基因工程原理与技术-11课件

第十一章动物基因工程动物基因工程转基因育种分子辅助育种生物反应器基因治疗第一节动物目的基因的选择与表达载体的构建一、动物转基因操作的一般程序(见下图)①目的基因的分离与克隆；②表达载体的构建；③受体细胞的获得；④转基因的导入与转基因胚胎的获得；⑤受体动物的选择与转基因胚胎的移植；⑥转基因整合表达的检测与转基因动物的获得；⑦转基因动物的选育或转基因表达产物的分离纯化。二、目的基因的选择

①编码或调控机体生长发育或特殊形态表征的基因；例如：生长激素基因、人生长激素释放因子基因②增强抗病作用的基因及免疫调控因子基因；例如：人类促衰变因子基因、鸡马立克氏病毒基因③药用蛋白基因。例如：组织纤溶酶原激活剂基因、乳铁蛋白基因

转基因的结构特征对其表达有较大的影响：

基因组DNA>微小基因>cDNA②用于基因打靶的表达载体构建基因打靶是指利用同源重组将目的基因整合到受体细胞染色体的特定位点上。包括：插入型打靶载体(一个位点同源重组，导致整个载体的插入)、取代型打靶载体(两个位点同源重组,导致外源基因取代靶基因序列)

a、基因敲除是指通过基因打靶而使特定的靶基因失活的技术。负选择标记b、hitandrun法

敲除靶序列，引入突变基因。c、双置换法(两步打靶法)敲除靶序列，引入突变基因。d、基因敲入

基因敲入是指通过基因打靶将外源基因置于靶基因调控序列下游而受到调控的技术。同源重组第二节动物基因转移的方法一、DEAE-葡聚糖法二、脂质体介导法三、磷酸钙沉淀法四、血影细胞介导法五、精子介导法(精子载体法)六、病毒转染法七、显微注射法(微注射法)八、胚胎干细胞介导法九、同源重组法(基因打靶法)第四节提高转基因动物外源基因表达的策略一、动物转基因技术存在的问题1、成本高、成功率低2.5万美元/转基因猪，50万美元/转基因牛2、转基因效率低显微注射法：0.38%3、转基因的遗传率低G0×G0→G1中30%阳性率(理论值75%)4、转基因动物疾病模型与预期不符5、转基因动物产品的安全性第五节动物基因工程技术的应用一、转基因动物育种1、动物超高产及品质育种转基因超级小白鼠

转基因牛：生长快(牛生长激素基因)、无乳糖牛奶(乳糖酶基因)

转基因猪：生长素基因

转基因鱼：生长素基因，1985年中国获得第一例转基因鱼。2、动物抗病育种抗病基因动物抗病基因：组织相容性复合体基因、淋巴激活素基因病原体的结构蛋白基因：病毒外壳蛋白基因针对病原体RNA的基因：反义RNA基因、核酶基因细胞因子及其受体基因：白细胞介素II基因、干扰素基因病原体的单克隆抗体基因转基因牛：干扰素基因转基因兔：单克隆抗体基因转基因猪：单克隆抗体基因转基因鸡：禽类白血病病毒外壳蛋白基因二、供人体器官移植的转基因动物

抑制排斥反应的基因：DAF(decayacceleratingfactor)基因、RCA(regulatorofcomplementactivation)基因、MCP(membrane–cofactorprotein)基因

1992年英国剑桥大学White培育出转hDAF基因猪；Yannoutsos等获得转hDAF微小基因-MCP基因猪；Duke大学研究人员获得转DAF-CD59基因猪，并把转基因猪的心脏移植给狒狒，比对照的存活时间长得多。三、转基因动物生物反应器根据外源基因的表达部位可分为：动物乳腺生物反应器、动物血液生物反应器、动物泌尿系统生物放反应器

动物乳腺生物反应器的优点：

①乳腺表达基因产物的产量高；一头奶牛一年可生产乳蛋白250~300Kg，一只绵羊或山羊一年可生产乳蛋白25~30Kg。

②外源蛋白易提纯；③外源蛋白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，生物活性接近天然产品；

④乳腺是自我封闭系统，乳腺表达的蛋白质不会进入到血液循环系统，避免外源基因表达的蛋白质对动物本身的影响；⑤给药方式简单。

动物乳腺生物反应器是目前国际上唯一可以达到商业化生产水平的生物反应器。动物乳腺生物反应器的调控元件β乳球蛋白基因调控元件酪蛋白基因调控元件乳清酸蛋白基因调控元件乳清蛋白基因调控元件第六节基因治疗人类遗传疾病有5000多种，基本上不可能用常规的方法治疗。个别病例只能对症疗法，减轻症状，但不能治愈。基因治疗可能是唯一的方法。

基因治疗是指通过向靶细胞导入外源基因纠正或补偿细胞基因的缺陷、关闭或抑制异常基因的表达以治疗遗传病的治疗技术。

1990年9月14日，美国年仅4岁的女孩阿尚蒂(腺苷脱氨酶缺失引起免疫缺损综合症)接受了世界上第一例基因治疗临床试验。

1991年复旦大学与第二军医大学合作，开展了用基因疗法治疗血友病B(成纤维细胞基因)的临床试验一、基因诊断

基因诊断是指通过DNA分析技术对引起遗传病或传染病的基因或DNA序列进行检测以诊断遗传病或传染病。基因诊断对迟发性遗传病的早期诊断是非常有意义的。基因治疗的四个环节基因诊断基因分离载体构建基因转移二、基因治疗1、基因治疗的方式基因治疗体细胞基因治疗生殖细胞基因治疗体外疗法(离体疗法)体内疗法(活体疗法)基因转移方法基因治疗方法活体直接转移(invivo)：将外源基因通过载体直接注射到肌肉、血管等靶组织或通过口服、喷雾、皮下涂抹等方式直接被试验个体的靶部位吸收。该法操作简便，易于推广，但目前尚未成熟，存在疗效短、免疫排斥及基因转移载体在体内随机分布等安全性等问题。该法虽有种种缺陷，仍不失为基因治疗发展的最终趋势。离体转移(exvivo)：将试验对象的靶细胞取出，体外培养导入基因后再重新输回试验者体内。该法比较经典，安全有效且易控制，但是步骤多、操作复杂，患者接受程度低，难以大规模推广。基因治疗的策略补充策略(基因加入)纠正策略(基因寻靶)限制策略(基因抑制)无中生有策略(自杀基因)2、基因治疗的条件①对导入的基因及其产物有详尽的了解；

②外源基因有效导入受体细胞、稳定整合、适量表达；

③不能使受治细胞基因组及表达调控受影响；

④导入基因方法安全，载体对靶细胞无害。3、基因治疗的原则

①对象是病情严重、预后极差、别无他法的患者；

②转移的基因被克隆；

③无需高水平的表达和精确定量控制就有治疗效果；

④靶细胞获取或回收安全；

⑤转移基因的表达对细胞微环境无严格的特异性要求。5、基因治疗的应用①治疗恶性肿瘤

例如，将已导入IL—2基因的TIL细胞回输给病人，启动自身免疫，治疗黑色素瘤。美国已批准8种基因治疗方案。

②治疗艾滋病用射线照射已导入HIV基因的成纤维细胞，细胞停止分化，但能产生gp160，将细胞回输给病人，能激活免疫系统，杀伤HIV感染细胞。③治疗家族性高胆固醇血症

肝细胞低密度脂蛋白(LDL)受体基因混乱造成的将LDL基因导入病人离体培养的肝细胞中，然后经导管注入门脉循环的血液中，进入肝细胞后表达相应的功能蛋白

④治疗先天性免疫缺陷综合症

病人因缺少腺苷脱氨酶基因(ADA)导致T、B淋巴细胞发育不完全，功能障碍，造成严重免疫缺陷。将正常ADA基因经转录病毒转染进入白细胞，回输患者体内，ADA基因表达正常，患者ADA达正常值的25%。⑤治疗B型血友病：

将人凝血因子Ⅸ的cDNA经逆转录病毒转染