发酵2项目二：培养基灭菌课件

项目二培养基及设备灭菌2006年8月15日,国家食品药品监督管理局召开新闻发布会，通报了对安徽华源生物药业有限公司生产的克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液（欣弗）引发的药品不良事件调查结果：现已查明，安徽华源生物药业有限公司违反规定生产，是导致这起不良事件的主要原因。经查，该公司2006年6月至7月生产的克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液未按批准的工艺参数灭菌，降低灭菌温度，缩短灭菌时间，增加灭菌柜装载量，影响了灭菌效果。经中国药品生物制品检定所对相关样品进行检验，结果表明，无菌检查和热源检查不符合规定。

由此可见，当前无论是食品、药品或生物产品，在生产过程都要重视灭菌和消毒工作，确保安全。引言概述灭菌：是指用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物包括营养细胞、细菌芽孢和孢子的方法。消毒：是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物的措施。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。巴氏消毒法消毒牛奶加热60℃维持30min。在工业中一般都笼统地称为杀菌或灭菌。灭菌是为了保证进行纯培养（纯种）发酵。生产菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产能力。杂菌的生长速度有时比生产菌生长得快，结果使反应器中以杂菌为主。杂菌会污染最终产品。杂菌所产生的物质，使提取产物时发生困难。杂菌降解所需要的产物。发酵如污染了噬菌体，可使生产菌株发生溶菌现象。杂菌可引起的后果物理灭菌热力灭菌（如干热灭菌、湿热灭菌、流通蒸汽灭菌）、射线灭菌、超声波消毒和微波消毒等。化学灭菌液体灭菌（如75%乙醇、1%聚维酮碘溶液、0.1%～0.2%新洁尔灭、2%左右的酚或煤酚皂溶液）和气体灭菌（如臭氧、环氧乙烷、甲醛、丙二醇、甘油和过氧乙酸蒸汽等）。单元知识一灭菌方法干热灭菌：是指相对湿度在20％以下的高热，有火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。湿热灭菌：又成为高压蒸汽灭菌。在实验室或工业生产中，对于培养基、管道、设备的灭菌，通常采用蒸汽加热到一定的温度，并保温一段时间的灭菌方法，称之为湿热灭菌。热力灭菌火焰灼烧灭菌。火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。热空气灭菌。利用高温干燥空气（160－170℃

）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。干热法原理：蒸汽在冷凝时释放出大量潜能，蒸汽具有强大穿透力，蒸汽的湿热破坏菌体蛋白质和核酸的化学键，使酶失活，微生物因代谢障碍而死亡。效果比同温度下干热好。湿热法通常用紫外线、高能量的电磁波等原理：紫外线波长在260nm杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收，可产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成正比。射线灭菌缺点：穿透力不大。距照射物<1.2m为宜。应用：无菌室，医院。注意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用射线灭菌：r射线，穿透力强，适用于堆积物品的灭菌。利用频率在20～200kHz的声波作用下，使细菌细胞机械破裂和原生质迅速游离，达到消毒目的。如超声洗手器，用于手的消毒。超声洗涤机，用于注射器的清洁和初步的消毒处理。超声波消毒微波消毒利用微波的就是一种高频电磁波，其杀菌的作用原理，一为热效应，所及之处产生分子内部剧烈运动，使物体里外湿度迅速升高；一为综合效应，诸如化学效应、电磁共振效应和场致力效应。目前已广泛应用于食品、药品的消毒，用微波灭菌手术器械包、微生物实验室用品等亦有报告。微波波消毒原理：应用化学制剂破坏细菌代谢机能杀菌剂如重金属离子；抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。注意：与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类以及微生物所处的环境有关。常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、石碳酸福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等化学灭菌0.%~0.25%KMnO4溶液、0.5%~1%漂白粉溶液、75%酒精、0.25%新洁尔灭、10%甲醛溶液、苯酚溶液、来苏尔化学灭菌化学物质名称有效浓度化学物质名称有效浓度新洁尔灭(苯扎溴铵)0.25%甲醛37%杜灭芬0.25%戊二醛2%高锰酸钾0.1%-0.25%苯酚0.1%-0.15%漂白粉5%过氧乙酸0.02%-0.2%酒精75%焦碳酸二乙酯0.01%-0.1%煤酚皂（来苏尔）1%—5%

化学灭菌是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。工业上培养基灭菌使用的方法是湿热灭菌。湿热灭菌简便、有效、经济。达到要求的无菌程度（N=10-3）即灭菌1000次，有一次是失败的，残留了一个活菌体。要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不必要的。因此在工程设计中常取N=10-3。这是工业上对培养基要求达到无菌程度标准。单元知识二培养基灭菌概述对数残留定律：在灭菌过程中，微生物在高温高湿的环境中的热死亡速率与任一瞬间残存的活菌数成正比。热死动力学方程

-dN/dt=KNN--残存的活菌数（个）t--灭菌时间（min）

K--杀菌速率常数（min-1）或叫死亡速率常数。K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。

dN/dt--菌的瞬时变化率，即死亡速率。理论灭菌时间的确定一、微生物的热死动力学将方程积分后得：t=2.303/KlgN0/NsN0=开始灭菌(t=0)时原有活菌数Ns=经时间t后残存活菌数反应速度常数k值是微生物耐热性的一种特征，它随微生物的种类和灭菌温度而异。一、微生物的热死动力学K值因不同的微生物种类不同、不同的生理状态、不同的外界环境，差别很大，实质上，K值是微生物热阻的一种表示形式，热阻是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。微生物的热阻越大，K值也越大。例如：芽孢在121℃时，K=60/s；营养体，在121℃，k=60～6*1010/s。

需注意的几个问题对于NS，如果取NS=0，那么t=∞，这显然是与现实情况不符。通常取NS=10-3，这个数值理解可以理解为灭菌1000次，有一次是失败的，残留了一个活菌体。要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不必要的。因此在工程设计中常取N=10-3。这是工业上对培养基要求达到无菌程度标准。这个数值的取值的大小，也间接反应了该生产过程中的技术管理水平。N0，NS如何取值？需注意的几个问题3、理论灭菌时间，只可以用于工程计算中，在实践过程中，因蒸汽的压力问题（不稳定）、蒸汽的流量问题有很大差别，甚至培养基中的固体颗粒的大小、培养基的粘度等因素，都会影响灭菌效果。因此在实际生产中，通常采用经验数值，即歇灭菌，121℃，20～30min；连续灭菌，137℃，15～30s，在维持罐中保温8～20min。需注意的几个问题微生物的热死灭动力学接近一级反应动力学，灭菌温度与菌死亡的反应速度常数关系可用K=Ae-E/RTK----杀菌速率常数（死亡速率常数）（min-1）A----频率因子（阿累尼乌斯常数），因菌种的不同而异。E-----活化能（J/mol）T-----绝对温度（K）T=t+273.15R-----气体常数8.36J/mol.K(或1.98cal/mol.K)e=2.718阿累尼乌斯方程分子在所指的条件下进行反应所必需具备的能量，这个能量是活化能，活化能在这里指微生物被杀灭必须获得的能量。从阿累尼乌斯方程，可以得出活化能E的大小对K值有重大影响，其他条件相同时E愈高，K值愈低，热死速率愈慢。K是E和T的函数，K对T的变化率与E有关。反应的活化能E愈高，温度T的变化对K的影响愈大。微生物死亡速度常数K是微生物耐热性的一种特征，它随着微生物种类和灭菌温度而异。相同温度下，微生物越耐热，k值越小；微生物越不耐热，k值越大。反之，k值越小，微生物越耐热，灭菌时间就长；k值越大，微生物越不耐热，灭菌时间就短。例如，在121℃，细菌芽孢的K值为1min-1，而营养细胞的K值最大1010为1min-1。二、高温短时灭菌法同一种微生物在不同的温度下，k值也不同。由灭菌时间公式和阿累尼乌斯方程可以看出，灭菌温度越高，k值越大，需灭菌时间越短。如嗜热脂肪芽孢杆菌Fs1518在104℃时灭菌k值为0.03421min-1，而在131℃时k值15min-1。二、高温短时灭菌法湿热灭菌时，微生物被热死的同时，培养基的营养成分也遭到了一定的破坏。特别是氨基酸和维生素。培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。在热的作用下某些营养成分还可能因受热而相互之间发生反应，造成培养基中原有营养成分的数量变化，因而影响培养基质量。二、高温短时灭菌法例如：还原糖与氨基酸、肽、蛋白质等发生化学反应，形成5-羟甲基糠醛和类黑精。在对嗜热脂肪芽孢杆菌孢子进行杀灭时，达到相同灭菌效果（N/N0=10-16）时，不同的灭菌温度对维生素B1损失影响很大。二、高温短时灭菌法实验表明细菌孢子热死反应的活化能E很高，营养成分破坏的活化能较低。随着温度上升，菌体孢子死亡速度常数增加倍数大于培养基成分破坏速度常数增加倍数。所以当温度升高时，杂菌死亡速度要比营养成分破坏速度快得多。根据这一原理，培养基灭菌采用高温短时的方法能达到灭菌的效果，又可以减少营养成分的破坏。为什么要采用高温短时灭菌？二、高温短时灭菌法灭菌温度（˚C）达到灭菌程度的时间（min）维生素B1的损失（%）100110120130140150843757.60.8510.1070.01599.9989271031灭菌温度、时间和维生素B1损失的关系二、高温短时灭菌法达到相同灭菌效果，T越高，所需t越短采用高温短时（HTST）灭菌效果好，既能达到灭菌的效果，又可以减少营养成分的破坏。

二、高温短时灭菌法pH值6.0~8.0时，微生物耐热性好，最不易死亡pH<6.0时，微生物比较容易死亡。所以培养基的pH越低，所需的时间也越短，湿热灭菌效果好。pH值三、影响培养基灭菌的因素高浓度的有机物会包于细胞周围，形成一层薄膜，影响热的传导。而高浓度的盐类、色素则削弱其耐热性，灭菌较易。培养基成分三、影响培养基灭菌的因素

泡沫泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去，杀死其中的杂菌。颗粒小，容易灭菌，颗粒大，则难灭菌。颗粒三、影响培养基灭菌的因素分批灭菌连续灭菌空罐灭菌将培养基置于反应器中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后维持一定时间，再冷却到发酵温度，然后接种发酵将培养基在罐外连续进行加热、维持和冷却然后进入空消后的发酵罐的杀菌方法就是连续灭菌。四、灭菌操作分批灭菌包括升温、保温、降温三个过程分批灭菌分批灭菌分批灭菌操作要点打开所有的排气阀门，三路进蒸汽当培养基的温度升到灭菌温度时，进入保温操作阶段，此时要求与反应器相连的所有管道处于两个状态：进汽或出汽，目的是对管道进行灭菌。保温期间，要求罐压：0.09-0.10MPa，温度：118—121℃，时间：30min。灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，保证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌。分批灭菌的优缺点优点分批灭菌不需其他设备，操作简单易行。省去了连消设备和操作，节省了动力。染菌的危险性较小人工操作较方便对培养基中固体物质含量较多时更为适宜缺点升温慢、降温也慢，增加了发酵前的准备时间，延长了发酵周期，设备利用低，而且无法采用高温短时灭菌。加热、维持、降温连续灭菌生培养液先在板式换热器2内进行预热，此处用到热集成，即灭菌后的培养液作为加热介质，把热量传递给生培养基，同时使灭菌后的培养液得到初步冷却。在板式换热器3内预热后的培养液被加热到灭菌温度。加热源为蒸汽在维持段维持一段时间，完成灭菌在板式换热器2处被预冷。在板式换热器1处，经过预冷的培养液继续被冷却水进一步冷却至设定温度。连续灭菌连续灭菌连续灭菌连续灭菌连续灭菌优缺点优点高产量缩短灭菌周期，营养成分破坏少蒸汽负荷均匀，锅炉利用率高，操作方便发酵罐利用率高较易自动控制，降低劳动强度糖受蒸汽的影响较少缺点设备比