植物生物工程实验二(植物DNA的提取)

植物生物工程实验二(植物DNA的提取)第一页，共45页。实验目的了解植物DNA提取方法，熟悉操作步骤掌握植物大分子操作注意事项及试剂用具准备方法掌握DNA质量紫外分光光度计检测方法了解PCR原理，熟悉操作步骤掌握核酸的琼脂糖电泳检测方法第二页，共45页。

保证DNA一级结构的完整性排除其它分子的污染RNA、蛋白质、多糖等DNA提取的原则实验原理（DNA提取）第三页，共45页。DNA存在部位主要存在于细胞核中，线粒体和叶绿体中也少量存在第四页，共45页。基因组DNA的提取CTAB法SDS法质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法DNA提取的方法第五页，共45页。在浓氯化钠溶液(1～2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来.分离得到核蛋白后,需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白的方法有3种:

①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间,而DNA溶于上层水相.用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来.如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀,得到的是游离的DNA.

②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,与核酸分离,从而从材料中直接提取出DNA.

③用苯酚处理,然后离心分层,DNA或溶于上层水相,或存在于中间残留物中,蛋白变性后则停留在酚层内.吸出上面水层,将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中,得到白色纤维状DNA沉淀第六页，共45页。CTAB法原理

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl），该复合物可溶的有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质上清加入乙醇沉淀DNA。CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。CTAB第七页，共45页。CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入第八页，共45页。SDS法原理SDS阴离子去垢剂高温（55～65℃）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析高盐(KAc或NH4Ac)或降低温度（冰浴）使蛋白质及多糖杂质沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提乙醇沉淀水相中的DNASDS第九页，共45页。组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)SDS提取缓冲液的配方第十页，共45页。DNA提取基本步骤材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存第十一页，共45页。

基因组DNA新鲜材料，低温保存细胞培养时间不能过长材料准备第十二页，共45页。基因组DNA材料过多影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：

植物材料－－液氮研磨培养细胞－－蛋白酶K细胞裂解第十三页，共45页。采用吸附材料吸附分离DNA，应提供相应的缓冲体系采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法核酸分离纯化第十四页，共45页。多糖的去除：多糖水解酶蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）蛋白酶处理多酚的去除：加入还原剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除：70％的乙醇洗涤第十五页，共45页。预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀晾干DNA，让乙醇充分挥发核酸沉淀

若长期储存建议使用TE缓冲液溶解pH值为8.0，可防止DNA发生酸解第十六页，共45页。DNA质量检测紫外分光光度计检测法

嘌呤和嘧啶的母环含有共轭双键，因此也有紫外吸收现象，且在260nm和280nm处也存在吸收峰。蛋白质中含苯环的氨基酸在这两个波长下也会发生光吸收。因此，通过260nm和280nm下样品的吸收值比率可判断核酸纯度第十七页，共45页。A：测DNA：

纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。1)OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。2)小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。测定结果分析第十八页，共45页。琼脂糖电泳琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。第十九页，共45页。DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作第二十页，共45页。根据OD260定量：測定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下：a.dsDNA(doublestrandedDNA)=50mg/mlb.ssDNA(singlestrandedDNA)=40mg/mlc.oligonucleotide=33mg/ml第二十一页，共45页。第二十二页，共45页。PCR实验原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。第二十三页，共45页。DNA复制（replication）起始解旋引物酶结合延伸连接终止解链方向3´3´53´5´3´5´3´5´3´353第二十四页，共45页。第二十五页，共45页。第二十六页，共45页。温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。第二十七页，共45页。一般PCR反应条件第二十八页，共45页。仪器药品1.5ml离心管；5ml离心管；研磨棒；5ml吸头；1000ul吸头（盒）；200ul吸头（盒）；10ul吸头（盒）；5ml移液器；1000ul移液器；200ul移液器；30ul移液器；2ul移液器；试剂瓶；量筒恒温水浴锅；高速离心机；紫外分光光度计；电泳仪；电泳槽；酸度计；电子天平；PCR仪CTAB；NaCl；Tris；HCl；H3BO4；EDTA；NaOH；PVP；琼脂糖；EB；引物；dNTP；Taq酶；EB第二十九页，共45页。实验步骤试剂配制贮存液最终含量100mlTris（121.14）1M12.114g1MTrisHCl,pH8.0先用蒸馏水溶解加至90ml左右，再用HCl调整pH至8.0，定容至100ml贮存液最终含量100mlEDTA（292.25）0.5M14.613g0.5MEDTA,pH8.0先用蒸馏水，再加入NaOH（固体）调pH至8.0，定容至100ml贮存液最终含量100mlNaCl（58.44）5M29.22g蒸馏水定容至100ml5MNaCl第三十页，共45页。贮存液最终含量100mlCTAB2%2g5MNaCl1.4M28ml0.5MEDTA20mM4ml1MTrisHClpH8.0100mM10mlPVP1%1g蒸馏水定容至100ml2×CTAB贮存液最终含量（10ml）3mlCTAB1g0.3g5MNaCl1.4ml0.42ml蒸馏水8.6ml2.58ml10%CTAB第三十一页，共45页。贮存液最终含量100ml1MTrisHCl,pH8.010mM10ml0.5MEDTA,pH8.01mM2ml蒸馏水定容至1000mlT10E1贮存液最终含量（1000ml）100mlTris54g5.4gH3BO427.5g2.75g0.5MEDTA,pH8.020ml2ml蒸馏水定容至100ml5×TBE第三十二页，共45页。异丙醇；70%乙醇；90%乙醇；10mg/mlEB贮存液最终含量（100ml）4.2ml异戊醇4ml168ul氯仿96ml4032ul抽提液1MTrisHCl；0.5MEDTA；5MNaCl；T10E1以及所有需使用的离心管，各种吸头均需灭菌第三十三页，共45页。操作流程操作规程1. 称取100mg新鲜叶片，置于预冷1.5ml离心管中，加入液氮，研为细粉。加入350μl新鲜2×CTAB缓冲液，再仔细研磨。（CTAB用于抽提DNA）2. 用350μl新鲜2×CTAB缓冲液，冲洗研磨棒，加入2μlβ－巯基乙醇，混匀。65℃水浴45分钟，每15分钟摇动一次。冷却至室温，静置2分钟。3. 每支离心管加入700μl氯仿：异戊醇（24：1）（672氯仿:28异戊醇）混合液。轻柔短暂地混和，避免DNA断裂。颠倒几次。（氯仿、异戊醇、苯酚都用于沉淀蛋白质）4. 在微型离心机中，以14，000rpm离心5分钟。移取上层水层，置于新的、标识好的1.5ml离心管中。注意避免取到中层物质。将氯仿：异戊醇废液倒入废液缸。5. 加入50μl10％CTAB（溶于0.7MNaCl），轻柔混和，并保证混和完全。第三十四页，共45页。6. 重复第3、第4步。7. 每支离心管中加入等体积异丙醇（400－500μl）。上下颠倒几次，4℃静置20分钟（或－20℃，15分钟）。（异丙醇用于沉淀DNA）8. 14，000rpm离心20分钟。小心倒出上清夜，避免DNA颗粒丢失。倒置离心管，空气干燥（1－2分钟）。9. 用1ml70％乙醇清洗DNA（3分钟），14,000rpm离心30分钟。小心倒出70%乙醇，用1ml90％乙醇清洗DNA，14,000rpm离心30分钟，小心地倒去乙醇。倒置离心管，空气中干燥，或用真空泵干燥15分钟。（乙醇用于去除低分子量寡核苷酸和核苷三磷酸）10. 以150μlT10E1或蒸馏水溶解DNA，加入1～2μl不含DNA酶的RNA酶A（10mg/ml）。37℃反应1小时。11. 4℃保存（－20℃长期保存）。第三十五页，共45页。冷却至室温2μlβ-巯基乙醇100mg鲜叶水浴1.5ml离心管液N2研磨700μlCTAB65℃，45′离心↑↓/15′加入700μl氯仿：异戊醇（672:28）静置2min涡旋混和，↑↓加入50μl10％CTAB温和短时5′14,000rpm上清夜短时温和轻柔混和加入等体积异丙醇循环一次离心↑↓静置30′4℃，20′沉淀离心14,000rpm20′↓空气干燥1－2′1ml70％乙醇沉淀3′14,000rpm沉淀加入150μlT10E11ml90％乙醇离心14,000rpm30′↓空气干燥1－2μlRNAseA37℃，1h-20℃保存-20℃，15′冷却至室温第三十六页，共45页。琼脂糖凝胶电泳取5×TBE缓冲液20mL加水至100mL，配制成1×TBE稀释缓冲液，待用。胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中，加入50mL1×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为1％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。第三十七页，共45页。3.胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg/mL。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入1×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。

第三十八页，共45页。加样：取10μLDNA样品与2μL6×上样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/mL的EB溶液中，室温下染色20-25min。观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。

第三十九页，共45页。紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤a．吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后，转入分光光度计的石英比色杯中。b．分光光度计先用一定量的水校正零点。c．测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。d．计算浓度。

双链DNA样