组学研究及其临床应用

生物组学与研究方法1组学内容2第一节

组学Genomics3（遗传因子）是具有遗传效应的DN

段。4组(genome)一个细胞（或

）所载的全部遗传信息，它代表了一种生物所具有的全部遗传信息。对真核生物体而言，

组是指一套完整单倍体DNA（DNA）及线粒体或叶绿体DNA的全部序列，既有编码序列，也有大量存在的非编码序列。5组学(genomics)是阐明整个

组的结构、结构与功能关系以及之间相互作用的科学。6一、组学概述结构功能比较组学(structural

genomics)组学(functional

genomics)组学(comparative

genomics)7组学分类及研究内容结构

组学是研究整个

组的遗传作图、物理作图及

；组所有的功能

组学是认识和分析和非序列及功能，主要研究内容包括组的表达、组功能注释、

组表达调控网络及机制的研究等。比较

组学通过对不同物种的组比较，组序列、功能及进化关系等方得到各物种面信息。8二、结构组学的研究策略结构组学(structuralgenomics)是通过人类组计划(HGP)的实施来完成的。HGP的内容就是制作高分辨率的人类遗传图和物理图，最终完成人类和其它重要模式生物全部组DNA序列测定，因此HGP属于结构组学范畴。9人类组作图的重要策略遗传作图物理作图转录作图10（一）遗传作图遗传作图（genetic

map

）又称连锁作图（linkagemap

）。指确定连锁的遗传标志位点在一条上的排列顺序以及它们之间的相对遗传距离，用厘摩尔根（centi-Morgan，cM）表示，当两个遗传标记之间的重组值为1%时，图距即为1

cM。11RFLP限制性片段长度多态性（RFLP，RestrictionFragment

Length

Polymorphism）RFLP是根据不同品种（

）

组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的

、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（

）的DNA水平的差异（即多态性）12血友病甲的RFLP分析血友病甲/血友病甲A/因子Ⅷ缺乏症genotype13血友病甲的RFLP分析性连锁遗传疾病，女性传递，

发病14单核苷酸多态性（SNP）单核苷酸多态性(single

nucleotide

polymorphisms,SNPs)，主要是指在

组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA

序列多态性。15遗传作图的缺陷分辨率有限精确性不够交换是随机发生的组中有些区域是重组热点倒位、重复等

结构变异会限制交换重组16（二）物理作图物理作图（Physical

map

）是以DNA序列长度（如bp、kb或Mb）为图距，标定遗传标记位置的

组图谱。17人类部分物理图谱18物理作图的方法荧光原位杂交作图（fluorescent

in

situhybridization

map

，FISH

map

）限制性酶切作图（restriction

map）克隆

群作图（clone

contig

map

）19FISH杂交确定分子标记所在的位将荧光标记的探针与置20限制性酶切法完全降解：选择合适的限制性内切酶将待测DNA链（标记放射性同位素）完全降解，降解产物经凝胶电泳分离后进行自显影。部分降解：以末端标记使待测DNA的一条链带上示踪同位素，然后用上述相同酶部分降解该DNA链。比较上述二步的自显影图谱，根据片段大小及彼此间的差异即可排出酶切片段在DNA链上的位置。21克隆

群作图组DN

段与载体整合进行克隆群。基本策略：将克隆，获得载体：自主

原点在宿主高效表达、稳定遗传多克隆位点筛选标记22YAC载体YAC(Yeastartificialchromosome)即酵母人工染色体，具有酵母

的特性，以酵母细胞为宿主，能在酵母细胞中。以YAC为载体，可以乘载1~2Mb的大片段DNA，是物理作图中最早利用的大片段DNA载体。23人工

必备结构元件自主

序列（autonomously

replicationsequences，ARS）

：含有酵母菌中

DNA

进行双向复制所必须的信号

；着丝粒（centromere，CEN）：负责

向子细胞的传递；端粒（

omere，

）：对

DNA末端起保护作用。2425YAC

载体——pYAC42627YAC

载体的缺陷存在嵌合现象，即一个YAC克隆中子可能来自两个或多个不同片段（嵌合克隆约占总克隆的

5%～50%）。YAC克隆稳定性差，片段会出现缺失（deletion）

和

重排（rearrangement）

现象。YAC

与宿主细胞的大小相近，插入片段的分离、纯化较，转化效率亦较低。28BAC载体BAC(Bacterial

artificial

chromosome)即细菌人工，具有细菌，能在细菌细胞中的特性，以细菌细胞为宿主。以BAC为载体，可以乘载约300kb的大片段DNA，是物理作图中目前用得最多的大片段DNA载体。优点：单拷贝

，不会因重组发生嵌合；DNA的提取简单，便于机械化操作。29新型的BAC

载体：通过α互补的原理筛选含有

片段的重组子并设计了用于回收克隆DNA的Not

Ⅰ酶切位点Not

Ⅰ识别序列，位点十分稀少。用于克隆

DNA子。的Sp6

启动子、

T7

启动装载外源

DNA后的重组质粒通过氯霉素抗性和

Lac

Z

的

α

–

互补筛选。3031BAC载体的优点以大肠杆菌为宿主，转化效率高，提取方便片段较大（数kb数百kb）；遗传稳定，嵌合、重组少；DNA单拷贝存在，适于传统菌落培养，可采用菌落原位杂交筛选目地

；克隆位点两侧有T7和SP6启动子，可

RNA探针或对

片段

。32菌落原位杂交筛选目的33（三）转录作图（

EST

）作为转录图谱：利用表达序列

标记所构建的分子遗传图谱EST（

expressed

sequence

tag）：通过从cDNA文库中随机挑取的克隆进

序所获得的部分cDNA的5'或3'端序列称为表达序列，一般长300～500bp左右。34STS将与mRNA

3’-UTR对应的cDNA

3’-EST序列通过分子杂交或PCR，进行

组定位位点（，即可构成由表达

组成的序列Sequence

tagged

site,

STS）图谱。STS序列长度为100~500bp，在待测

或组DNA中仅有1个拷贝。若2个DN

段含有同一STS顺序时，可以确认这两个片段彼此

，因此序列

位点易于识别而定位。35（四）大规模DNA1．BAC克隆系的构建是大规模DNA的基础362．鸟枪法是大规模DNA的重要方法步骤：片段大小为1.6

kb到4

kb①

建立高度随机、左右的

组文库；②③高效、大规模的克隆双向

；序列组装（sequence

assembly）：借助将所测得的序列进行组装，产生一定数量的相连

群；④

缺口填补：利用引物延伸或其他方法对BAC克隆中还存在的缺口进行填补。37鸟枪法的原理与策略383、高通量一代二代三代39“双脱氧末端终止”的含义Sanger

双脱氧末端终止法

原理三、功能组学研究策略功能

组学主要研究内容包括

组的表达、组功能注释、

组表达调控网络及机制的研究等。它从整体水平上研究一种组织或细胞在同一时间或同一条件下所表达

的种类、数量、功能及在不同状态下组中的定位，或同一细胞在表达的差异。42（一）全组扫描鉴定DNA序列中的以全

组DNA序列数据库为基础，通过生物信息学技术注释

组序列，推断和鉴定组编码序列和非编码序列，进而达蛋白质的功能，还可以进行新组表，及疾病相关

的发现。43（二）BLAST等程序搜索同源国家生物技术信息中心（National

Centerfor

Biotechnology

Information，NCBI）BLAST:

BLAST的核酸比对是基于核酸短序列片段的匹配，用统计模型来确定待列与GenBank核酸序列数据库序列的局部匹配程度。GenBank数据库自1992年10月起由NCBI提供，是从公共资源获取序列数据而建立的序列数据库44（三）设计实验验证功能敲除（knock

out）敲入（knock

in）敲减（knock

down）过表达（over

expression）45敲除同源重组是指当外源DN

段与宿主片段同源互补结合时，可能与宿主DNA的相应片段发生重组交换。敲除指为了了解某一已知序列

的功能，利用同源重组技术，定点整合，精确改变胚胎干细胞靶位点的DNA序列，使新发育个体中靶表达缺失的生物技术。46CRISPR/Cas9敲入敲入则利用具有同源序列的外源

重组置换靶点原有

序列，使新机体中表达外源序列编码的蛋白质。49敲减靶

表达减少的方法还包括敲减。敲减技术主要指利用具有互补序列的寡核苷酸，作用于靶

转录产生的mRNA，降解表达。mRNA，从而干扰和阻断siRNAmicroRNA50过表达表达增加的方法还有传统的转基同样，靶

因技术，即过表达。

过表达可以利用脂、电击等技术在体细胞中转染外源，发生随机重组，进而表达产生外源编码的蛋白质。敲入与传统的转比较，在于敲入具有特定位点，可以靶向外源序列。5152四、转录组学Transcriptomics转录组（transcriptome）指生命单元（通常是一种细胞）所能转录出来的可直接参与蛋白质翻译的mRNA（编码RNA）总和，而其他所有非编码RNA均可归为RNA组（RNome）。转录组学（transcriptomics）是在整体水平上研究细胞编码

转录情况及转录调控规律的科学。53转录组学研究mRNA的表达及功能转录组学就是要阐明生物体或细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA及其功能。表达谱分析功能分析54转录组研究的主要技术：微阵列（microarray）表达系列分析（SAGE）大规模平行信号

系统（MPSS）5556RNA组学研究非编码RNA的调控非编码RNA除了tRNA和rRNA以外，细胞内还存在着许多其他种类的小分子RNA，包括snRNA、snoRNA、scRNA、催化性小RNA、siRNA、miRNA等。这些调控型小分子非编码RNA，在

的转录和翻译、细胞分化和

发育、遗传和表观遗传等生命活动中发挥重要的组织和调控作用,从而形成了细胞中高度复杂的RNA网络。5758第二节蛋白质组学Proteomics59蛋白质组学蛋白质组（Proteome）是指一种细胞或生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学（proteomics）是在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成和表达水平，翻译后修饰，蛋白质直接相互作用等，由此在整体水平上研究蛋白质表达和调控的规律，增加对体内代谢和疾病等过程的整体认识。60蛋白质组学的研究主要涉及两个方面：结构蛋白质组学（structural

proteomics）蛋白质组表达模式的研究功能蛋白质组学（functional

proteomics）蛋白质组功能模式的研究一、蛋白质组学研究内容（一）蛋白质的鉴定可以利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、二维凝胶电泳、蛋白质免疫印迹分析（Western

Blotting）、蛋白质

、抗体

及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。61二维电泳-质谱62（二）蛋白质翻译后修饰的鉴定蛋白质翻译后修饰是调节其功能的重要方式磷酸化糖基化酶原激活63（三）蛋白质功能的确定蛋白质表达水平敲除/敲减，敲入/过表达蛋白质的定位研究64蛋白质表达水平研究1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

1238kD

→图K2P在不同培养基中诱导表达的SDS-PAGE分析Fig.

SDS-PAGE ysis

of

expression

of

K2P

in

BL21(DE3)

cultured

in

different

mediaLane

1,3:

Cultured

in

LB;

Lane

5,7:

Cultured

in

M9;

Lane

9,11:

Cultured

in

2×YT;

Lane

2,4,

6,

8,

10,

12:

Before

induced

with

IPTG65蛋白质的定位研究66二、蛋白质组学研究的主要技术路线及方法技术路线：以二维凝胶电泳分离为

的技术路线蛋白质混合物首先通过二维凝胶电泳分离，然后进行酶解，再用质谱技术进行蛋白质的鉴定；以色谱分离为

的技术路线蛋白质混合物先进行酶解，然后利用色谱技术初步分离，再用质谱技术进行蛋白质的鉴定。67蛋白质组学的主要研究方法二维凝胶电泳生物质谱技术技术6869二维凝胶电泳2-DE是分离蛋白质组最基本的工具，其原理是蛋白质在高压电场作用下先进行等电聚焦（isoelectricfocusing，IEF）电泳，利用蛋白质分子的等电点不同使蛋白质得以分离；随后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按蛋白质分子量的大小进行分离。蛋白质的二维电泳70质谱（MS）用肽质量

图谱鉴定蛋白质蛋白质经过酶解成肽段后，获得所有肽段的分子质量，形成一个特异的肽质量

图谱（PMF），通过数据库搜索与比对，便可确定待分析蛋白质分子的性质。用串联质谱鉴定蛋白质用PMF方法不能鉴定的蛋白质可通过质谱技术获得该蛋白质一段或数段多肽的串联质谱（MS/MS）信息并通过数据库检索来鉴定该蛋白质。71蛋白质的质谱分析72肽质量

图谱Peptide

Mass

Fingerprinting，PMF是蛋白质酶解后得到的肽段混合物，经质谱分析得到的特异图谱。待测蛋白酶解后得到的肽段与数据库中的图谱比较，可以用于鉴定待测蛋白质。对肽段的分析往往还需要串联质谱分析，即采用不同的质谱连用，推断蛋白质肽段的氨基酸序列，并通过数据库检索鉴定蛋白质。73蛋白质蛋白质

是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA－蛋白质、RNA－蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等。7475三、蛋白质相互作用研究研究蛋白质相互作用常用的方法：酵母双杂交亲和层析免疫共沉淀蛋白质交联荧光

能量转移（FRET）76酵母双杂交酵母双杂交系统（Yeast

two-hybrid

system）可以用于研究真核细胞表达的蛋白质相互作用的研究，其系统建立基于对真核生物转录起始过程调控的认识。细胞

转录起始需要反式转录激活因子的参与。酵母双杂交系统中的转录激活因子由两个相互独立的结构域（）构成，包括DNA结合域（bindingBD）和转录激活域（activation，，AD）。只有两者在空间上较为接近时，才能激活转录，表达报告蛋白。77由于BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有转录激活功能，在酵母双杂交系统中，“诱饵”蛋白X克隆至BD载体中，表达BD-X融合蛋白；待测蛋白Y克隆至AD载体中，表达AD-Y融合蛋白。若蛋白X与Y有相互作用，则BD和AD在空间上靠近，激活报告

，例如LacZ

的转录和表达。78酵母双杂交7980亲和层析GST

pull-down基本原理：将谷胱苷肽巯基转移酶（Glutathione-S-transferase，GST）-亲和蛋白的融合蛋白连接于固定相，蛋白质混合液中具有亲和力的靶蛋白会与之结合，从而证实两种蛋白之间具有相互作用。GSTpull-down8182免疫共沉淀免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是利用抗原与抗体之间的专一性亲和作用，研究细胞内两种蛋白质相互作用的经典方法。免疫共沉淀方法中的蛋白质经过翻译后修饰，接近天然状态。细胞被裂解后，用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，如果细胞内存在于蛋白X相互作用的蛋白Y，那么用蛋白Y会随之被沉淀，利用蛋白Y的抗体检测会确定蛋白X和蛋白Y之间的相互作用。Co-IPYXX

YYXX

Y83蛋白质交联蛋白质交联剂是一类小分子化合物，具有2个或者以上可以和-NH2、-COOH、-HS等基团蛋白质分连接的末端，可以偶联2个或者子。不少蛋白质-蛋白质相互作用是瞬时的，交联剂可以稳定这种蛋白质相互作用。其他生命科学研究，如肿瘤细胞表面抗原-抗体与靶向药物的连接，抗体与酶或荧光基团的连接等。84荧光

能量转移荧光能量

转移（Förster

resonance

energytransfer，FRET）是可以用于检测活细胞中生物大分子纳米级距离变化的方法，在蛋白质相互作用等方面有着广泛的应用。荧光能量转移的原理是当两个荧光分子距离很近时，且一个荧光分子（供体分子）的发射光谱与另一荧光分子（受体分子）的激发光谱，就会发生能量转移，表现为供体分子荧光猝灭，受体分子荧光增强。85FRET86四、蛋白质组学研究相关的数据库蛋白序列数据库（SWISS-PROT/TrEMBL；）、）、序列数据库（GenBank，EMBL；，蛋白质模式数据库（Prosite；）、蛋白质二维凝胶电泳数据库、蛋白质三维结构数据库（PDB，；FSSP，

），蛋白翻译后修饰数据库（O-GLYCBASE，>8788第三节代谢组学Metabonomics89代谢组学（metabonomics）就是测定一个生物/细胞中所有的小分子（Mr1

000d）组成，描绘其动态变化规律，建立系统代谢图谱，并确定这些变化与生物过程的联系。90一、代谢组学的研究对象和方法代谢组学的研究对象细胞和组织提取液细胞培养液生物体液如血样、尿样血液中的代谢物含量丰富，比较能整体反映体内代谢物的变化过程尿液则取材方便无创，易于获得。代谢组学的任务是分析这些样品中代谢产物的整体变化代谢

分析（metabolomic

fingerprinting）是对代谢物整体进行高通量的定性分析，采用液相色谱-质谱联用（LC-MS），比较不同样品中的代谢产物，分析确定待测

样品中的所有代谢产物构成。91二、代谢组学的主要分析工具核磁（NMR）：是当前代谢组学研究中的主要技术。代谢组学中常用的NMR谱是氢谱（1H-NMR）、碳谱（13C-NMR）及磷谱（31P-NMR）；质谱（MS）：按质荷比（m/z）进行各种代谢物的定性或定量分析，可得到相应的代谢产物谱；色谱-质谱联用技术：这种联用技术使样品的分离、定性、定量一次完成，具有较高的灵敏度和选择性。气相色谱-质谱联用（GC-MS）液相色谱-质谱联用（LC-MS）92代谢组学研究9394第四节其他疾病相关组学研究一、疾病组学（一）定位克隆技术是发现和鉴定疾病的重要定位候选克隆是将疾病相关位点定位于某一染色体区域后，根据该区域的所对应的同源区的已知、EST或模式生物等有关信息，直接进行关突变筛查，经过多次重复，可最终确定疾病相。9596（二）SNPs是疾病易感性的重要遗传学基础