第二代测序数据分析原理优选ppt资料

第二代测序数据分析原理(yuánlǐ)第一页，共69页。第二代测序数据分析原理(yuánlǐ)徐汪节第二页，共69页。三代(sāndài)DNA测序技术之比较第一代测序技术(jìshù)：Sanger测序法第二代测序技术(jìshù)：454测序……

第三代测序技术(jìshù)：？直接测序法：？第三页，共69页。2022/11/223第一代测序技术：

Sanger测序法

——简便(jiǎnbiàn)、快速第四页，共69页。2022/11/224逐渐被遗忘(yíwàng)的测序技术：

Maxam-Gilbert的DNA化学降解法

第五页，共69页。2022/11/225Sanger测序的局限(júxiàn)通过几十年的改进，第1代测序仪的读长可以超过1000bp，原始数据的准确率可以高达99.999%，测定每千碱基序列的成本是0.5美元,每天的数据通量可以达到60万碱基。但是，不管怎么改进，第1代测序技术在速度和成本方面(fāngmiàn)都已达到了极限（因为对电泳分离技术的依赖,使其难以进一步提升分析的速度和提高并行化程度，并且难以通过微型化降低测序成本）。在此种情况下，第二代测序技术（Next-generationsequencing)应运而生。第六页，共69页。2022/11/226概要(gàiyào)主要(zhǔyào)的测序平台基因组分析原理转录组分析原理分析策略的选择第七页，共69页。第二代测序技术(jìshù)454测序IlluminaSOLIDPolonatorCompleteGenomics……第八页，共69页。2022/11/228454第九页，共69页。2022/11/2293)将满足长度条件的UniGene与多个近源物种进行进化分析(fēnxī)，得到序列的保守性和进化特性；Illumina差异基因火山图，可以(kěyǐ)观察到差异基因总体分布KEGG代谢(dàixiè)通路分析结构(jiégòu)变异SNV识别与计算结构(jiégòu)变异SNV识别与计算IlluminaSanger测序的局限(júxiàn)第二代测序技术(jìshù)：454测序……第二代测序技术(jìshù)：454测序……ABISOLiDRe-sequencing第二代测序技术(jìshù)：454测序……GO功能(gōngnéng)分类主要的测序平台(píngtái)ChIP-seqSOLID第十页，共69页。2022/11/2210Illumina第十一页，共69页。2022/11/2211其他(qítā)PolonatorCompleteGenomics……第十二页，共69页。2022/11/2212第十三页，共69页。2022/11/2213第二代测序技术(jìshù)的共同点1将目标DNA剪切为小片段2单个小片段DNA分子(fēnzǐ)结合到固相表面3单分子(fēnzǐ)独立扩增4每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号5高分辨率的成像系统。第十四页，共69页。2022/11/2214第二代测序技术(jìshù)的局限与第一代测序仪相比，以合成测序为基础的下一代测序平台速度显著提高，成本明显降低。每台设备每天产出千兆碱基的序列(xùliè)不足为奇。但是,除了罗氏的454平台之外，读长短成了下一代测序平台的致命伤，这主要是由于DNA簇中存在的光学信号移相造成的。而应运而生的单分子测序技术是解决这一问题的一种方法。第十五页，共69页。2022/11/2215第三代测序技术(jìshù)：单分子测序HelicosBiosciencesVisiGenPacificBiosciencesMobiousNexusI……第十六页，共69页。2022/11/2216第十七页，共69页。2022/11/2217直接(zhíjiē)测序法在所有上述三代测序技术中，序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下，通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上过程中释放出的光学信号而间接确定的。除了需要昂贵的光学监测系统，还要记录、存储并分析大量的光学图像，这都使仪器的复杂性和成本增加。依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用，在目前测序成本中比例相当大。直接读取序列信息，不使用化学试剂，对于进一步降低测序成本是非常(fēicháng)可取的。为了实现这样的目标，目前就有很多人在研究纳米物理技术。在全球，许多公司和组织，如Agilent，DNAElectronics，IBM,NabSys，OxfordNanoporeTechnologies，Sequenom等都在进行纳米孔测序的开发，不同的只是采用的方法或策略。第十八页，共69页。2022/11/2218第十九页，共69页。2022/11/2219第二十页，共69页。2022/11/2220SecondgenerationsequenceRoche454MetagenomicsDenovosequencingRNA-seqillumiaSolexaDenovosequencingRe-sequencingRNA-seq(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)Meth-seqABISOLiDRe-sequencingChIP-seq

RNA-seq第二十一页，共69页。ExperimentsDNA-seq:denovo,resequencingRNA-seq:mRNA,ncRNA,smRNA...ChIP-seq:ChromatinImmunoPrecipitationMethyl-seq:methylatedDNA(epigenome)第二十二页，共69页。主要的测序平台(píngtái)基因组分析原理转录组分析原理分析策略的选择第二十三页，共69页。SequencingGlossaryReads.Acollectionofclonesthatover-samplethetargetgenome.Pair-endreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofasequencing-libraryclone.Mate-pairreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofamate-pairlibraryclonewhichinsertsizeisusually>1kb.Insertsize.Thesizeoftheclone-insertfromwhichaclone-endpairistaken.Contig.Theresultofjoininganoverlappingcollectionofsequencereads.Scaffold.Theresultofconnectiingnon-overlappingcontigesbyusingpir-endreads.N50size.Asappliedtocontigsorscaffolds,thatsizeabovewhich50%odtheassembled第二十四页，共69页。第二十五页，共69页。第二十六页，共69页。第二十七页，共69页。 全基因组denove分析(fēnxī)工具第二十八页，共69页。分析(fēnxī)所需工具BowtiesoftwareSAMtoolsTopHatsoftareCufflinkssoftwareCummeRbundsoftware第二十九页，共69页。外显子组分析(fēnxī)工具第三十页，共69页。主要的测序平台基因组分析原理转录组分析原理分析策略(cèlüè)的选择第三十一页，共69页。常规(chángguī)分析TranscriptsquantificationSplicingsitesdiscoveryandquantificationGenediscoverySNP/INDELdetectionAllelespecificexpression第三十二页，共69页。第三十三页，共69页。第三十四页，共69页。第三十五页，共69页。UniGene拼接(pīnjiē)目的(mùdì)：将预处理后reads进行拼接，得到拼接结果。

原理：应用deBruijngraphpath算法对reads进行denovo拼接；对上一步的拼接结果，再用HamiltonPath算法拼接。

结果：UniGene序列，UniGene统计信息，序列长度分布图第三十六页，共69页。第三十七页，共69页。3.数据库注释(zhùshì)目的：对拼接得到的UniGene进行(jìnxíng)功能注释

原理：通过blast+算法将拼接得到的UniGene序列与数据库进行(jìnxíng)比对

结果：比对结果表格，物种分布统计和Evalue分布统计

第三十八页，共69页。第三十九页，共69页。UniGene表达(biǎodá)分析目的：UniGene定量分析。

原理(yuánlǐ)：以UniGene为reference，分别将每个样本的reads进行referencemapping,从而得到每个样本在每个UniGenes中的一个reads覆盖度，然后应用RPKM/FPKM标准化公式对富集片段的数量进行归一化。

RPKM：ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads，公式下:第四十页，共69页。UniGene表达分布图，1X，5X分别为FPKM=1，FPKM=5分界点，可以(kěyǐ)大体观察到低表达，中表达以及高表达的比例关系第四十一页，共69页。UniGene样本(yàngběn)间表达相关性散点图第四十二页，共69页。样本间表达差异程度的MA图，可以体现差异表达总体(zǒngtǐ)偏差第四十三页，共69页。UniGene表达(biǎodá)差异分析目的：对定量结果进行统计检验分析，找出差异表达UniGene

原理：双层过滤筛选差异基因

FC值筛选：采用Fold-change(FC)，表达差异倍数进行第一层此的差异基因筛选

FDR检验：一般采用卡方检验中的fisher精确检验进行p值检验，采用BenjaminiFDR(Falsediscoveryratio)校验方法对p值进行假阳性检验，即，通过FDR显著性参数进行第二(dìèr)层次的差异基因筛选。

第四十四页，共69页。组间差异基因上调与下调个数统计，可以通过此图观察(guānchá)上调与下调的一个总体趋势第四十五页，共69页。差异基因火山图，可以(kěyǐ)观察到差异基因总体分布第四十六页，共69页。GO功能(gōngnéng)分类

目的：利用数据库注释信息将UniGene进行GO功能分类。

原理(yuánlǐ)：利用数据库的注释结果，应用blast2GO算法进行GO功能分类，得到所有序列在GeneOntology的三大类：molecularfunction,cellularcomponent,biologicalprocess的各个层次所占数目，一般取到14层。

结果：MF，BP，CC三大分类结果文件以及UniGene2GO关系列表，三大类别中第二层次上的柱状分布图和饼图，GO功能的层次分布图。

第四十七页，共69页。第四十八页，共69页。第四十九页，共69页。第五十页，共69页。第五十一页，共69页。KEGG代谢(dàixiè)通路分析目的：对拼接得到UniGene进行KEGGpathway映射(yìngshè)。

原理：应用KEGGKAAS在线pathway比对分析工具对拼接得到的UniGene进行KEGG映射(yìngshè)分析。

结果：标记的Pathway通路图。第五十二页，共69页。第五十三页，共69页。IPApathwayanalysis

(://ingenuity/)第五十四页，共69页。COG注释(zhùshì)目的：对拼接得到UniGene进行COG功能分类。

原理：利用blast+算法将拼接得到的UniGene与CDD库中的COG/KOG库进行比对，进行COG功能分类预测，将其映射到COG分类中。

结果(jiēguǒ)：COG分类分布情况图。第五十五页，共69页。第五十六页，共69页。SSR重复(chóngfù)序列注释目的：对拼接得到UniGene进行SSR简单重复序列的查找。

原理：筛选(shāixuǎn)标准：单核苷酸重复的次数在10次或10次以上，二核苷酸重复的次数在6次或6次以上，三至六核苷酸重复的次数在5次或5次以上。同时，也筛选(shāixuǎn)中间被少数碱基(间隔小于100或等于100)打断的不完全重复的SSR。

结果：重复序列的信息文件以及统计文件。

第五十七页，共69页。LncRNA预测(yùcè)目的：对拼接得到的UniGene进行LncRNA(LongnoncodingRNA)预测。

原理：通过以下过程对UniGene进行过滤，最终得到候选LncRNA序列。

1)Unigenelength>200bp；

2)UnigeneORF(OpenReadingFrame)length<300；

3)将满足长度条件的UniGene与多个近源物种进行进化分析(fēnxī)，得到序列的保守性和进化特性；

4)根据上述的特性和已知数据库中coding、noncoding区域的特性建立编码筛选模型；

5)将符合noncoding模型的UniGene与Pfam等蛋白域数据库进行同源性比对，进一步去除可能的编码特性，最终得出LncRNA预测结果。第五十八页，共69页。第五十九页，共69页。RSAM‐0