植物细胞培养课件

9植物细胞培养9植物细胞培养19.1植物细胞培养概念植物细胞培养是在离体的条件下培养植物细胞的方法。它是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。

9.1植物细胞培养概念植物细胞培养是在离体的条件下培养植物2植物组织培养探索阶段（1902-1929年）Haberlandt：观点：首次进行离体细胞培养高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞9.2植物细胞培养发展史植物组织培养探索阶段（1902-1929年）Haberlan31、1939年，Gautheret和Nobercourt分别成功培养了烟草、萝卜等形成层组织。2、50年代，Taleche和Nickelll成功悬浮培养了植物细胞，

Routier和Nickell提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想并申请了专利。3、Reinhard等（1968）首先将这种设想转变成现实，生产出了哈尔碱(harmine)。4、Kaul等（1969）、Furrya等(1972)和Teuscher等（1973）分别培养植物细胞获取了其中的薯蓣(山药）皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin）。9.2植物细胞培养发展史1、1939年，Gautheret和Nobercourt分别4概论早在1956年，Routier和Nickelll就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。植物中含有数量极为可观的次代谢物质据保守的估计，目前已发现的植物天然代谢物已超过2万种，而且还在以每年新发现1600种的速度递增目前仍约25%的法定药品来自植物9.3植物细胞培养的应用概论早在1956年，Routier和Nickelll就提5

目前，植物细胞培养技术已在农业、医药、食品、化妆品、香料等领域广泛用于大规模生产有价值的产品。小规模的细胞培养通常在培养瓶中完成，而大规模的培养可在发酵罐中进行。问题请列举出3至5种由培养植物细胞获得的有经济价值的产物。紫草宁抗肿瘤药物紫杉醇薯蓣皂苷和人参皂角苷9.3植物细胞培养的应用实例目前，植物细胞培养技术已在农业、医药、食品、化妆69.3植物细胞培养的应用领域（1）有用代谢物质的生产；（2）名贵植物和名贵花卉等种苗的快速繁殖；（3）进行植物细胞遗传、生理、生化和病毒等方面的研究9.3植物细胞培养的应用领域（1）有用代谢物质的生产；7现在一些发达国家已集中相当数量的人力、财力潜心开拓这个经济潜力十分巨大的生产领域。目前世界最大批量工业化培养细胞（烟草细胞）已达2万升（20吨）。我国在“八五”、“九五”和“863计划”中连续拨款资助工业化培养红豆杉细胞生产抗肿瘤药物紫杉醇的研究，目前已达到60mg/L的世界先进水平。近几年来，我国植物提取物产量以每年20%的速度递增，出口看好。估计2007年，我国植物提取物总出口金额达6亿多美元。9.3植物细胞培养的应用现状现在一些发达国家已集中相当数量的人力、财力潜心开拓这个经济潜89.4植物细胞培养特性植物细胞培养的优点：1、可控制A、对细胞的物理和化学环境、遗传环境进行调节控制，使之不受外界环境（气候、季节和地域）影响；B、选择性生产所需的代谢产物2、效率高

A

、生长速率快，生产效率高9.4植物细胞培养特性植物细胞培养的优点：9植物细胞培养的最大优点是：

植物细胞可以在简单的合成培养基上正常生长。用于植物细胞培养的基础培养基成分基本上与整个植物的要求一样，但是用于培养细胞、组织和器官的培养基需要满足各自的特殊要求。根据特定的植物种类和培养系统，培养基的基本营养成分可作适当的调整。9.4植物细胞培养特性植物细胞培养的最大优点是：9.4植物细胞培养特性10与微生物培养相比植物细胞培养的缺点：1、效率低

A、培养周期较长、生长缓慢、生产率低；2、培养困难

A、所需有效成分含量不高；

B、大量培养时，往往不耐剪切、接种量大及放大后产量下降等一系列问题。9.4植物细胞培养特性与微生物培养相比植物细胞培养的缺点：9.4植物细胞培养特性11

植物细胞培养基通常包括无机盐、碳源、维生素、植物生长激素和有机添加物等

无机盐类

：无机盐浓度一般25mmol左右

微量元素主要包括碘、硼、锰、锌、钼、铜、钴、铁等

碳源和能源：蔗糖是最常用的碳源

维生素：植物细胞的生长都需要硫胺素。可在植物细胞培养基中加入烟酸、吡哆醇、泛酸、生物素和叶酸等。原生质体培养通常需要大多数必需维生素。1、植物细胞培养基的组成9.5植物细胞培养基植物细胞培养基通常包括无机盐、碳源、维生素、12

植物生长激素

植物生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落酸等四大类。

有机氮源

：蛋白质水解物、谷氨酰胺或氨基酸混合物等。

有机酸：加入丙酮酸，或者柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等三羟酸循环的中间产物

复合物质：在植物细胞的培养过程中，酶母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁等复合物质通常可以作为细胞的生长剂。9.5植物细胞培养基植物生长激素植物生长素、细胞激动素、132、植物细胞培养基的制备

制备培养基时，培养基中使用无机盐、碳源、维生素、有机酸和植物生物激素都应该采用最高纯度级的试剂和药品。有些生长激素在使用前需要进行重结晶提纯。由于一些生长激素难溶于水，配制时可先溶于2-5ml的酒精中，其酒精-水溶液要用吸附法进行脱色处理，然后慢慢加入蒸馏水，稍微加热后，再稀释至所需体积。植物细胞培养基的制备是非常严格的9.5植物细胞培养基2、植物细胞培养基的制备制备培养基时，培养14获得单细胞的方法悬浮培养固定化培养细胞培养内容包括两方面悬浮培养单细胞培养促进细胞生长和生物合成促进细胞生长和形成完整植株9.6植物细胞培养细胞培养内容包括两方面悬浮培养促进细胞生长和生物合成9.615由完整的植物器官分离单细胞叶片是分离单细胞的最好材料机械法、酶解法由培养组织中分离单细胞9.6植物细胞培养单细胞的分离：由完整的植物器官分离单细胞9.6植物细胞培养单细胞的分离：16撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞单细胞的分离撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞单细胞的分离17第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心单细胞的分离第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心单细胞181-2、酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞加果胶酶过滤、离心单细胞的分离1-2、酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶191-3、机械法和酶解法比较机械法酶解法细胞不受到酶的伤害不用质壁分离细胞产量低细胞易破细胞受到酶的伤害要质壁分离细胞产量高细胞不易破单细胞的分离1-3、机械法和酶解法比较机械法酶解法细胞不受到酶的伤害细202、由培养组织分离单细胞茎段步骤：1诱导产生愈伤组织；2愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；单细胞的分离2、由培养组织分离单细胞茎段步骤：1诱导产生愈伤组织；单细21步骤：摇床用于振荡继代悬浮3（Suspensionculture)将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。单细胞的分离步骤：摇床用于振荡继代悬浮3（Suspensioncult22悬浮培养Suspensionculture特点细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。必须指出悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。悬浮培养Suspensionculture特点细胞可以不断231、起始悬浮液的制备愈伤组织液体培养基摇床振荡悬浮培养质地疏松，细胞分散程度大；质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养转速30-150rpm防细胞破裂悬浮培养1、起始悬浮液的制备愈伤组织液体培养基摇床振荡悬浮培养质地疏24悬浮培养悬浮培养252、悬浮培养的基本形式分批培养（Batchculture）连续培养（Continuousculture）悬浮培养2、悬浮培养的基本形式分批培养（Batchculture）26继代分批培养分批培养继代分批培养分批培养27滞后期对数生长期直线生长期缓慢期静止期培养时间培养细胞数目1234512345分批培养生长曲线滞后期对数生长期直线生长期缓慢期静止期培养时间培养细胞数目128连续培养（Continuousculture）加入培养基排出培养基及其培养物

二者体积相等分：开放式连续培养（OpenC.C）封闭式连续培养（ClosedC.C）连续培养（Continuousculture）加入培养基排29开放式和封闭式区别封闭式中：排出液中的细胞用机械方法收集后，又放入原培养基，所以其培养细胞数目不断增加；开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培养细胞随同培养液一起流出，培养细胞数目保持恒定；通过调节流入和流出的速度，使培养物的生长速度永远保持接近最高值的恒定水平上。连续培养（Continuousculture）开放式和封闭式区别封闭式中：排出液中的细胞用机械方法收集后，30植物细胞悬浮培养反应器

植物细胞培养用的反应器主要有机械式搅拌生物反应器、鼓泡塔与气升式生物反应器、填充床式生物反应器、流化床生物反应器和膜式生物反应器等。1）机械式搅拌生物反应器2）鼓泡塔与气升式生物反应器悬浮培养植物细胞悬浮培养反应器植物细胞培养用的反31植物细胞培养课件32

如图（a）是填充床生物反应器。在填充床生物反应器中，细胞可以位于支撑物表面，也可以包埋于支撑物之中，培养液可以流经支撑物颗粒，不断被细胞所利用。填充床生物反应器已被用于植物细胞的培养。（a）（b）出口出口进口进口填充床生物反应器流化床生物反应器3）填充床生物反应器悬浮培养如图（a）是填充床生物反应器。在填充床生物反334）流化床生物反应器

典型的流化床生物反应器是利用流体的能量来悬浮颗粒的。如图（b）是流化床细胞反应器。由于使颗粒呈流化状态所需的能量与颗粒大小成正比，因此，通常采用小固定化颗粒，这些小颗粒良好的传质特性是流化床反应器的主要优点。流化床生物反应器的最大缺点是剪切和颗粒碰撞会损坏固定化细胞。悬浮培养（a）（b）出口出口进口进口填充床生物反应器流化床生物反应器4）流化床生物反应器典型的流化床生物反应器是利345）膜生物反应器细胞细胞营养物入口营养物入口营养物出口营养物出口营养物质

固定化细胞膜反应器a-中空纤维反应器b-螺线式卷绕反应器悬浮培养5）膜生物反应器细胞细胞营养物入口营养物入口营养物出口营养35

由于固定化植物细胞培养比自由悬浮细胞培养具有较高的机械稳定性、产率，更长的稳定（生产期）等许多优点，因此，通常采用固定化来进行植物细胞的培养。这类培养包括了植物细胞和原生质体的固定化培养。

细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在它的表面。其前提就是通过悬浮培养获得足够数量的细胞。固定化培养由于固定化植物细胞培养比自由悬浮细胞培养具有较36

针对上述细胞悬浮培养的缺点，Brodelius等（1979）首次报道了用海藻酸钙成功固定培养橘叶鸡眼藤、长春花、希腊毛地黄细胞。实验证明，细胞分化和次生物质积累之间存在正相关性。细胞固定化后的密集而缓慢的生长有利细胞的分化和组织化，从而有利于次生物质的合成。此外，细胞固定化后不仅便于对环境因子的参数进行调控，而且有利于在细胞团间形成各种化学物质和物理因素的梯度，这可能是调控高产次生物质的关键。海藻细胞的固定化为什么说植物细胞固定化培养更有利于次生生物的生成？问题固定化培养针对上述细胞悬浮培养的缺点，Brodeli37大量培养植物细胞一定浓度的海藻酸钠溶液

以下简要介绍海藻酸钙固定植物细胞的技术路线：混合倒入塑料注射器慢慢滴入含氯化钙的培养基海藻酸钙固定的细胞团固定化培养大量培养植物细胞一定浓度的海藻酸钠溶液以下简要介绍海藻酸钙38大规模植物细胞固定化装置含CaCl2的培养基盖子空气出口海藻酸钠+细胞悬浮液喷嘴无菌空气入口大规模植物细胞固定化装置含CaCl2的培养基盖子空气出口海藻39作业题比较动物细胞培养和植物细胞培养的不同？作业题比较动物细胞培养和植物细胞培养的不同？409植物细胞培养9植物细胞培养419.1植物细胞培养概念植物细胞培养是在离体的条件下培养植物细胞的方法。它是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。

9.1植物细胞培养概念植物细胞培养是在离体的条件下培养植物42植物组织培养探索阶段（1902-1929年）Haberlandt：观点：首次进行离体细胞培养高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞9.2植物细胞培养发展史植物组织培养探索阶段（1902-1929年）Haberlan431、1939年，Gautheret和Nobercourt分别成功培养了烟草、萝卜等形成层组织。2、50年代，Taleche和Nickelll成功悬浮培养了植物细胞，

Routier和Nickell提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想并申请了专利。3、Reinhard等（1968）首先将这种设想转变成现实，生产出了哈尔碱(harmine)。4、Kaul等（1969）、Furrya等(1972)和Teuscher等（1973）分别培养植物细胞获取了其中的薯蓣(山药）皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin）。9.2植物细胞培养发展史1、1939年，Gautheret和Nobercourt分别44概论早在1956年，Routier和Nickelll就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。植物中含有数量极为可观的次代谢物质据保守的估计，目前已发现的植物天然代谢物已超过2万种，而且还在以每年新发现1600种的速度递增目前仍约25%的法定药品来自植物9.3植物细胞培养的应用概论早在1956年，Routier和Nickelll就提45

目前，植物细胞培养技术已在农业、医药、食品、化妆品、香料等领域广泛用于大规模生产有价值的产品。小规模的细胞培养通常在培养瓶中完成，而大规模的培养可在发酵罐中进行。问题请列举出3至5种由培养植物细胞获得的有经济价值的产物。紫草宁抗肿瘤药物紫杉醇薯蓣皂苷和人参皂角苷9.3植物细胞培养的应用实例目前，植物细胞培养技术已在农业、医药、食品、化妆469.3植物细胞培养的应用领域（1）有用代谢物质的生产；（2）名贵植物和名贵花卉等种苗的快速繁殖；（3）进行植物细胞遗传、生理、生化和病毒等方面的研究9.3植物细胞培养的应用领域（1）有用代谢物质的生产；47现在一些发达国家已集中相当数量的人力、财力潜心开拓这个经济潜力十分巨大的生产领域。目前世界最大批量工业化培养细胞（烟草细胞）已达2万升（20吨）。我国在“八五”、“九五”和“863计划”中连续拨款资助工业化培养红豆杉细胞生产抗肿瘤药物紫杉醇的研究，目前已达到60mg/L的世界先进水平。近几年来，我国植物提取物产量以每年20%的速度递增，出口看好。估计2007年，我国植物提取物总出口金额达6亿多美元。9.3植物细胞培养的应用现状现在一些发达国家已集中相当数量的人力、财力潜心开拓这个经济潜489.4植物细胞培养特性植物细胞培养的优点：1、可控制A、对细胞的物理和化学环境、遗传环境进行调节控制，使之不受外界环境（气候、季节和地域）影响；B、选择性生产所需的代谢产物2、效率高

A

、生长速率快，生产效率高9.4植物细胞培养特性植物细胞培养的优点：49植物细胞培养的最大优点是：

植物细胞可以在简单的合成培养基上正常生长。用于植物细胞培养的基础培养基成分基本上与整个植物的要求一样，但是用于培养细胞、组织和器官的培养基需要满足各自的特殊要求。根据特定的植物种类和培养系统，培养基的基本营养成分可作适当的调整。9.4植物细胞培养特性植物细胞培养的最大优点是：9.4植物细胞培养特性50与微生物培养相比植物细胞培养的缺点：1、效率低

A、培养周期较长、生长缓慢、生产率低；2、培养困难

A、所需有效成分含量不高；

B、大量培养时，往往不耐剪切、接种量大及放大后产量下降等一系列问题。9.4植物细胞培养特性与微生物培养相比植物细胞培养的缺点：9.4植物细胞培养特性51

植物细胞培养基通常包括无机盐、碳源、维生素、植物生长激素和有机添加物等

无机盐类

：无机盐浓度一般25mmol左右

微量元素主要包括碘、硼、锰、锌、钼、铜、钴、铁等

碳源和能源：蔗糖是最常用的碳源

维生素：植物细胞的生长都需要硫胺素。可在植物细胞培养基中加入烟酸、吡哆醇、泛酸、生物素和叶酸等。原生质体培养通常需要大多数必需维生素。1、植物细胞培养基的组成9.5植物细胞培养基植物细胞培养基通常包括无机盐、碳源、维生素、52

植物生长激素

植物生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落酸等四大类。

有机氮源

：蛋白质水解物、谷氨酰胺或氨基酸混合物等。

有机酸：加入丙酮酸，或者柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等三羟酸循环的中间产物

复合物质：在植物细胞的培养过程中，酶母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁等复合物质通常可以作为细胞的生长剂。9.5植物细胞培养基植物生长激素植物生长素、细胞激动素、532、植物细胞培养基的制备

制备培养基时，培养基中使用无机盐、碳源、维生素、有机酸和植物生物激素都应该采用最高纯度级的试剂和药品。有些生长激素在使用前需要进行重结晶提纯。由于一些生长激素难溶于水，配制时可先溶于2-5ml的酒精中，其酒精-水溶液要用吸附法进行脱色处理，然后慢慢加入蒸馏水，稍微加热后，再稀释至所需体积。植物细胞培养基的制备是非常严格的9.5植物细胞培养基2、植物细胞培养基的制备制备培养基时，培养54获得单细胞的方法悬浮培养固定化培养细胞培养内容包括两方面悬浮培养单细胞培养促进细胞生长和生物合成促进细胞生长和形成完整植株9.6植物细胞培养细胞培养内容包括两方面悬浮培养促进细胞生长和生物合成9.655由完整的植物器官分离单细胞叶片是分离单细胞的最好材料机械法、酶解法由培养组织中分离单细胞9.6植物细胞培养单细胞的分离：由完整的植物器官分离单细胞9.6植物细胞培养单细胞的分离：56撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞单细胞的分离撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞单细胞的分离57第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心单细胞的分离第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心单细胞581-2、酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞加果胶酶过滤、离心单细胞的分离1-2、酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶591-3、机械法和酶解法比较机械法酶解法细胞不受到酶的伤害不用质壁分离细胞产量低细胞易破细胞受到酶的伤害要质壁分离细胞产量高细胞不易破单细胞的分离1-3、机械法和酶解法比较机械法酶解法细胞不受到酶的伤害细602、由培养组织分离单细胞茎段步骤：1诱导产生愈伤组织；2愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；单细胞的分离2、由培养组织分离单细胞茎段步骤：1诱导产生愈伤组织；单细61步骤：摇床用于振荡继代悬浮3（Suspensionculture)将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。单细胞的分离步骤：摇床用于振荡继代悬浮3（Suspensioncult62悬浮培养Suspensionculture特点细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。必须指出悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。悬浮培养Suspensionculture特点细胞可以不断631、起始悬浮液的制备愈伤组织液体培养基摇床振荡悬浮培养质地疏松，细胞分散程度大；质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养转速30-150rpm防细胞破裂悬浮培养1、起始悬浮液的制备愈伤组织液体培养基摇床振荡悬浮培养质地疏64悬浮培养悬浮培养652、悬浮培养的基本形式分批培养（Batchculture）连续培养（Continuousculture）悬浮培养2、悬浮培养的基本形式分批培养（Batchculture）66继代分批培养分批培养继代分批培养分批培养67滞后期对数生长期直线生长期缓慢期静止期培养时间培养细胞数目1234512345分批培养生长曲线滞后期对数生长期直线生长期缓慢期静止期培养时间培养细胞数目168连续培养（Continuousculture）加入培养基排出培养基及其培养物

二者体积相等分：开放式连续培养（OpenC.C）封闭式连续培养（ClosedC.C）连续培养（Continuousculture）加入培养基排69开放式和封闭式区别封闭式中：排出液中的细胞用机械方法收集后，又放入原培养基，所以其培养细胞数目不断增加；开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培养细胞随同培养液一起流出，培养细胞数目保持恒定；通过调节流入和流出的速度，使培养物的生长速度永远保持接近最高值的恒定水平上。连续培养（Continuousculture）开放式和封闭式区别封闭式中：排出液中的细胞用机械方法收集后，70植物细胞悬浮培养反应器

植物细胞培养用的反应器主要有机械式搅拌生物反应器、鼓泡塔与气升式生物反应器、填充床式生物反应器、流化床生物反应器和膜式生物反应器等。1）机械式搅拌生物反应器2）鼓泡塔与气升式生物反应器悬浮培养植物细胞悬浮培养反应器植物细胞培养用的反71植物细胞培养课件72

如图（a）是填充床生物反应器。在填充床生物反应器中，细胞可以位于支撑物表面，也可以包埋于支撑物之中，培养液可以流经支撑物颗粒，不断被细胞所利用。填充床生物反应器已被用于植物细胞的培养。（a）（b）出口出口进口进口填充床