分子病理技术课件

分子病理技术

一、概论

二、免疫组化

三、原位杂交

四、原位PCR（在实验细胞学中讲述）

五、原位末端标记技术

（在细胞凋亡检测方法中讲）

六、组织芯片技术（李杨）

七、纳米技术（原子力显微镜）分子病理技术

一、概论

二、免疫组化

三、原位1复习题1什么是分子病理学？常用分子病理技术有哪些？2什么是免疫组织化学？试述免疫酶组织化学的方法和原理。复习题1什么是分子病理学？2

一、概论

生物高新技术——病理学中的应用

向二方面发展：

计算机和图像分析技术的应用

简单的形态描述——量化方面发展

直接观察——远程远输“间接”观察

定量病理学和远程病理学

原位杂交、原位PCR和原位末端标记技术

分子病理学水平

近些年来，尤其是纳米技术的诞生

使人们对疾病的认识达原子水平

一、概论

生物高新技术——病理学中的应用

向二方面发展：

3分子病理学

从分子水平研究患病机体生命现象的科学

从分子水平研究疾病的发生、发展与转归机制的科学

分子生物学

细胞生物学互相渗透、交叉

经典病理学

分子病理学的形成是分子生物学技术在病理学中的应用的具体体现。分子病理学

从分子水平研究患病机体生命现象的科学

从分子水平4

技术手段

（1）分子免疫学+病理学乃至形态科学-—

免疫组织化学

（2）分子生物学技术

（探针；PCR；分子杂交）+形态学科

ISH、ISPCR和原位末端标记技术

(3)生物芯片技术—组织芯片技术

(4)纳米技术—对疾病的认识达原子水平技术手段

（1）分子免疫学+病理学乃至5

研究内容--阐明疾病的病理机理

（1）“大海捞针”式探讨单个致病基因与疾病关系研究—人类基因组计划

（2）信号转导—疾病关系

认清疾病发生的信号转导机制

最终阐明其机制

寻求干预和防治疾病

研究内容--阐明疾病的病理机理

（1）“大海捞针6

病理学发展以方法为先导

人类科学进步的历史和学科的发展——

以研究方法与工具创新为先导

一项新技术的创立，随之带来一批新的研究成果

在病理学领域中

系统解剖—LM—EM—免疫组化技术

器官病理学—细胞病理学—免疫病理学病理学发展以方法为先导

人类科学进步的历史和学科的7原位杂交和原位PCR技术的兴起，又将病理学这门有着悠久历史的学科推进到分子病理学水平

21世纪是生命科学的世纪

分子生物学是生命科学的带头学科

随着生物高新技术在病理学中应用的不断增多，分子病理学将在此研究领域中占有越来越重要的位置原位杂交和原位PCR技术的兴起，又将病理学这门有着悠久历史的8免疫组织化学技术

一、概论：概念

二、方法和原理

三、免疫组织化学方法基本步骤

四、免疫组化染色的一般注意事项免疫组织化学技术

一、概论：概念

二、方法和原9一、概论

1.概念：

1）免疫组织化学（immunohistochemistry）

是组织学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织原位的显示；是免疫学与组织化学相互渗透、相互交叉而产生的一门学科。

2）免疫组化技术

是在组织细胞原位检测抗原（或抗体）的一种方法，也是在蛋白水平原位检测基因表达的一种方法。一、概论

1.概念：

1）免疫组织化学（immunohis102.历史

1914年，Coons等人首次用荧光素标记抗体检测肺炎双球菌的成功，开创了免疫组化的新时代

Sternberger改进并建立了辣根过氧化物酶－抗过氧化物酶（PAP）技术。

80年代以后，ABC、APAAP、LSAB法等，使免疫组化技术的应用更加广泛，成为当今生物医学中形态、功能、代谢等综合研究的一种有力工具。2.历史

1914年，Coons等人首次用荧光素标11

近些年来，由于原位杂交技术、流式细胞仪及图像分析等技术的兴起和应用，使免疫组化引向基因水平和定量检测

形成免疫组化新的分支

杂交免疫组化和定量免疫组化。

90年代初,原位PCR技术的诞生

免疫组化主要是用来原位PCR结果的化学放大和显示，标志着免疫组化技术又进入了一个新的发展阶段。

近些年来，由于原位杂交技术、流式细胞仪及图像分析等技术的12二、方法和原理

1.按标记物种类分:

免疫荧光法

免疫酶法

免疫铁蛋白法

免疫金法及放射免疫自显影法二、方法和原理

1.按标记物种类分:

免疫荧光法

免132.按标记物标记的部位分

直按法（一步法）

间接法（二步法）

桥联法（多步法）

目前应用最为广泛的为免疫酶法

根据三抗、酶的不同又分为

PAP法、APAAP法、BA法

ABC法、LSAB法和SP法等。

2.按标记物标记的部位分

直按法（一步法）

间接法（二步143.免疫荧光法

已知的抗体或抗原分子标记上荧光素

与其相对应的抗原或抗体起反应

形成的免疫复合物上带有一定量的荧光素

荧光显微镜下——荧光的抗原抗体结合部位

检测出抗原或抗体3.免疫荧光法

已知的抗体或抗原分子标记上荧光素

与其15直接法免疫荧光原理示意图直接法免疫荧光原理示意图16间接法免疫荧光原理示意图间接法免疫荧光原理示意图174.免疫酶组织化学

60年代初，HRP-抗体分子上，开创了酶标记抗体的新技术，现已广泛应用。目前应用最广泛的酶是HRP，其次是AP。

（1）PAP法Ag→Ab1→Ab2→PAP→DAB

其灵敏度是免疫荧光法的100-1000倍

（2）ABC法:Ag→Ab1→Bio-Ab2→ABC→DAB

（3)APAAP法:

Ag→Ab1→Ab2→APAAP→FR

（4）LSAB或SP法:

Ag→Ab1→Bio-Ab2→HRP-SADAB

（AP-SA）→（FR/NBT）4.免疫酶组织化学

60年代初，HRP-抗体分子上18直接法免疫酶组织化学原理示意图直接法免疫酶组织化学原理示意图19间接法免疫酶组织化学原理示意图间接法免疫酶组织化学原理示意图20AgAgAb1Ab2Ab1Bio-Ab2LSABABCPAPAPAAPHRP-DABAP-坚固红NBT多步法免疫酶组织化学原理示意图AgAgAb1Ab2Ab1Bio-Ab2LSABABCPAP21三、免疫组织化学方法基本步骤

1.试剂配制

（1）柠檬酸盐缓冲液

（2）TBS(Tris缓冲生理盐水)

（3）1MTris-HCl缓冲液(pH7.4)

（4）显色液:

（5）Mayer苏木精复染液三、免疫组织化学方法基本步骤

1.试剂配制

（222.染色步骤

（1）石蜡切片脱蜡至蒸馏水；

（2）消化暴露抗原：

（3）去除内源性酶

（4）滴加适当稀释的一抗；

（5）滴加适当稀释的生物素化的二抗；

（6）滴加ABC复合物等三抗；

（7）滴加底物显色；

（8）苏木素复染核，脱水透明封片。

以上(1)-(5)之间均用缓冲液洗。2.染色步骤

（1）石蜡切片脱蜡至蒸馏水；

（2）消化暴23

3.结果判定

HRP-DAB:阳性呈棕黄或棕黑色

AP-Fastred:玫瑰红色

AP-NBT,BCIP:紫蓝色3.结果判定

HRP-DAB:阳性呈棕黄或棕黑色

24HRP-DAB:棕黄或棕黑色HRP-DAB:棕黄或棕黑色25AP-Fastred:玫瑰红色AP-Fastred:玫瑰红色264.对照实验

（1）空白对照：一抗由TBS

或其他无关抗体取代。

（2）阴性对照：二抗和/或三抗一抗

由TBS或其他无关抗体取代。

（3）阳性对照：用含已知靶抗原的切片

作阳性对照。4.对照实验

（1）空白对照：一抗由TBS

27四、免疫组化染色的一般注意事项

1.内源酶的灭活及内源生物素的处理

HRP—3％的H2O2水溶液

含丰富血细胞的标本中，与H2O2产生强烈的反应，出现冒泡而破坏组织结构和细胞形态。

可以用3％的H2O2甲醇液四、免疫组化染色的一般注意事项

1.内源酶的灭活及内源生28内源性生物素的去除：

目的：正常细胞也含有生物素，尤以肝、脾、肾组织含量为多。在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合后继抗体，形成亲和素(或链亲合素)-生物素复合物，导致假阳性发生。

方法：在采用生物素方法染色前，对标本进行亲和素处理，使其结合位点饱和。内源性生物素的去除：

目的：正常细胞也含有生物素，292.消除非特异性背景着色

常见于蛋白质(抗体)吸附到组织切片中高度荷电的胶原及结缔组织成分上。

方法：在滴加一抗前在标本上加一种无关的蛋白质溶液，以封闭荷电点不给一抗留有吸附的余地，以保证一抗不会吸附到胶原纤维及结缔组织成分上。

最常用的无关蛋白质溶液是产生二抗的同种动物的非免疫血清。2.消除非特异性背景着色

常见于蛋白质(抗体)吸303.缓冲液的选择

目的：保证免疫组织化学染色的最佳条件，即合适的离子浓度和pH值。

但不同的酶促反应要求不同的pH值和不同的离子。

HRP免疫组织化学染色需近中性环境，pH7.4-7.6较为合适。

AP--需选碱性缓冲液，pH8.2较为合适。3.缓冲液的选择

目的：保证免疫组织化学染色的最314.抗原修复

目的

石蜡切片,甲醛固定，使抗原性物质或由于形成醛键、羧甲键等原因而被封闭了部分抗原决定簇；或由于蛋白之间发交联而使抗原决定簇隐蔽.

在染色时，有些抗原需要先进行抗原修复或暴露。4.抗原修复

目的

石蜡切片,甲醛固定，使32方法

（1）化学方法：酶--抗原决定蔟暴露

胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等

（2）物理/化学方法：主要有

单纯加热方法：柠檬酸盐缓冲液

高压加热方法：

微波方法：利用热效应和微波的直接作用，打开蛋白之间的交联键，将已被封闭的抗原决定簇暴露和修复。方法

（1）化学方法：酶--抗原决定蔟暴露

335.一抗的选用、稀释度及孵育时间

一抗是免疫组织化学染色中最重要的试剂

抗体工作稀释度取决于：

①特异性抗体的浓度，即滴度；

②抗体的纯度；

孵育时间：特异性染色较强且无背景着色，是较理想的稀释度。加长孵育时间可有效地降低所用抗体的浓度，有利于提高染色质量，节省抗体

室温过夜是较好的方法，但也可用37℃1小时或4℃过夜的方法。5.一抗的选用、稀释度及孵育时间

一抗是免疫组织化学染346.选择适宜的检测方法

血涂片，骨髓涂片–内源性HRP丰富

APAAP或碱磷酶标记的方法

肝、肾等组织——内源性生物素丰富

PAP方法

一般的免疫组化—ABC和SP6.选择适宜的检测方法

血涂片，骨髓涂片–内357.显色中的一些问题

显色的停止点：目的物达最深染色而背景无着色。显色时间过短，着色过浅；显色时间过长，背景着色又过深，都将影响结果的判断，均应避免。

通常显色结果以阳性对照得出最佳结果的时间为标准。

7.显色中的一些问题

显色的停止点：目的物达最36纳米技术

物质基础：原子力显微镜

纳米技术、信息技术和生物技术----

21世纪社会发展的三大支柱

我国—启动

01.6.29,科技部和中科院—“沈阳材料科学

国家（联合）实验室”。这一装备先进

的实验室将主攻纳米级材料

01.7（3-5),国际纳米材料项目论坛会议上，

科技部将斥资10亿—支持国家纳米技术，

资金在5年内全部到位纳米技术

物质基础：原子力显微镜

纳米技术、信息技术和生物技37

纳米技术--在10-7-10-9m范围内，对物质内原子、分子的运动和变化进行研究、操纵和加工的技术。

纳米（nm）也即10-9m。纳米技术的诞生，使人们认识事物的本质和变化规律达原子水平。纳米技术--在10-7-10-9m范围内，对物质内原38纳米技术最早在材料科学中应用

目前已取得了较大进展。

科学家预言，纳米技术将引起下一次工业革命。并发现，可用纳米管元件来代替硅芯片制造计算机。

近些年来，纳米技术在生物医学领域内应用亦越来越广泛

主要应用在生物化学、药物学等领域。

预计21世纪将是纳米技术的世纪纳米技术最早在材料科学中应用

目前已取得了较大进展。

科学家39纳米技术在生物医学上的应用

（1）基因的微电子诊断

（2）药物基因组学

（3）生物大分子结构与功能

（4）疾病的早期诊断

（5）单分子结构与功能分析

（6）新型医学防护材料

（7）新型组织修复装置

（8）新型药物研制纳米技术在生物医学上的应用

（1）基因的微电子诊断

（2）40

分子病理技术

一、概论

二、免疫组化

三、原位杂交

四、原位PCR（在实验细胞学中讲述）

五、原位末端标记技术

（在细胞凋亡检测方法中讲）

六、组织芯片技术（李杨）

七、纳米技术（原子力显微镜）分子病理技术

一、概论

二、免疫组化

三、原位41复习题1什么是分子病理学？常用分子病理技术有哪些？2什么是免疫组织化学？试述免疫酶组织化学的方法和原理。复习题1什么是分子病理学？42

一、概论

生物高新技术——病理学中的应用

向二方面发展：

计算机和图像分析技术的应用

简单的形态描述——量化方面发展

直接观察——远程远输“间接”观察

定量病理学和远程病理学

原位杂交、原位PCR和原位末端标记技术

分子病理学水平

近些年来，尤其是纳米技术的诞生

使人们对疾病的认识达原子水平

一、概论

生物高新技术——病理学中的应用

向二方面发展：

43分子病理学

从分子水平研究患病机体生命现象的科学

从分子水平研究疾病的发生、发展与转归机制的科学

分子生物学

细胞生物学互相渗透、交叉

经典病理学

分子病理学的形成是分子生物学技术在病理学中的应用的具体体现。分子病理学

从分子水平研究患病机体生命现象的科学

从分子水平44

技术手段

（1）分子免疫学+病理学乃至形态科学-—

免疫组织化学

（2）分子生物学技术

（探针；PCR；分子杂交）+形态学科

ISH、ISPCR和原位末端标记技术

(3)生物芯片技术—组织芯片技术

(4)纳米技术—对疾病的认识达原子水平技术手段

（1）分子免疫学+病理学乃至45

研究内容--阐明疾病的病理机理

（1）“大海捞针”式探讨单个致病基因与疾病关系研究—人类基因组计划

（2）信号转导—疾病关系

认清疾病发生的信号转导机制

最终阐明其机制

寻求干预和防治疾病

研究内容--阐明疾病的病理机理

（1）“大海捞针46

病理学发展以方法为先导

人类科学进步的历史和学科的发展——

以研究方法与工具创新为先导

一项新技术的创立，随之带来一批新的研究成果

在病理学领域中

系统解剖—LM—EM—免疫组化技术

器官病理学—细胞病理学—免疫病理学病理学发展以方法为先导

人类科学进步的历史和学科的47原位杂交和原位PCR技术的兴起，又将病理学这门有着悠久历史的学科推进到分子病理学水平

21世纪是生命科学的世纪

分子生物学是生命科学的带头学科

随着生物高新技术在病理学中应用的不断增多，分子病理学将在此研究领域中占有越来越重要的位置原位杂交和原位PCR技术的兴起，又将病理学这门有着悠久历史的48免疫组织化学技术

一、概论：概念

二、方法和原理

三、免疫组织化学方法基本步骤

四、免疫组化染色的一般注意事项免疫组织化学技术

一、概论：概念

二、方法和原49一、概论

1.概念：

1）免疫组织化学（immunohistochemistry）

是组织学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织原位的显示；是免疫学与组织化学相互渗透、相互交叉而产生的一门学科。

2）免疫组化技术

是在组织细胞原位检测抗原（或抗体）的一种方法，也是在蛋白水平原位检测基因表达的一种方法。一、概论

1.概念：

1）免疫组织化学（immunohis502.历史

1914年，Coons等人首次用荧光素标记抗体检测肺炎双球菌的成功，开创了免疫组化的新时代

Sternberger改进并建立了辣根过氧化物酶－抗过氧化物酶（PAP）技术。

80年代以后，ABC、APAAP、LSAB法等，使免疫组化技术的应用更加广泛，成为当今生物医学中形态、功能、代谢等综合研究的一种有力工具。2.历史

1914年，Coons等人首次用荧光素标51

近些年来，由于原位杂交技术、流式细胞仪及图像分析等技术的兴起和应用，使免疫组化引向基因水平和定量检测

形成免疫组化新的分支

杂交免疫组化和定量免疫组化。

90年代初,原位PCR技术的诞生

免疫组化主要是用来原位PCR结果的化学放大和显示，标志着免疫组化技术又进入了一个新的发展阶段。

近些年来，由于原位杂交技术、流式细胞仪及图像分析等技术的52二、方法和原理

1.按标记物种类分:

免疫荧光法

免疫酶法

免疫铁蛋白法

免疫金法及放射免疫自显影法二、方法和原理

1.按标记物种类分:

免疫荧光法

免532.按标记物标记的部位分

直按法（一步法）

间接法（二步法）

桥联法（多步法）

目前应用最为广泛的为免疫酶法

根据三抗、酶的不同又分为

PAP法、APAAP法、BA法

ABC法、LSAB法和SP法等。

2.按标记物标记的部位分

直按法（一步法）

间接法（二步543.免疫荧光法

已知的抗体或抗原分子标记上荧光素

与其相对应的抗原或抗体起反应

形成的免疫复合物上带有一定量的荧光素

荧光显微镜下——荧光的抗原抗体结合部位

检测出抗原或抗体3.免疫荧光法

已知的抗体或抗原分子标记上荧光素

与其55直接法免疫荧光原理示意图直接法免疫荧光原理示意图56间接法免疫荧光原理示意图间接法免疫荧光原理示意图574.免疫酶组织化学

60年代初，HRP-抗体分子上，开创了酶标记抗体的新技术，现已广泛应用。目前应用最广泛的酶是HRP，其次是AP。

（1）PAP法Ag→Ab1→Ab2→PAP→DAB

其灵敏度是免疫荧光法的100-1000倍

（2）ABC法:Ag→Ab1→Bio-Ab2→ABC→DAB

（3)APAAP法:

Ag→Ab1→Ab2→APAAP→FR

（4）LSAB或SP法:

Ag→Ab1→Bio-Ab2→HRP-SADAB

（AP-SA）→（FR/NBT）4.免疫酶组织化学

60年代初，HRP-抗体分子上58直接法免疫酶组织化学原理示意图直接法免疫酶组织化学原理示意图59间接法免疫酶组织化学原理示意图间接法免疫酶组织化学原理示意图60AgAgAb1Ab2Ab1Bio-Ab2LSABABCPAPAPAAPHRP-DABAP-坚固红NBT多步法免疫酶组织化学原理示意图AgAgAb1Ab2Ab1Bio-Ab2LSABABCPAP61三、免疫组织化学方法基本步骤

1.试剂配制

（1）柠檬酸盐缓冲液

（2）TBS(Tris缓冲生理盐水)

（3）1MTris-HCl缓冲液(pH7.4)

（4）显色液:

（5）Mayer苏木精复染液三、免疫组织化学方法基本步骤

1.试剂配制

（622.染色步骤

（1）石蜡切片脱蜡至蒸馏水；

（2）消化暴露抗原：

（3）去除内源性酶

（4）滴加适当稀释的一抗；

（5）滴加适当稀释的生物素化的二抗；

（6）滴加ABC复合物等三抗；

（7）滴加底物显色；

（8）苏木素复染核，脱水透明封片。

以上(1)-(5)之间均用缓冲液洗。2.染色步骤

（1）石蜡切片脱蜡至蒸馏水；

（2）消化暴63

3.结果判定

HRP-DAB:阳性呈棕黄或棕黑色

AP-Fastred:玫瑰红色

AP-NBT,BCIP:紫蓝色3.结果判定

HRP-DAB:阳性呈棕黄或棕黑色

64HRP-DAB:棕黄或棕黑色HRP-DAB:棕黄或棕黑色65AP-Fastred:玫瑰红色AP-Fastred:玫瑰红色664.对照实验

（1）空白对照：一抗由TBS

或其他无关抗体取代。

（2）阴性对照：二抗和/或三抗一抗

由TBS或其他无关抗体取代。

（3）阳性对照：用含已知靶抗原的切片

作阳性对照。4.对照实验

（1）空白对照：一抗由TBS

67四、免疫组化染色的一般注意事项

1.内源酶的灭活及内源生物素的处理

HRP—3％的H2O2水溶液

含丰富血细胞的标本中，与H2O2产生强烈的反应，出现冒泡而破坏组织结构和细胞形态。

可以用3％的H2O2甲醇液四、免疫组化染色的一般注意事项

1.内源酶的灭活及内源生68内源性生物素的去除：

目的：正常细胞也含有生物素，尤以肝、脾、肾组织含量为多。在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合后继抗体，形成亲和素(或链亲合素)-生物素复合物，导致假阳性发生。

方法：在采用生物素方法染色前，对标本进行亲和素处理，使其结合位点饱和。内源性生物素的去除：

目的：正常细胞也含有生物素，692.消除非特异性背景着色

常见于蛋白质(抗体)吸附到组织切片中高度荷电的胶原及结缔组织成分上。

方法：在滴加一抗前在标本上加一种无关的蛋白质溶液，以封闭荷电点不给一抗留有吸附的余地，以保证一抗不会吸附到胶原纤维及结缔组织成分上。

最常用的无关蛋白质溶液是产生二抗的同种动物的非免疫血清。2.消除非特异性背景着色

常见于蛋白质(抗体)吸703.缓冲液的选择

目的：保证免疫组织化学染色的最佳条件，即合适的离子浓度和pH值。

但不同的酶促反应要求不同的pH值和不同的离子。

HRP免疫组织化学染色需近中性环境，pH7.4-7.6较为合适。

AP--需选碱性缓冲液，pH8.2较为合适。3.缓冲液的选择

目的：保证免疫组织化学染色的最714.抗原修复

目的

石蜡切片,甲醛固定，使抗原性物质或由于形成醛键、羧甲键等原因而被封闭了部分抗原决定簇；或由于蛋白之间发交联而使抗原决定簇隐蔽.

在染色时，有些抗原需要先进行抗原修复或暴露。4.抗原修复

目的

石蜡切片,甲醛固定，使72方法

（1）化学方法：酶--抗原决定蔟暴露

胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等

（2）物理/化学方法：主要有

单纯加热方法：柠檬酸盐缓冲液

高压加热方法：

微波方法：利用热效应和微波的直接作用，打开蛋白之间的交联键，将已被封闭的抗原决定簇暴露和修复。方法

（1）化学方法：酶--抗原决定蔟暴露

735.一抗的选用、稀释度及孵育时间

一抗是免疫组织化学染色中最重要的试剂