和稳定性：由两位研究员各自用IPP软件，选取合适的RGB分色参数，并结合确定结晶测量参数，编制成“宏”，对375张图像进行批量测算并记录所用时间。比较两位研究员的RGB分色参数设置差异和确定的参数测算值差异，并作一致性检验，以检验可靠性；其中一位研究员于一周后重复上述流程，比较其前后两次的测算差异，并作一致性检验，以检验稳定性。图1肾组织切片VonKossa’s染色照片(×200)及IPP对草酸钙结晶面积测量图2统计学方法：人工评分采用Kappa检验进行一致性分析；人工评分各分值对应的最佳参数分界值确定采用快速聚类分析法[9,10]；RGB分色参数、最佳参数测算值的一致性分析采用组内相关系数(ICC)检验[11]。3结果3.1人工对草酸钙结晶评分情况：不同研究员的评分见表格1，A、B两位研究员分别评分的数据经Kappa检验一致性分析后，其Kappa值为0.3835，加权Kappa值为0.6718；A前后两次的评分见表格2，其Kappa值为0.4239，加权Kappa值为0.7516；结果表明：同一批肾脏切片，两位研究员及同一研究员前后所给的评分，其一致性均差。表格SEQ表格\*ARABIC1不同研究员评分比较研究员B研究员A合计率0分1分2分3分4分5分0分2400000240.3201分12220070.0932分021322100.1333分01133190.1204分012423120.1605分002236130.173合计256814101275率0.3330.0800.1070.1870.1330.160表格SEQ表格\*ARABIC2研究员A前后两次评分的比较后次前次合计率0分1分2分3分4分5分0分2500000250.3331分02320070.0932分022622140.1873分023312110.1474分00022260.0805分000156120.160合计256814101275率0.3330.0800.1070.1870.1330.1600.3333.2IPP测量结晶的最佳参数用IPP软件测量草酸钙结晶的面积、吸光度及两者乘积，与人工评分值进行比较，得到Spearman相关系数分别为0.8826、0.7948和0.8173，故以面积作为IPP测量结晶的最佳参数；用聚类分析方法将测量结晶面积与各人工评分分值所对应的，使IPP测量草酸钙结晶具有可行性，具体分界值见表格3。表格3形态分级评分各分值所对应的Area值和聚类分析方法确定的分界值（像素）项目0分1分2分3分4分5分Area(m±s)312.3±233.53879.7±2493.253479.3±31285.4137630.4±30491.8239340.8±27127.0337416.0±33143.8对应IPP分界范围＜4832.04832.0~53641.053641.0~108463.4108463.4~202119.1202119.1~307458.9＞307458.93.3RGB分色参数IPP测量结晶的情况A、B两位研究员选取的RGB分色参数分别为：A为R：45~167；G：5~123；B：5~104；B为R：43~167；G：3~123；B：0~104。两者测得的结晶面积，经方差分析，χ2=0.05，P=0.854，ICC=0.9327；A研究员前后选取的RGB分色参数后测得的结晶面积，经方差分析，χ2=0.54，P=0.436，ICC=0.9015。结果表明：同一批肾脏切片，两位研究员及同一研究员前后所给的评分，其一致性较高。3.4人工评分与IPP评分时间的比较人工评分375张草酸钙结晶照片，A、B两位研究员所用时间分别为335min和350min，A研究员前后两次所用时间分别为335min和315min；应用IPP评分375张草酸钙结晶照片，A、B两位研究员所用时间分别为225min和235min，A研究员前后两次所用时间分别为225min和200min。结果表明：应用IPP进行草酸钙结晶评分可以缩短实验研究时间。4讨论在尿路结石的实验研究中，无论是建立与筛选动物模型，探究尿路结石形成机理，还是探讨药物对尿路结石的防治效果，都需要观察实验动物草酸钙结晶的数量及分布情况。一般多采用镜下观察Von-Kossa’s染色的肾组织切片，因为Von-Kossa’s染色下草酸钙晶体呈黑褐色如图1，与肾脏本身染色形成鲜明对比，镜下和图像分析软件中均便于观察结晶数量、形态及分布。对于草酸钙结晶的评分标准的选择，国内多采用形态分级评分法[5]，即以结晶的形态如“点、堆、连接、片等”、范围如“散在、局限、广泛”来分级评分；国外多采用计数分级评分[6]，即以晶体的数量来分级评分。虽然与形态分级评分法比较，计数分级评分法的量化度较高，但实际观察中，结晶多呈堆叠状附着于肾小管，精确地结晶计数很难实现。本研究选择了形态分级评分法，虽然避免立体计数的难题，但研究员对草酸钙结晶的评分主观性依旧很大。近年来，IPP图像处理软件被广泛运用于医学领域，尤其是在免疫组化图像分析和处理中。笔者在从事尿路结石的实验研究中发现，对于同一套草酸钙结晶的切片，不同研究员所给出的评分不尽相同。本研究将IPP图像处理软件应用于草酸钙结晶的评分，用聚类分析方法将形态分级评分法各分值范围在IPP中得到量化；经反复试验，确定RGB分色最佳参数设置，取R为189～212；G为206～255；B为125～255，使结晶人工选取范围与自动选定范围的重合度最佳，从而使草酸钙结晶的评分在IPP上得到客观、定量、准确的分析。草酸钙结晶IPP评分的应用不仅实现了计算机自动测量草酸钙结晶面积等数据，避免了主观性介入，提高草酸钙结晶评分的可靠性和稳定性，并可以通过“宏”的编制和运用，可批量、快速测量的图像，节约了研究时间。研究发现应用IPP对草酸钙结晶进行评分，不同位研究员用IPP对同一批结晶图像评分及同一研究员先后对同一批图像进行结晶评分均显示出高度的一致性，表明其可靠性与稳定性远优于人工评分。IPP图像处理软件能精确、客观、定量评估结晶情况，并验证了其应用的可行性、可靠性和稳定性，期望草酸钙结晶IPP评分法可以得到广泛的应用，在尿路结石的相关研究中发挥其作用。参考文献：[1]WEIN,KAVOUSSI,NOVICK,etal.Campbell-WalshUrology[M].郭应禄,周利群,主译.坎贝尔外科学.北京大学医学出版社,2009:1440.[2]JungleeN,HarriesSE,DaviesN,etal.Pheochromocytomainpregnancy:whenisoperativeinterventionindicated?[J].JWomensHealth,2007,16(9):1362-1365.[3]田晶,郭宏骞,孙西钊等.大鼠草酸钙结石饮食相关性病因学模型的制备及评价[J].医学研究生学报,2012,25