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3/3实验三有机溶剂积淀法制备大豆脲酶一、实验原理脲酶（）广泛存在于微生物和动、植物组织中，1926年，SumnerJ曾用32％的丙酮溶液从刀豆粉中提取脲酶，并获得了却晶。该酶相对分子质量为483000，由6个亚基组成，等电点4.9,溶于水和稀缓冲液，粗酶较牢固，纯酶不太牢固，结晶酶在低温下可牢固1年以上。本实验用乙醇或丙酮从大豆种子中提取脲酶，并用有机溶剂和等电点结合法制备该酶。二、实验步骤1.提取1）称取5g人造浮石，置小烧杯中，用2％乙酸浸泡两次，倾去酸，加蒸馏水屡次冲刷至中性，沥干备用。2）称取10g新鲜大豆粉，置入锥形瓶中，加上述人造浮石，加50mL32％丙酮溶液，在冰浴中连续摇动4min～5min,4层纱布过滤，采集滤液。3）将滤渣重新置于锥形瓶中，另加10mL32％丙酮，再提取一次。4层纱布过滤，滤液在4℃，3500r·min-l条件下离心8min～10niln，小心倾出上清液，计量体积。取lmL酶液保存，供测酶活力和蛋白质用。2.积淀脲酶在32％的丙酮中可以迟缓齐聚而积淀，但当酶液在等电点周边时，积淀生成更快。故：（1）将提取的酶液置冰浴中，在迟缓搅拌下，用点滴管逐滴滴加2％醋酸，其实不停用精巧pH试纸检测pH变化，察看产生污浊的现象，直至pH4.9左右。置4℃低温下过夜，可析出积淀。2）将积淀物仔细转入预冷的离心管，3500：·而n一，离心10～。上清液回收丙酮；积淀即为脉酶粗品。风干后，称重，计算酶的收得率。1/33.重结晶1）将所得粗酶溶于少量蒸馏水中，吸取0.2mL～0.4mL用于测定酶活力和蛋白质，此即粗酶的活力。2）酶溶液在冰浴中冷至2℃～4℃，搅拌下迟缓滴入等体积64％的预冷丙酮溶液，保持低温条件下让其迟缓析出结晶，需要较长的时间，可获得较好的正方形晶体。若是将溶液调至等电点结晶，则结晶速度较快，但晶形不够规整。结晶干燥后低温保存。三、结果计算酶收得率（%)=（酶干重＋酶干重x测酶活留取液体体积／酶液整体积）÷样品重×100%酶的比活力［U·mg-1，(pr.)]＝总活力／总蛋白质报告试验结果及察看到的有关现象记录。酶制备记录表以下：整体积步骤(l）提取液(2）粗酶(3）结晶酶收得率-1-1U·ml总活力(U)mgml·总蛋白质（mg)U·mg-1(pr.)(%)（ml）酶活力蛋白质比活力四、仪器与试剂1.家用磨粉机、冰浴设备、离心计、5mL、10mL、50mL离心管、1.5mL塑料离心管及其余常例仪器：2/32.新鲜大豆或大豆粉；3.人造移石（专用于吸附氨Permutin颗粒状人造浮石）;4.

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