课题第三幕课题第三幕

小张的三马婧玥一.胚胎干细胞定向诱导分 化学诱导剂诱导 细胞因子诱导 共培养方式诱导 转诱导 现有成 二.诱导ES/iPS为神经样细 模拟胚胎环境：EBs介导的神经外胚层发 视黄酸（RA）诱导的方 MEDII条件培养基诱导方 EBs在成分明确的培养基中被选 2直接诱导分 极低密度配分确定的培养 基质细胞介导的神经发生 条件培养基介导的神经发 三.iPS在ALS中的应 研究目的和背 实验过 **音猬因子 **视黄酸 展 神经元的鉴 免疫组化的使 神经细胞标记 选择合适的免疫组化标记 优化措 四.iPS治疗性应 镰刀型贫血症的治 神经系统遗传疾病的研 多巴胺能神经元病变的神经系统遗传性疾 运动神经元病变的神经系统遗传性疾 脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy,SMA):29肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophiclateral 其他神经元病变的神经系统遗传性疾 在神经系统遗传性疾病药物筛选和临床治疗中应用.疾病iPS细胞应用于药物筛 疾病iPS细胞应用于疾病治 其 六.参考文 一.胚胎干细胞定向诱导分维甲酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)、维生素A、地塞和2,5-羟基维生素D3等试剂可诱导胚胎干细胞分化为神经细胞、心肌细胞、成骨细胞和软骨细胞最常用的特异性诱导剂是维甲酸,它可通过经典的信号转导途径诱导胚胎干细胞的分化,还可以白血病抑制因子(LIF)活化胚胎干细胞的自我更新信号通路,从而促进胚胎干细胞分化。DMSO机制主要是影响c-myc表达，降低细胞的内源性聚腺苷二磷酸核苷表达水利用诱导剂诱导胚胎干细胞分化时,诱导剂的添加不仅对胚胎干细胞产生一定的毒性作用,同时也给胚胎发育重要内源性因素的分析带来很多不便。在体外培养下,胚胎干细胞对细胞因子具有依赖性。培养过程中添加或撤除拟胚体(EBs),再在拟胚体的基础上进一步诱导使其分化为目的细胞得的目的细胞纯度不高,这是胚胎干细胞内在的多能性发育程序所决定的。某些细胞因子可以诱导胚胎干细胞的定向分化,如白细胞介素-3(IL-3)可促使胚胎干细胞分化为红系造血细胞、肥大细胞和粒细胞,而白细胞介素-6(IL-6)可环境中多种因素共同作用的结果,同时微环境中各因素也共同决定着胚胎干细胞的分化方向。应用与目的细胞共培养诱导ES细胞向肝细胞、脂肪细胞等成功分化的屡见不鲜。两种或两种以上细胞共培养,会增加病原体的概率,尤其是的概率,这是共培养体系应用于临床诱导干细胞向肝细胞分化的主要。转诱导转诱导法主要是利用转染技术将某些信号转导成分的转入胚胎干细胞中,使某个促分化在胚胎干细胞中过表达,从而有效地诱导胚胎干细胞发生特异性分化沈干等将外源TGF-β转染小鼠胚胎干细胞,杂交实验证实转化生长因子β(TGF-β)整合到胚胎干细胞组,并表达外源TGF-β的mRNA,然后以悬滴法培养胚胎干细胞,7d后发现胚胎干细胞被诱导为具有内皮细胞特征的细胞;作者同时发现,外源rhTGF-β在培养基中对胚胎干细胞分化有明显促进作用,这种方法诱导胚胎干细胞分化的效率高,得到的分化细胞的纯度也较高,具有应用前景。加入或撤出某些细胞因子转等维生素A转入信号转导成 →促分 增加病原 率，需解抑制LIF——经典信号传导途径——23:52-54,266.林海,张芳, 胚胎干细胞的定向诱导分化及应用.生物学教学2011年(36卷)5向神经细胞的诱导分且易于在体外培养和扩增,能无限增殖。因此,人胚胎干细胞是将来神经系统细胞替代治疗的最“细胞目前,各种诱导生成神经细胞的方法层出不穷,但相关实验表明失去了分化潜能的终末细胞移植入受体后难以成功整合到受体脑组织并会很快。因而诱导分化得到的神经干细胞移植仍然是治疗的重要途径冯树梅等采用无低密度快速诱导胚胎干细胞向神体细胞分化的方法PCR分析表明,所得到的细胞为高纯度的神体细胞,其分化率接近%。但高纯度前体细胞仍有致瘤性,可能该细胞的发育学地位更加接近于胚胎干细胞,对其发育学表型的进一步探讨,将为胚胎干细胞来源的神体细胞的研究奠定基础。最近,等[4]利用采用序贯诱导法,模仿体内胚胎细胞的生长分化环境,按胚胎干细胞生长阶段逐步改变浓度和培养液成分,逐步添加生长因子、神经营养因子等,最终诱导胚胎干细胞高比率定向分化为神经元样细胞。向造血细胞的定向分2080年代初小鼠的胚胎干细胞建立细胞系以来人们就开始了从造血干细胞作为起始细胞高效特异地诱导其向红系祖细胞分化,获得了在体外能够大规模扩增的红系祖细胞,24周胎龄的人胎肝基质细胞与红系祖细胞共培养实现了红系祖细胞的高效脱核生成成熟红细胞,为人胚胎干细胞体仅具有应用前景,自从Doestsan等发现胚胎干细胞在一定条件下可以分化形成心肌细胞后,胚胎干细胞便成为研究心脏表达和功能的有用工具。Kehat等[5]在体外将人的胚胎干细胞成功诱导分化成心肌细胞,这些细胞中有8.1%可自发收缩,5Chen的研究结果显示,给心肌梗死鼠注入胚胎干细胞不仅可使病鼠的存活率提高,而且注入的干细胞可以分化成心肌细胞,但是分化向内皮细胞的定向分,但是成熟内皮细胞体外增殖能力有限,单贴壁培养法,单纯采用血管内皮生长因子G)诱导,使胚胎干细胞贴壁分化、生长,,ashma等7]VEGF梯度浓度成正相关,表明VEGF对血管内皮发育呈剂量依赖性。向上皮细胞的定向分胚胎干细胞可被直接诱导分化为视网膜细胞和视网膜色素上皮,诱导分化的视网膜细胞移植后能整合进视网膜,20082月日本大学的Takahashi等在体外成功诱导人胚胎干细胞高效分化为多角形视网膜色素上皮,同时向培养液中添加成纤维细胞生长因子(bFGF)、牛磺酸和维生素A酸,(如黄斑向其他细胞的定向分胚胎干细胞在一定条件下可以诱导分化为生殖细胞。Hǜbner等用胚胎干细胞在体外分化出细胞和类囊胚样结构。Feng等将胚胎干细胞体外诱导产生了。徐运等在体外对胚胎干细胞向毛细胞转化进行了逐步诱导分化研究,52%表达毛细胞特异性的分子。石伦刚等成功诱导了人胚胎干林海,张芳, 胚胎干细胞的定向诱导分化及应用.生物学教学2011年(36卷)5二.诱导ES/iPS为神经样细iPSCsESCsESCsiPSCs未分状态，体外培养时iPSCs也需要饲养层细胞和分化抑制因子。随着2009年人用四倍体互补法证明了单纯iPSCs可以提供的发育以来，iPSCs全能的特性足以与ESCs媲美(Bolandetal.,2009;Zhaoetal.,2009)。近年来许多用诱导ESCs分化的方法可以在体外将iPSCs分化形成很多组织的细胞，包括神然而不断有iPSCs与ESCs在甲基化水平和microRNA表达水平上有明显差异(Bhutanietal.,2010;Chinetal.,2010; andCooper,2010)。MatthiasStadtfeld等，小鼠iPSCs上12qF1部位的印记的表达沉默是导致iPSCs与ESCs区别的最大诱因这些印记沉默的iPSCs往往可法的iPSCs与ESCs差别甚微(Liuetal.,2010;Stadtfeldetal.,2010)。也有称不同组织诱导形成的iPSCs在体外培养的最初阶段差异较大，iPSCs仍然表达供体组织的某些特异性的标记(Kimetal.,2010)，有人称这种现象为遗传。但是Kimetal.也随着iPSCs传代的进行这种因供体组织造成的差异会愈来愈小所以在这里，同时一起考虑ESCs和iPSCs的神经样细胞诱导分化。目前认为诱导ESCs形成神经细胞的培养系统主要有两类，分别是：1EBs模拟胚胎神经外胚层发生所需要的细胞间的相互作用和信2、ESCs生长在一个相对低的密度环境中，通过条件培养特异性促进神经细胞的发生。与前者相反的是，第二种方法通常了ESCs发育所依赖的细胞间ESCs往神经的分化，简单说首通过形成EBs促进原始三个胚层细胞的分化，接着由培养基质来对神经生长进模拟胚胎环境：EBs最初从ESCs诱导产生神经细胞是通过EBs的形成介导的。去除维持（EBsEBs生长至2-4天后，会形成由内胚层细胞的外胚层区域的结构(Mayeetal2004Rathjenetal2002)。在这个时期，EBs与较早期的胚胎时期相似，其外胚层仍然可以往三个胚层分化，并且仍然保持全能性Oct4的FGF5(Mayeetal2004Rathjenetal2002)。当EBs继续生长6-8天以后，EBs的区域会经历气穴现象，形成了在内的上皮层。上皮层内的细胞最终能够发育形成外胚层，特异的表达Sox2Otx2(Mayeetal2004Rathjenetal2002)Sox1Sox3(Mayeetal.,2004Rathjenetal2002)以定向的诱导EBs的区分化成神经上皮。中胚层或内胚层的一些衍生物可以促进EBs的区内的细胞往神经元和神经胶质分化。视黄酸（RA）诱导的方RA最先被证明可以促进多能性的畸胎瘤细胞产生神体细胞和神经元，之后便被用于ESCsBain等研究发现EBs形成4培养系统内引入5×10-7M的RA继续培养4天，EBs中神经元的发生数量可以提高40%，这便是经典的“4-/4+”的模型(Bainetal.,1995)。随后的几年中，和运动神经元诱导效率(Bibeletal.,2004;Lietal.,2005;Wichterleetal.,2002)。这个方法还被证明适用于人类ESCs。且实验的周期相对较长，一般需要2周以上。MEDIIRathjen证明，培养人肝癌细胞系Hep-G2的条件培养基能够促进小鼠ESCs形成均一的原始外胚层样细胞(Rathjenetal.,1999)。这一条件下形成的EBs不会形成在内的内胚层，但是细胞仍然可以形成本质上纯粹的神经外胚层样的上皮层。此时大多数细胞表达神经干细胞特异性的标记Sox1和Nestin。因子时它们能够分化成神经元、神经胶质细胞和神经脊。Hep-G2的条件培养基神经诱导活性尚未确定，至今还未能在人类ESCs中诱导出神经细胞。EBs在成分明确的培养基中被选这个方法被很多人使用过。简单来说就是结合运用EBs作为中间媒介形成三个胚层来源的细胞，随后经历神经特异性的选择。将形成早期阶段的EBs贴附培养在最低限度的无的系统中，即ITSFn（无培养系统中的成分包含胰岛素、转铁蛋白、硒和纤维连接蛋白）(Guanetal.,2001;Okabeetal.,1996)。经历几天的培养，非神经细胞包括未分化的ESCs，胚胎外的内胚层和中胚层细胞将逐渐留下的只有神经外胚层衍生出来的神体细胞它们高表达Nestin、Sox1、Sox2和其他一些神经特异性的标记(Okabeetal.,1996)。当用层连粘蛋白作为基质，并且配合FGF2（成纤维细胞生长因子）情况下能够促进神经干细胞的增殖，如此约有80-95%的细胞是神经干细胞(Okabeetal.,1996)元(Bibeletal.,2004;Brustleetal.,1999;Leeetal.,2000)FGF2可以提高NSCs的时间才能诱导NSCs产生，一般需要10天至两个星期。因为该方法步骤比较这个方法同样适用于人类的ESCs的神经诱导。EBs可以比较容易诱导神经细胞的发生，但是EBs存在诸多缺陷①EBs大小的变化（其原由于EBs形成初期不同的细胞数量或者EBs生长分化的时间）会影响神体细胞的产生；形成素以便其可以到达EBs的致部分，如此，在EBs的到EBs外部会形成低浓度到高浓度形成素的梯度，导致EBs分化的不同时期出现不同胚层③由大量的细胞形成的EBs不容易被直接的观察诱导过程中细胞形态的变④EBs系统往往缺省了神经诱导的信号因子2许多途径能够促进ESCs向神经的分化包括选择性的无的培养和营养neurobasal培养基。这些培养基最初被用在培养取自胚胎和成体组织的NSCs。数据表明这些培养条件可以通过选择性的促进非神经细胞的维持NSCs的增殖，并且可以去除了中的某些神经抑制因素，譬如BMPs。值得LIFOct4ESCs的凋亡。然而，神经干细胞却更适应这种培养环境，多半与其自分极低密度配分确定的培养Kooy实验组的一系列的研究表明ESCs可以在没有饲养层细胞存在的情况下以极低的密度（1-20个细胞每孔）在无的成分明确的培养基中分化形成神经干细胞(Tropepeetal2001)ESCsEBs的形成，这一方法是将体外培养神经球的悬浮培养系统运用ESCs，诱导后者产生出了神经干细胞。ESCs首先在LIF存在的条件下形成原始神经球，此时的神经球内包含Oct4和Nestin阳性的原始神经干细胞。当去除了LIF并且添加FGF或EGF之后，神经球会逐渐成熟，变成Oct4和Nestin阳性。LIF在原始ESCs的存活。BMP4信号通路抑制，反之这一信noggin则能够促进神经干细胞的生成效率(Smukleretal.,2006)。对于研究缺省机制最好的现象是4小时内80%的ESCs表达Nestin和Sox1。方法为筛选辅助生存和增殖因子提供了非常好的平台前脑和后脑的标记能够胞(Tropepeetal.,2001)ESCs形成原始的神经干细胞是效率非常低，大约只有0.2%的ESCs能够在这样的培养基环境中形成球状克隆。基质细胞介导的神经发生基质细胞是指许多中的疏松的组织细胞，比如和骨髓来源的细胞。它们在行使功能的时候对其他细胞有支持作用。Perrier以及Vazin等实验组发现将人类ESCs终末分化的细胞，譬如多巴胺能的神经元(Barberietal.,2003;Kawasakietal.,基质细胞诱导神经发生的依据根本上是基于通常小鼠和灵长类的神经发生都依赖于中胚层的信号。许多基质细胞被证明可以诱导神经的发生，比如M5，2等。基质细胞虽然可以有效地诱导神经的发生，但是共培养系统会引入异种细胞，最重要的是基质细胞诱导神经发生的机制至今尚不是很清晰。小鼠ESCs系统不涉及，并且不依赖于EBs的形成或者与其他类型细胞的介入。这个方法是由YingESCs被培养在成份明确的培养基中，并且没有不明确因素饲养层的参与(Yingetal.,2003)。Ying等，通过这一诱导系统，ES80%Sox1阳性(Yingetal2003)。此后，有研究运用该系统在诱导的最初阶段通过使用BMP4信号通路的抑制剂noggin可以提高人ESCs神经发生效率(Gerrardetal.,2005)。最近又有人联合使用Noggin和SB431542这两种抑制剂封闭SMAD信号途径，80%ESCsiPSCs能够被诱导成神经细胞(Chambersetal.,2009)。模拟胚胎环境（EBs介导EBs 产物纯，可用FGF2ESCs将EBS 体细经典的“4-/4+”的模型——三.iPSALS中的应Muchofthehopeinvestedinpatient-specificstemcellsisbasedontheassumptionthatitwillbepossibletodifferentiatethemintodiseaserelevantcelltypes.ALSischaracterizedbytheprogressivedegenerationofspinalcordmotorneurons,andrecentstudieshaveshownthatbothcell-autonomousandnon–cell-autonomousfactorscontributetodiseaseprogression.Inparticular,gliafromALSanimalmodelswereshowntoproducefactorsthataretoxictomotorneurons.ThesestudiesindicatethatproductionofbothmotorneuronsandgliawouldbeessentialformechanisticstudiesandperhapsforeventualcellreplacementtherapiesforALS.WethereforeattemptedtogeneratespinalmotorneuronsandgliawiththeuseofadirecteddifferentiationprotocoldevelopedformouseandhumanEScells.EBsformedfromiPScellsweretreatedwithtwosmallmolecules:anagonistofthesonichedgehog(SHH)signalingpathwayandretinoicacid(RA).WhenthesedifferentiatedEBswereallowedtoadheretoalaminin-coatedsurface,neuron-likeoutgrowthswereobserved(Fig.4A).Manyoftheseprocessesstainedpositiveforaneuronalformoftubulin,b-tubuliIb(TuJ1),confirmingtheirneuronalnature(Fig.4Bandfig.S6).Tofurthercharacterizethecellsafterdirecteddifferentiation,weplateddissociatedEBsontolaminin-coatedslidesasasingle-cellsuspension.TuJ1-positiveneuronsthatcoexpressedthemotorneuronmarkerHB9[amotorneuron–specifictranscriptionfactor]couldbereadilyidentifiedinculturesderivedfromboththeA29aandA29bcelllines.InculturesdifferentiatedfromA29biPScells,weexamined3262nuclei(fromthreeindependentdifferentiationexperiments)andfoundthat651stainedforHB9,indicatingthat20%ofallcellsexpressedthismotorneuronmarker.Moreover,morethan90%oftheseHB9-positivecellsalsoexpressedISLET1/2[ISL,transcriptionfactorsinvolvedinmotorneurondevelopment](Fig.4,EtoH,andfigs.S5CandS8).MorethanhalfoftheseHB9-andISL-positiveneuronsexpressedcholineacetyltransferase(ChAT),demonstratinganadvanceddegreeofcholinergicmotorneuronmaturation.CellsexpressingthespinalcordprogenitormarkersOLIG2andPAX6wereprevalentinthesecultures(fig.S9A),whichsuggeststhatthesepatient-specificiPS-derivedmotorneuronsarosefromprogenitorssimilartothosefoundinthedevelospinalcord.Inaddition,cellsexpressingtheglialmarkersGFAP(glialfibrillaryacidicprotein)andS100werereadilyidentified(Fig.4Dandfig.S10).Thus,patient-specificiPScells—likehumanEScells—canrespondappropriaytodevelopmentallyrelevantpatterningsignals,demonstratingthefeasibilityofleveragingtheself-renewalofiPScellstogenerateapotentiallylimitlesssupplyofthecellsspecificallyaffectedbyALS.近年来的研究表明胚胎干细胞向NSCs分化时可白SHH并表达SHH受体(PtcI)SHH信号通路可导致NSCsNSCs的增殖。SHH与维甲酸等联合作用还能诱导胚胎干细胞**维生素A（视黄醇）在细胞内转化为视黄酸，与视黄醛（维生素A在脱氢酶现，其可以激活再生所必要的，是动物肢体再生过程中必不可缺的物质。ManyrecentinsightsintothepathophysiologyofALScomefromthestudyoffamilialformsofthisdisease.Thepatient-specificiPScellsproducedherewillbeimportanttoolsforfurtherstudiesofmechanismsbywhichfamilialdiseasearises.However,morethan90%ofALSpatientsareafflictedbyasporadicformofdisease,thoughttoarisefromcomplexinteractionsbetweengeneticandenvironmentalfactors(26).Asaresultofthesecomplexities,ithasbeenimpossibleuntilnowtodeviseinvitrocell-basedmodelsforthismostcommontypeofALS.Patient-specificiPScellsgeneratedfromindividualswithsporadicdiseasewouldcarrythepreciseconslationofgeneticinformationassociatedwithpathologyinthat.ThisapproachwouldallowstudyoflivingmotorneuronsfromALScaseswithunknowngeneticlesions,providinginsightintotheirintrinsicsurvivalproperties,theirinteractionswithothercelltypes,andtheirsusceptibilitytotheenvironmentalconditionsthatareconsideredtoplayanimportantroleinALS0年代出现的免疫组化技术用于鉴定细胞类型，研究开始使用免疫组化来确定神经元含有单胺酶酪氨酸羟化（多巴胺β羟化（R（和非神经元特异性烯醇化（分别为神经元和神经胶质细胞特异标记的出来后免GF（IGF胆碱乙酰基转移酶，小白蛋白，神经丝蛋白作为了标记物。通常用到神经元抗原的分子性质和功能特性在发现它们的时候是未知目前研究在研究中有大量的免疫组化标记物来帮助区分大脑中细胞的神经元特异性烯醇化酶NSE,也简称为γ-烯醇或烯醇化酶2，是由成熟神经元和神经 细胞持续表达的胞虽然NSE1992年，Mullen等人了能够识别脊椎动物神经元特异的白单克隆抗体的产生该蛋白被称（NeuN，能够在成年小鼠中枢和外周神经系统的多数神经细胞类型中检测到。NeuN的出现致。研究现在已将NeuN鉴定为Fox-3，Fox-3蛋白质参与调控的mRNAFox-3由神经系统微管相关蛋白2（MAP-MAP-2记物它在脊椎动物胚胎和成年神经系统的组织中表达在神体中表达较弱，但在随后显著提高（大神经元特异性微管蛋白亚型βIII一天后表达。在大MAP-22a、2b2c三个亚型。MAP-2c似乎在早期发育过程中特异性表达，只在轴突中表达。MAP-2cMAP2a所替代。与此相反，MAP2b被发现整个生命过程中都有表达。MAP-2用，因此只有在树突中能够观察到。ßIII微管蛋白TuJ1，细胞内的等等方面发挥作用。因此，免疫组化染色发现TuJ1存在于未成神经元胞体，树突，轴突和轴突末端。使用免疫组化检测TuJ1的显着优点之一是其展现轴突和末端细节的能力。虽然某种β-细胞中也有发现，但它却并不能被TuJ1双肾上腺皮质激素临重要的神经细胞标记胆碱乙酰转移酶CT是催化乙酰胆碱的酶因为它在绝大多数的胆碱能神经元中表达CT的免疫反应性经常被用来作为在各种神经退行性疾病中认知能力下降的标志物。它的检测已经被用于研究阿尔茨海默氏病（AD）的典型神经性变化中，CT纤维网的胆碱能神经元损坏和整体形态的变化。酪氨酸羟化酶同样，酶TH免疫组化一直是研究帕金森氏病的一个重要工具，帕金森氏病是伴有黑质多巴胺能细胞损失的运动疾病。TH能够限制多巴胺（以及肾上腺素和去甲肾上腺素）的速度。在验尸研究中，TH免疫组化已被用来量化缓解，TH免疫组化已作为检测多种帕金森氏病的动物模型研究中保护作用的一种。可以进行一些简单的分神经元轴·Tau：NeuronTypeofMAP;helpsmaintainstructureofthe神经元树·MAP：NeuronDendrite-specificMAP;proteinfoundspecificallydendriticbranchingofneuron。是组成神经元细胞骨架的神经元早differentiatedneuronNervousSystem，β-IIITubulin又名tubulinβ-4，是原始神经上皮中所表达的最早的神·Noggin：NeuronAneuron-specificgeneexpressedduringdevelopmentofneuronsNeurosphereEmbryoid星型胶质细胞标志Galfbraryadcpon(GP)AyePensecialyedyatye.属于三型中间丝蛋白成员，在星型胶质细胞中大量特异性表达。在外周神经系统中的细胞和部分雪旺氏细胞中也有少量表达。神经干细胞也会频繁并大量的表达GAPGAP运动神经·HB9：amotorneuron–specifictranscription·ISL1：transcriptionfactorsinvolvedinmotorneuron少突胶质细胞标志·Myelinbasicprotein：OligodendrocyteProteinproducedbymatureoligodendrocytes;locatedinthemyelinsheathsurroundingneuronalstructures，是由中枢神经系统中·O4：OligodendrocyteCell-surfacemarkeronimmature,develooligodendrocyte·O1：OligodendrocyteCell-surfacemarkerthatcharacterizesmatureoligodendrocyte神经干细·Nestin:NestinNeuralprogenitorIntermediatefilamentstructuralproteinexpressedinprimitiveneuraltissueNestinVI型中·CD133:120kDa5个跨膜结构域，它能识HSCsCD34+亚类。CD133CD34筛选HSCCD133+可被体外诱导分化为内皮细胞。并且，canbeinducedtodifferentiateintoendothelialcellsinvitro.并且，人的神经干细胞用抗CD133CD133Neuralstemcell,HSCCell-surfaceproteinthatidentifiesneuralstemcells,whichgiverisetoneuronsandglialcells·PSA-NCAM(Polysialicacid-neuralcelladhesionmolecule):胚胎时NCAMPSA-NCAM经常高唾液酸化，在神经元发PSA-NCAM可能和突触的重排和可塑性有关。在成年，PSA-NCAM的表达限制在保留可塑性的区域。神经元限制性的前体细胞可由高表达PSA-NCAM而·p75NeurotrophinR(NTR):p75NTR,也称为低亲和神经生长因子受体。p75NTR,Trk存在时被活化,提高对神经营养因子的反应性。TrkCp75NTR协同作用，参与神经系统发育。最近，p75NTR神经元标·Neurofilament(NFNeuronImportantstructuralproteinforneuronidentifiesdifferentiatedneuron是神经元所特有的·NeuN：成为识别神经元标准的免疫细胞化学标志·NSE：Neuronalspecific突触标记·Synaptophysin：NeuronNeuronalproteinlocatedinsynapses;indicatesconnectionsbetweenneurons·SynaptotagminsCa2+信号选择合适的免疫组化标记NEUNMAP-2标记。对这些标记的抗体已的抗体就可能被使用到。其中包括一些标记谷氨酸能的，GABA能的，胆碱能的或者胺神经元。可以获取的信息依赖于目标蛋白的定位先前的研究了使用抗一种定位于整在哺乳动物神经系统发育过程中，前神经碱性螺旋环螺旋型basichelix-loop-helix(bHLH)转录因子参与了关键事件的调节。前神经bHLH转录DNA上E-box序列-CANNTC游如NeuroD1等的转录的一类。前神经bHLH转录因子包括Mash1、Math、Neurogenin1，Neurogenin2，它们均在大脑皮层前祖细胞中高表达。前神经bHLH转录因子参与了神经干细胞向神经元、神经胶质细胞的分化选择定型。当前神经bHLH活性丢失后在bHLH的激活型因子中，Ngn2蛋白分子作为原神经蛋白分子中统发育过程中，Ngn2通过激活一系列原神经bHLH下游转录因子，诸Nex1,NeuroM,NeuroD/BETA2来决定神经祖细胞定向分化为神经细胞运，同时抑制其向胶质细胞的分化。NeuroD转录因子的激活能够打破干细CarolFode等人证实三个胚层的分化过程中均有相同的BHLH中转录因子的表达，而这些因子的表达顺序是Ngn2>Math3>NeuroD>Nscl1，Ngn2的突变可神经嵴向三个胚层的分化。2008年文献Ngn2转染神体细胞（s）促进了s的存活，并且显著地增加了s诱导为成熟神经元的比例。实验者通过慢载体将Ngn2转染入皮源性的iPs，研究这一促进外胚层干细胞向神经细胞分化过程中起重要作用的原神经能否同样促进属于iPS向神经细胞的定向分化。在哺乳动物神经系统中原神经的产物Mash1和Ngn2可以诱导NotchDll1Notch通路。Notch蛋白是一种跨膜蛋白被激活后其胞内区（NICD）至核内和DNA结合蛋白RBPj形NICD-RBPBHLHhes1hes5hes1hes5的表达上调反过来抑制原神经的表达从而使干细胞处于相互抑制的状态而诱导培养基培养7天后，与空转染组和空白对照组细胞相比较，Ngn2Dll1hes1的表达明显降低，均有显著统计学差异（P<0.017天后皮肤源性iPS持续的Ngn2基NotchDll1hes1的下调，从而抑制了Notch，本研究中通过慢载体介导ngn2转染SKPs出一种新型的iPS结果证实这种iPS在诱导后具有更高神经分化效率Dll1蛋白表达量明显高于对照组，而hes1表达明显低于对照组。从而可以得出结论，Ngn2转导得到的iPS更容易在诱导后发生神经分化。，·AcomprehensivereviewofimmunohistochemicalmarkersforCNSneuronalcellPatimaTanapat(patimadottanapatatgmail) Princeton,NewJersey,United·JohnT. InducedPluripotentStemCellsGeneratedfromPatientswithCanBeDifferentiatedintoMotor 29AUGUST2008VOL四.iPS治疗性应ES细胞进行移植治疗的话，因细胞供体和受体的免疫组织不相容性而会导致免疫排斥反应，这是众人所不希望看到的结果；iPS的出现给了学界一个新的思路——使用自身的体细胞进行诱导多能干细胞从而抑制免疫排Hanna等人率先在小鼠中用iPS蛋白分别用人的α、Aγ和βS-珠蛋白所替代（Wechoseahumanizedknock-inmousemodelofsicklecellanemiainwhichthemousea-globingeneswerereplacedwithhumana-globingenes,andthemouseb-globingeneswerereplacedhumanAγandβSsickle)globingenes。这样的小鼠出现了典型的镰刀形贫血症状（HomozygousmiceforthehumanβSalleleremainviableforupto18monthsbutdeveloptypicaldiseasesymptomssuchassevereanemiaduetoerythrocytesickling,splenicinfarcts,urineconcentrationdefects,andoverallpoorhealth）首先,将患病小鼠尾尖成纤维细胞重编程为iPS细胞（infectedthecellswithretroesencodingforOct4,Sox2,andKlf4factorsandalentiencodinga2-loxc-MyccDNA，然后通过同源重组的方法用人野生型βA-珠蛋白替代了βS-珠蛋白（iPS#3.3cellswereelectroporatedwithaingconstructcontainingthehumanβAwildtypeglobingeneiPS细胞定向分化为造血祖细胞(hematopoieticprogenitors,HPs)，并将纯化后的HPs移植入hβS/hβSHPsiPS细胞分化而来的HPs有效地抑制了镰刀形红细胞贫血症症状。例如，多染性细胞(polychromasia)降低，红细胞大小不等现象(anisocytosis)和红细胞变形(poikolocytosis)减少,以及红细胞数目增加。由于c-myc存在性，所以文中使用了anadeno binasetodeletethe 获得的iPS细胞大多是通过介导表达转录因子而建立的这样的iPS细胞基因组DNA中有DNA，因此无法应用在身上。但是有这样一个想法：如果将iPS细胞分化为成红细胞这些红细胞将不再有细胞核和组DNA，从而去除了DNA的安全隐患，是否可以安全用于治疗?HannaJ，etal.TreatmentofSickleCellAnemiaMouseModelwithiPSCellsGeneratedfromAutologousSkin.Science2007,318:1920-1923神经系统遗传性疾病(neuralhereditarydiseases)是由于卵遗传物质的量结构或功能改变导致发育的出现以神经系统功能缺损为主要临床表现的高疾病。大多数神经系统遗传性疾病异质性极大,病情进展缓慢,发病的分子机理尚不明确,导致无法对疾病做出准确的。因此,临床和治疗亟多巴胺能神经元病变的神经系统遗传强直和步态,包括性和散发性两种目前,人们已经发现多个与PD发病相关的,如:α-synuclein(PAKR1/4)、Parkin(PARK2)、UCHL1(PARK5)、关于PD-iPS细胞模型的,过去主要集中于诱导方法的研究。2011年,Nguyen等首次对PD-hiPSCs衍生的多巴胺能神经元的相关生物学特性进行了研究。他们发现,PD-hiPSCs衍生的多巴胺能神经元的α-突触白(α-synuclein)明显升高,细胞对过氧化氢、MG-132和6-羟多巴胺的敏感性也随之变强。Byers等在研究中也证实了这一现象。此外,他们还发现LRRK2-G2019S突变和α-突触白三倍体患者来源的iPS细胞衍生的多巴胺能神经元可以更好地模拟PD的早期病变过程。最近,Liu等[40]发现,LRRK2突变会导致PD-iPS细胞衍生的 细胞核结构。运动神经元病变的神经系统遗传性,脊髓性肌萎缩症是由于SMN的点突变或缺失突变引起运动神经元功能丧失而导致的弛缓性瘫痪和肌肉萎缩,iPS细胞模型的第一个2009年Ebert等研究发现,与正常hiPSCs相比SMA-hiPSCsSMN蛋白(人类运动神经元生存蛋白)的表达及其衍生的运动神经元的数量和体积都有明显降低。此后的研究还证实,SMA小SMN的表达。2013年,Corti等采用特殊设计的寡核苷酸链纠正了SMN的突变位点,并发现修复后的SMASMAhiPSCs衍生的运动神经元不再出现修复之前的疾病特异性表型此外,将修复后的SMA-hiPSCs衍生的运动神经元移植入SMA小鼠体内可以延长其并减轻疾病表型,为细胞移植治疗带来新的曙光。,肌萎缩性脊髓侧索硬化症包括性和散发性两种,遗传性ALS主要是由于SOD1(超氧化物歧化酶)VAPB(修复相关蛋白)以及TDP-43(Tar-DNA结合蛋白)Dimos等建立了SOD1突变的ALS-hiPSCs模型,并诱导其分化为运动神经元,但当时未能鉴定出异常表型此后,Mitne-Neto等建立了VAPB突变的ALS-hiPSCs模型,VAPB蛋白表达水平显著下降,表明VAPB可能与ALS疾病的发生相关。最近,Egawa等[43]建立了TDP-43突变的ALS-hiPSCs模型,不仅发现其衍生的运动神经元表达异常高水平的突变TDP-43蛋白,而且筛选出一种可以减弱ALS运动神经元异常表型的组蛋白乙酰转其他神经元病变的神经系统遗传性雷特综合征是由位于X上编码甲基化结合蛋白2的MECP2突变引起谷氨酸能神经元突触形成能力下降而导致的进行性智力和孤独症行为Marchetto等证明,RTTiPSX染色体随机失活的生理过程,并最终形成有功能的神经元。同时发现,RTT-hiPSCs衍生的神经元某些与该患者本人一致的病变表型,包括谷氨酸能神经元突触形成的减少,神经元形态的改变,功能依赖型钙信号的瞬变和电生理的异常。最近,Farra等和Ananiev等分别通过建立携带MECP2不同突变位点的不同患者来源的RTT-hiPSCs模型,再次验证了其衍生神经细胞的上述异常表型。脆性X综合征(fragileXsyndrome,脆性X综合征是由位于X上编码FMRP蛋白的FMR1上(CGG)n三核苷酸重复序列的异常引起神经元减少和功能异常而导致的智力2010年,Urbach等分别建立了FXS来源的ES细胞系和iPS细胞系研究发现,突变的FMR1在未分化的FXS-hESCs中有表达,而随着分化的发生表达才会逐渐沉默。然而,在FXShiPSCs中,突变的FMR1始终,这表明iPSES细胞来源的疾病模型在疾病发生机理等研究中具有差异。2012年,Wang等发现FMRP蛋白的缺失会引起突触前功能和神经元形成的异常。LiuFXS-hiPSCs衍生的多种神经元亚型均有表型畸变和功能异常。在神经系统遗传性疾病药物筛选和临床治疗中应疾病iPS细胞应用于药物筛iPS细胞定向诱导分化为特定的神经元或神经胶质细胞,为高病变神经细胞的表型和表达水平的变化,可以筛选出能够改善或恢复病变目前,iPS细胞在神经系统遗传性疾病药物筛选的研究中取得了一定的突破。Tropea等胰岛素生长因子1(insulingrowthfactor1,IGF1)可以在很大程度上RTT小鼠的疾病表型。MarchettoIGF1MECP2不同突变位点来源的RTT-hiPS细胞衍生神经元的异常表型,并发现给予合适浓度(100μg/mL)的庆大霉素可以挽救由于MECP2无义突变(RTT-Q244X)导致的RTT疾病表型。Egawa等建立了TDP-43突变的ALShiPS细胞模型,并从的四种化合物中最终筛选出一种可以一定程度上消除病变ALS运动神经元异常(A)iPS细胞在结合治疗的细胞替代治疗上的应用首先，从身上分离体细胞，如成纤维细胞和角化细胞；其次,表达外源OCT4,SOX2,KLF4和C-MYC以诱导iPS细胞然后,通过同源重组来替代因组中有缺陷的;接着,将遗传修饰后的iPS细胞在体外分化为所需要的细胞,如血液细胞和神经细胞;最后,将所需要的细胞移植入体内,以达到治疾病iPS细胞应用于疾病治了将中脑组织移植入PD的壳核中,多数术后两个月时可以观察到病情明显好转,并发现在左旋多巴药物治疗的情况下病情可以稳定维4~6年。随后的研究发现,PD啮齿类动物体内后可自发地向多巴胺能神经元分化,术后几周内均可观察到病情缓解的现象。近年来,Wernig等诱导小鼠成纤维细胞重编程为iPS细胞,并定向诱导其分化为中脑多巴胺能神经元的各种亚型,通过荧光激活细胞分选术(fluorescenceactivatedcellsorter,FACS)将细胞中可能混有的未分化细胞剔除,以避免移植大鼠体内后致,将获得的多巴胺能神经元经手术移植入纹状体6-羟基多巴胺缺5PD大