上-p蛋白质理化性质

蛋白质-酶1蛋白质的理化性质23（一）蛋白质的两性电离（二）蛋白质的胶体性质（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（四）蛋白质的紫外吸收（五）蛋白质的呈色反应蛋白质的等电点（pI）概念：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。pI是蛋白质的特征性常数。pH>pI，带负电荷；pH<pI带正电荷。体内多数蛋白pI为5.0左右，在 体液为pH

7.45环境下，多数蛋

负电荷。利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。4蛋白质在等电点的溶解度最小pH与盐浓度对蛋白质溶解度的共同作用5三、蛋白质的变性、沉淀和凝固变性（denatruation）

概念:在某些理化因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致理化性质的改变和生物活性的丧失。

变性本质：二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变，不涉及一级结构的改变。

变性因素物理因素：加热、加压、超声波、紫外线化学因素：胍、脲、 、强酸强碱、-巯基乙醇、重金属离子、生物碱试剂6蛋白质沉淀(protein

precipitation)

在一定条件下，蛋白疏水侧链在外，肽链融会相互缠绕继而，因而从溶液中析出。这一现象被称为蛋白质沉淀。

变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。蛋白质的凝固作用(protein

coagulation)

蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。这种现象称为蛋白质的凝固作用。7蛋白质的分离纯化8初提盐析精纯化离子交换层析分子筛层析疏水/反相层析亲和层析沉淀等电点沉淀蛋白质分离纯化的具体方法目标：增加制品的纯度或比活，以增加单位蛋白质重量中所需要的蛋白质重量和生物活性。9蛋白质的盐析硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度盐析盐溶10透析（Dialysis）Semi-permeablemembrane,such

asa

cellulose

membranewithpores.Molecules

having

dimensionssignificantly

greater

than

thepore

diameter

are

retainedinside

the

dialysis

bag,whereas

smaller

moleculesand

ions

traverse

the

pores

ofsuch

a

membrane

and

emergein

the

dialysate

outside

thebag.11蛋白质分离纯化中常用的层析分子筛层析离子交换层析亲和层析物理吸附层析疏水/反相层析利用分子量差异利用电荷差异利用特异性亲和利用非特异性吸附利用亲疏性差异12分子筛层析的工作原理13离子交换层析原理14亲和层析15ChromatoHgigrhappreshsuyre

limitsdiffusion

andincreasesinteractions

withchromatography

mediaHPLC

gives

very

highresolution

of

proteincomponents高效液相色谱/HPLC-HighPressure

Liquid16蛋白质分子量的确定方法超离心法:M=RTs/[(1-υρ)D]凝胶过滤:v=k+

clogMSDS－PAGE法:d=k

+clogM光散射法:

M=τ/Hc渗透压法:

M=cRT/Π质谱法：TOF

mass/charge17蛋白质的电泳18几种常用的电泳SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）等电聚焦电泳双向电泳19聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）A

molecule

with

a

net

charge

will

move

inan

electric

field.This

phenomenon,

termed

electrophoresis.Molecules

are

separatedby

size

in

an

electric

field.

Smallermoleculesmigrate

more

rapidly

through

porous

gel

matrix20Polyacrylamide

is

auseful

polymer

for

gelelectrophoresis

becauseboth

the

concentrationand

cross-linking

of

thegel

can

be

controlled.Pore

size

is

directly

controlledby

acrylamide

concentrantion.丙烯酰胺多聚化21基本原理22阴离子去污剂SDS

破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS

复合物。结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度恒定，而

长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比。这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小分开。分类23PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类.连续系统电泳体系中,缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kD）1512～431016～687.536～945.057～212双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为1：29。SDS-PAGE分离范围24标准蛋白分子量在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系。25SDS-PAGE的优点26设备简单快速分辨率和灵敏度高特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定和分子量的测定SDS-PAGE的缺点27因此，对于这一类的蛋白质，SDS-PAGE只能测定多聚蛋白的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整蛋白质的分子量。还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质，含有较大辅基的糖蛋白和含有二硫键较多的蛋白质，以及一些结构蛋白等，它们在SDS-凝胶系统中，电泳的迁移率与分子量的对数不呈线性关系。等电聚焦Isoelectric

Focusing28Isoelectric

focusing

+

SDS-PAGE

two

dimensional

gels29Western

blotting

with

antibodies

todetect

specific

proteins30Polyclonal

and

monoclonal

antibodies31多克隆抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。单克隆抗体——仅由一种类型的细胞制造出来的抗体。酶Enzyme32生物催化剂(biocatalyst)33酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质。核酶(ribozyme)：具有高效、特异催化作用的核酸，主要参与RNA的剪接。酶的分子结构与功能The

MolecularStructureand

Function

ofEnzyme34酶的不同形式35单体酶(monomeric

enzyme)寡聚酶(oligomeric

enzyme)多酶体系(multienzyme

system)多功能酶(multifunctional

enzyme)或串联酶(tandem

enzyme)一、酶的分子组成辅助因子(cofactor)决定反应的种类与性质36全酶(holoenzyme)单纯酶

(simple

enzyme)结合酶

(conjugated

enzyme)酶蛋白(apoenzyme)决定反应的特异性金属离子（Zn2+，Mg2+等）辅助因子(cofactor)小分子有机化合物金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。金属激活酶(metal-activated

enzyme)金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。37辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度分为辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。辅基

(prosthetic

group):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。38cofactor酶的结构概念全酶(holoenzyme)||酶蛋白（apoenzyme)+辅助因子（cofactor)金属离子(也可归入辅基)辅基，prosthetic辅酶，coenzyme(结合力强)table8-1table8-239二、酶的活性中心40酶的活性中心(active

center)或称活性部位(active

site)，指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。必需基团(essential

group)酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基团。活性中心内的必需基团结合基团(binding group)

—

与底物相结合催化基团(catalytic group)

—催化底物转变成产物活性中心外的必需基团—维持酶活性中心应有的空间构象所必需构成酶活性中心的常见基团：His的咪唑基、Ser的－OH、Cys的－SH、Glu的γ-COOH酶的活性中心41酶 名与分类The

Naming

andClassification

of

Enzyme42酶

名命名法——

名称Enzyme

NamesS

+

type

of

reaction

+

‘ase’For

example:

Lactate

dehydrogenase,ATP

synthaseHowever,

there

are

numerousexceptions系统命名法——系统名称43EC号的第一个数字oxidoredutransferasehydrolaseLyase/synthaseisomerasee

氧化还原酶类转移酶类水解酶类裂合酶类异构酶类6.

ligase/synthetase

连接酶类乳酸脱氢酶

lactate

dehydrogenase,

1.1.1.27酶的分类（根据其催化的反应）44酶的分离纯化45Can

be

used

to

compare

differentmethodologies

for

purification

ofthe

same

proteinCan

be

used

to

standardize

thepurification

of

proteins

in

differentlaboratories46Protein

Purification

Schemes比活（specific

activity）：酶单位数/mg蛋白质酶的分离纯化过程中一定要随时追踪酶的活性47酶促反应的特点与机理The

Characteristic

andMechanism

of

Enzyme-Catalyzed

Reaction48在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。酶与一般催化剂的共同点49（一）酶促反应具有极高的效率酶的催化效率通常比非催化反应高108～1020倍，比一般催化剂高107～1013倍。酶促反应的特点一：高效50carbonic

anhydrase碳酸酐酶51molecules

of

CO2

per

second

per

enzyme

moleculetimes

faster

that1

moleculeper

10seconds酶加速反应的机理是降低反应的活化能(activation

energy)。活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。酶为什么能催化生化反应52酶促反应改变反应速率而不是反应平衡Enzymes

Alter

Only

the

Reaction

RateandNot

the

Reaction

EquilibriumEnzymes

Accelerate

Reactions

byFacilitating

the

Formation

of

theTransition

State

to

lower

the

free-energy

of

theactivationEnzyme

specificity

binds

transitionstate.E

+

S

ES E

+

P53（二）酶促反应具有高度的特异性酶的特异性(specificity)：一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种选择性称为酶的特异性或专一性。绝对特异性(absolute

specificity)相对特异性(relative

specificity)结构特异性(stereo

specificity)酶促反应的特点二：特异54（三）酶促反应的可调节性对酶生成与降解量的调节酶催化效力的调节通过改变底物浓度对酶进行调节等酶促反应的特点（续）55酶促反应的机理（一）酶-底物复合物的形成与诱导契合假说*诱导契合假说(induced-fit

hypothesis)酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。E+

S酶底物复合物ES E+

P56锁－钥学说lock

and

KeyModel诱导契合假说Induced

Fit

Model57酶促反应的机理（续）58（二）酶促反应的催化机制酸-碱催化（质子转移）共价催化金属离子催化离子相互作用弱键相互作用可逆氧化态变化介导氧化还原反应酶促反应动力学Kinetics

ofEnzyme-Catalyzed

Reaction5960酶促反应动力学研究各种因素对酶促反应速度的影响。影响因素包括有酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。单底物、单产物反应酶促反应速度用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度最简单的酶促反应61酶催化的反应中各成份的变化S

+EESE

+

PS:

substanceP:productE:

enzyme发生在很短的时间内62一、底物浓度对反应速度的影响10.80.60.40.200Rate

(v)olar

per

sec200

400

600

800

1000

1200[Substrate]

micromolar

63Rate

versus

[substrate]酶反应的速度不停在变)64酶反应的初速度与底物浓度之间的关系实验上只有初速度的测定才有意义65方程Michaelis-MentenequationMichaelis

equation66Ｖ1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称

方程式(Michaelisequation)。Vmax[S]Km

+

[S]＝67假设

E+S

ES

的平衡迅速建立反应初速由最高速度与底物浓度决定v

= Vmax

f(S)v

=Michaelis-Menten方程(1913年)v

= Vmax/(1

+

C/[S])或

Vmax

[S]

C

+

[S]根据实验数据推导68方程式的推导E

+

SESE

+

PBriggs

&

Haldane与1925年重新推导

方程式推导基于两个假设：①反应刚刚开始，产物的生成量极少，逆反应可不予考虑。②［S］超过［E］，［S］的变化可忽略不计。k1

k2k-169Michaelis-Menten方程推导(1925年)Rate

of

reaction:v

k

2[ES]Equation

(1)During

the

steady-state,

[ES]

is

constanti.e.

the

rate

of

formation

=

rate

of

breakdownk

1[E

][S]

k

1[ES

]

k

2[ES

]Therefore:[ES

]

k

1[E

][S]k

1

k

2E

+

SESE

+

Pk1k-1k270[ES

]

k

1[E

][S]k

1

k

2KM

k

1

k

2k

1[ES

]

[E

][S]KmEquation

(2)If

we

introduce

a

constant

KMdefined

asThis

equation

esThe

total

concentration

of

enzyme

introduced

at

the

start

of

the

reaction

isstill

present,

it

is

either

bound

to

substrate

or

it

is

not,

i.e.[E0]=

[E]

+

[ES]Or

rearranged:[E]

=[E0]

-

[ES]Substituting

this

into

Equation

(2)

gives

us:[ES

]

([E

0

][ES

]Km71Opening

the

bracket

on

the

right-hand

side

gives:[ES]

=[E0][S]

-

[ES][S]KM[ES]

=([E0]

-

[ES])[S]KMTherefore:KM

[ES]

=

[E0][S]

-

[ES][S]KM

[ES]

+

[S][ES]

=

[E0][S](KM

+

[S])[ES]

=

[E0][S]Collect

[ES]:Therefore:[ES]

=[E0][S][S]

+

KM72[ES]

=[S]

+

KMSubstituting

this

back

into

equation

(1):v

k

2[ES]The um

rate

for

the

enzyme

(Vmax)

will

be

achieved

when

all

of

theEnzyme

is

saturated

with

substrate,

i.e.

[ES]

=

[E0]Putting

this

again

into

equation

(1)

we

get:Vmax

=

k2

[E0]Notice

that

the

term

k2[E0]

features

in

equation

(3),

which

can

now

be

writtenGives

us:v

=

k2[E0][S][S]

+

KMEquation

(3)Michaelis-Mentenequationv

=Vmax

[S]KM

+

[S]73当v=Vmax/2时Km＝[S]at

Vmax/21.Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。Vmax2＝Vmax[S]Km

+[S]VVmax[S]KmVmax/2常数KM的意义74KM

is

the

concentration

of

substrate

atwhich

half

the

active

sites

are

filled.

Sothe

fraction

of

sites

filled

fES

at

anysubstrate

concentration

can

becalculated

from常数KM的意义（续）Vmax[S]Km+

[S]Vf

＝

＝ES75常数KM的意义（续）当k-1

>>k2时，此时酶和底物的分离远比产生酶和产物的速度快得多；KM

≈KES

=k-1/k1=[E][S]/[ES]即当k-1

>>k2时，KM

等于ES复合物的解离常数;在这个条件下：KM高，结合弱；KM低，结合强。KM是酶的特征性常数之一Km

=2.KM可近似表示酶对底物的亲和力；k

-1

+

k

2k

176常数KM的意义（续）Km值越小,底物与酶的亲和力越强,反应越迅速7778定义：Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。意义：Vmax=k2

[E0]如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶的转换数(turnovernumber)，即动力学常数k2。Vmax的意义79kcat和specificity

constant80kcat:当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。也叫turnover

number转换数kcat/Km:专一性常数,用来比较不同酶作用于同一底物,或同一种作用于不同底物的催化效率;数值接近109为佳。酶的转换数Turnover

number(kcat)E

+

SESE

+

P意义：可用来比较每单位酶的催化能力。The

Kcat

is

a

direct

measure

of

the

conversion

of

substrate

toproduct

under

optimum

conditions,

i.e.

saturated

enzyme.The

number

of

substrate

molecules

turned

over

per

enzymemolecule

per

second,

hence

“turnover

number”.The

overall

rate

of

a

reaction

is

limited

by

its

slowest

step.

Hence,the

Kcat

will

be

equal

to

the

rate

constant

for

the

slowest

step.In

the

case

of

the

Michaelis-Menten

systemthis

will

be

k2k1

k2k-18182specificity

constant:

kcat/KM83The

ratio

kcat/KM

is

a

convenientmeasure

of

enzyme

efficiencyA

‘good’

enzyme

has

a

high

kcat/KMratioThis

could

result

from:Large

kcatSmall

KM同一个酶对不同的底物可以有不同的

常数胰凝乳蛋白酶84同一个酶对不同的底物可以有不同的

常数胰凝乳蛋白酶85方程作图86v

=Vmax

[S]KM

+

[S]=1v1[S]1Vmax+KMVmax.Taking

the

reciprocal

of

both

sides

can

giveThis

is

in

t eralformy

=m

x

+ci.e.

a

plot

of

1/v

against

1/[S]

will

give

straight

lineThis

is

aLineweaver-Burk

plot87Lineweaver-Burk

plot(双倒数作图)1/v

=

Km/Vmax

*1/[S]

+

1/Vmax1/[S]-1/KM1/V88maxslope

=KM/VmaxLineweaver-Burk

plot1/VEadie-HofsteeplotHanesplot请从方程推导89Cornish-BowdenplotDixon

plot90双底物的 方程91三聚物模式(ternary

complex) 乒乓式( -pong)两种不同模式的双底物反应92双底物反应的 方程当P1,P2

=0时太复杂了！ Forget

it!93二、酶浓度对反应速度的影响当[S]＞＞[E]，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V

=

K2

[E]0V94[E]双重影响最适温度(optimumtemperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。低温的应用三、温度对反应速度的影响酶2.0活性1.5950.51.00

10 20

30

40

50

60温度ºC四、pH对反应速度的影响最适pH096酶活(optimum

pH)：性酶催化活性最大

时的环境pH。pH胃蛋白酶淀粉酶胆碱酯酶246810五、抑制剂对反应速度的影响97酶的抑制剂(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的抑制剂。区别于酶的变性抑制剂对酶有一定选择性，而变性的因素对酶没有选择性抑制作用的类型98不可逆性抑制

(irreversible

inhibition)可逆性抑制(reversible

inhibition)：竞争性抑制

(competitive

inhibition)非竞争性抑制

( petitive

inhibition)反竞争性抑制

( petitive

inhibition)不可逆性抑制作用99概念抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活，不能用透析、超滤等方法予以除去。举例有机磷化合物

羟基酶解毒------解磷定(PAM)重金属离子及砷化合物

巯基酶解毒------二巯基丙醇(BAL)有机磷化合物对羟基酶的抑制+

E-OH100PRO

XROPO-ER’O

O有机磷化合物R’O

O磷酰化酶+

HXE-OHOR’ORCHNOH+OPCHNONCH3解磷定NCH3+羟基酶酸重金属离子及砷化合物毒性路易士气失活的酶巯基酶失活的酶酸BAL二巯基丙醇巯基酶BAL与砷剂结合物101H

As

C

CHClESSH2C

OHH2C

SH+

HC

SHESHSH+H2C

OHH2C

SHC

SH

As

C

CHClESHSHClCl+H

H

SSAs

C

CHCl

E

As

C

CHCl

+

2HCl可逆性抑制作用概念：抑制剂以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。类型：竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制1021.

竞争性抑制作用抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。103竞争性抑制104I与S结构类似，竞争酶的活性中心；抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及［S］；动力学特点：Vmax不变，表观

Km↑。竞争性抑制的特点抑制剂↑无抑制剂1/[S]Vmax[S]KiV

Km

(1

[I]

)[S]Ki

[S]KmV1/v(1

[I]

)

111

VmaxVmax105琥珀酸琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸COOHCH2CH2COOH琥珀酸COOHCH2COOH丙二酸举例1：丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制106举例2：磺胺药对细菌二氢叶酸

酶的抑制Glu+H2NCOOHP

A

B

AFH2FH4H2NSO2NHRFH2

酶+二氢蝶呤氨甲蝶呤磺胺药FH2还原酶1072.

非竞争性抑制108抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系。非竞争性抑制109非竞争性抑制的特点抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合；抑制程度取决于［I］；动力学特点：Vmax↓，表观Km不变。抑制剂↑1/v1/[S]无抑制剂Km110(1

[I]

)

11Ki

[S]Ki1

VVmaxVmax (1

[I]

)3.

反竞争性抑制111抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合，使ES的量下降。反竞争性抑制112抑制剂只与ES结合；抑制程度取决与［I］及［S］；动力学特点：Vmax↓，表观Km↓。反竞争性抑制的特点抑制剂↑1/V1/[S]无抑制剂•113各种可逆性抑制作用的比较作用特征114竞争性 非竞争性

反竞争性抑制E抑制E、ES抑制ES与I结合的组分表观KmVmax增大不变不变降低减小降低不同类型抑制作用的

方程115

I

116竞争性抑制反竞争性抑制非竞争性抑制六、激活剂对反应速度的影响117激活剂(activator)使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。必需激活剂(essential

activator)非必需激活剂(non-essential

activator)七、酶活性测定和酶活性单位118酶的活性单位：在规定条件下，酶促反应在单位时间（s、min或h）内生成一定量（mg、g、mol等）的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量。酶活性单位119国际单位(IU)在特定的条件下，每分钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位催量单位(katal)１催量(kat)是指在特定条件下，每秒钟使

１mol底物转化为产物所需的酶量kat与IU的换算：

1

IU=16.67×10-9kat酶的调节The

Regulation

ofEnzyme120细胞内酶活性的调控1根据外界环境的变化，细胞可以增强或减弱酶的生产（即酶相关

的转录和翻译）。这属于一种

调控，被称为酶的诱导和抑制。例如，当环境中出现如青霉素这样的抗生素时，部分细菌可以对抗生素产生抗性，其原因就在于细菌体内的β-半乳糖苷酶被诱导而大量生产，这种酶可以水解青霉素分子上关键的β-乳胺环。另一个例子是在

肝脏中存在一类酶对于药物代谢非常重要的酶，细胞色素P450氧化酶；对这一类酶的诱导或抑制，会导致药物相互作用。121细胞内酶活性的调控2通过在不同的细胞组分中进行不同的代谢途径，酶可以被分隔。例如，脂肪酸的是由细胞溶质、内质网和高尔基体中的一系列酶所完成，而脂肪酸的降解（以提供能量）是粒体中由另一系列酶通过β-氧化来完成。122细胞内酶活性的调控3酶可以被抑制剂与激活剂所调控。例如，一个代谢途径中的终产物常常是这一途径中第一个酶的抑制剂，从而调控这一代谢途径的产物量。这种调控机制被称为负反馈机制，因为终产物的量是受其自身浓度调控。负反馈机制可以根据细胞的需要，有效地调节中间代谢物的速率，从而使细胞的能量和物质的分配更为高效，并防止多余产物的。控制酶的作用，可以在生物体内维持一个稳定的 环境（即体内平衡）。123细胞内酶活性的调控4翻译后修饰也可以调控酶的活性。如磷酸化、肉豆蔻酸化和糖基化。例如，细胞接受胰岛素信号后，对包括糖原酶在内的多个酶进行磷酸化，帮助控制糖原的合成或降解，使得细胞可以对血糖的变化产生反应。另一个翻译后修饰的例子是多肽链的剪切。胰凝乳蛋白酶，胰脏中产生无活性的胰凝乳蛋白酶原，到达胃后被激活。124细胞内酶活性的调控5还有一些酶可以通过定位到不同环境后而被激活，比如从还原态的环境（细胞质）到氧化态环境（细胞周质空间），从高pH环境到低pH环境等。流感的红血球凝集素蛋白就是一个例子：当它接触到宿主细胞囊泡的酸性环境时，它的构象立刻发生变化，导致其获得激活。125调节对象

关键酶调节方式酶活性的调节（快速调节）酶含量的调节（缓慢调节）酶的调节126关键酶127一般位于代谢途径的起始或分支处；催化单向不可逆反应；活性较低，活性最低者又称为限速酶；是可调节酶。调节对象

关键酶调节方式酶活性的调节（快速调节）酶含量的调节（缓慢调节）酶的调节128一、酶活性的调节（一）酶原与酶原的激活（二）变构酶(Allosteric

enzymes)（三）酶的共价修饰调节129（一）酶原与酶原的激活酶原(zymogen)有些酶在细胞内

或初时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。酶原的激活在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。130酶原在特定条件下一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽分子构象发生改变形成或 出酶的活性中心酶原激活的机理131132避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。有的酶原可以视为酶的形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。酶原激活的生理意义133变构调节

(allosteric

regulation)一些代谢物可与某些酶分子活性中心以外的部位可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称变构调节。变构酶

(allosteric

enzyme)变构部位(allosteric

site)变构效应剂(allosteric

effector)变构激活剂变构抑制剂（二）变构酶134变构酶的特点①通常具有四级结构，存在协同效应；②含有催化亚基和调节亚基(或催化部位和调节部位)。③[S]-v关系曲线为S形。cAMPRCC非活性型活性型CCRRR135[S]变构激活无变构效应剂变构抑制V变构酶的S形曲线136协同效应137Sequential

&

concerted

models138变构效应剂(allosteric

effector)变构抑制剂(Allostericinhibitor)变构激活剂(Allostericactivator)139（三）酶的共价修饰调节140共价修饰(covalent

modification)在其他酶的催化下，酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，此过程称为共价修饰。常见类型

磷酸化与脱磷酸化（最常见）

乙酰化和脱乙酰化

甲基化和脱甲基化

腺苷化和脱腺苷化

－SH与－S－S互变酶蛋白SerThrTyrOH酶蛋白SerThrTyrO

PATPADPPiH2O蛋白激酶蛋白磷酸酶酶的磷酸化与脱磷酸化141共价修饰调节的特点142受共价修饰的酶存在有（高）活性和无（低）活性两种形式；具有瀑布效应（级联效应）；是体内经济、有效的快速调节方式。瀑布效应143二、酶含量的调节（一）酶蛋白 的诱导和阻遏诱导作用(induction)阻遏作用(repression)（二）酶降解的调控144三、同工酶145同工酶(isoenzyme)是指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。乳酸脱氢酶(LDH1～

LDH5)1461

2酶活性心肌梗死酶谱正常酶谱肝病酶谱34

5心肌梗死和肝病LDH同工酶谱的变化147148酶与疾病Cardiovascular

diseasesHemophilia

A/BAlzheimer

diseaseCancer

metastasisArthritis心血管疾病血友病老年痴呆癌细胞转移关节炎Parasite

disease:malaria/T

cruzainInfluenza

A

&

AIDS

甲型流感与疟疾病149150酶的应用日常生活中的应用151应用所用酶用途烹饪业真菌（一般为酵母）α-淀粉酶（在烘烤过程中可以被破坏）产生催化面粉中的淀粉分解为蔗糖。在这一过程中，酵母会一氧化碳。可用于馒头、面包以及其他一些中西式糕点的制作。蛋白酶制作饼干的过程中，通常用它来降低面粉中蛋白质的含量。木瓜蛋白酶将肉嫩化，以利于烹饪。婴儿食品胰蛋白酶经过酶处理的婴儿食品更易于消化。应用所用酶用途酿酒业麦芽中的酶将淀粉和蛋白质降解为糖、氨基酸和肽段，而这些原料可以被酵母发酵产生

。工业生产的麦酶广泛用于替代天然酶进行啤酒酿造淀粉酶、葡聚糖酶和蛋白酶分解麦芽中的多聚糖链和蛋白质。β-葡聚糖酶和阿拉伯木聚糖酶提高麦汁和啤酒的滤过性。淀粉葡糖苷酶和普鲁兰酶制造低卡路里啤酒和调整发酵能力。蛋白酶除去在啤酒

过程中产生的絮状物。乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）避免丁二酮的产生。果汁制造业纤维素酶、果胶酶降解果汁中的不溶物。152应用所用酶用途乳品业凝乳酶，提自反刍动物（牛、羊）幼崽的胃。制造乳酪，水解蛋白质。用微生物生产的凝乳酶越来越多地使用于乳品制造业。脂酶洛克福羊乳酪的制作过程中添加，以加快乳酪的成熟。乳糖酶将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖。153154应用所用酶用途造纸业淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶

和木质酶淀粉酶用于降解淀粉至低粘性，加胶和给纸加膜；木聚糖酶能够降低脱色过程所需的漂白剂；纤维素酶使纤维光滑并增强纸的排水性；木质酶可以消除木质素以软化纸质。生物燃料生产纤维素酶用于降解纤维素，产生可用于发酵的蔗糖。木质酶用于木质废品的降解。应用所用酶用途生物去垢剂主要为蛋白酶（产自细菌的膜外部分）用于洗衣过程中的浸泡阶段，帮助除去衣物上的含有蛋白质的污渍。淀粉酶除去洗衣机上的淀粉残余。脂酶帮助除去衣物上的油渍。纤维素酶作为生物纤维（如棉质衣物）的柔顺剂。眼镜清洁剂蛋白酶清除 眼镜上的蛋白质，以防止细菌滋生。橡胶制造业过氧化氢酶催化过氧化物产生氧气，以将胶乳转化为

橡皮。摄影业蛋白酶（无花果蛋白酶）溶解底片上的明胶，使得银成分显现。155蛋白质功能与生物信号1561571、免疫体系中分子间的识别机制2、DNA与蛋白质的相互作用3、蛋白水解酶与疾病4、膜蛋白、受体与信号转导5、酶抑制剂与药物开发6、新技术与新方法1581.免疫体系分子的相互识别受体-配体结合的特异性159Antibody抗体的结构160B

cell产生抗体161Helper

Tcell是免疫体系的关键细胞HIV

的主要细胞162Helper

T

cell是免疫体系的关键细胞163Killer

TCell是的主要战士164APC抗原呈递细胞激活T细胞165抗原呈递细胞上的MHC分子是特异性识别的关键166(Major主要组织相容性复合体patibility

Complex，MHC)早期从组织

移植实验中发现，也是

免疫遗传学的主要内容。已发现，在人群或同种动物不同个体间进行皮肤移植时出现的排斥反应，具有

性、特异性和可转移性等免疫反应的基本特征，故从廿世纪40年代起就确认移植排斥反应是一种典型的免疫现象。引起排斥反应的抗原称移植抗原(transplantationantigen)或组织相容性抗原(

patibilityantigen)。此等抗原存在于细胞表面，无 特异性，不同 间其抗原特异性互不相同，但同卵双生及纯系动物不同

之间，其抗原特异性完全一致。167MHC

I168Ⅰ类抗原分子顶部α1和α2区组成的抗原肽结合区呈沟槽状结构，α1和α2区各含4股β片层和1个α螺旋，呈对称排列而连接成一个沟槽，β片层组成槽底，其两侧由

α螺旋组成。沟槽大小为2.5nm×1.0nm×1.1nm，可容纳8-12个氨基酸残基组成的短肽。沟槽内氨基酸变化大，是Ⅰ类抗原多态性的基础。虽然抗原肽与Ⅰ类分子的结合有一定的选择性，但并不像抗原与抗体那样高度特异地结合，只要被结合的多肽有2-3个关键的氨基酸能恰当地连接到沟槽内的多肽结合基序(bindingmotif)的相应位置上，多肽即可与之结合，并被运送到细胞表面递呈给T细胞。所以每个Ⅰ类抗原分子能与一定广度的多肽谱结合。α链由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区可进一步分为α1、α2和α3三个功能区。跨膜区含疏水性氨基酸，排列成α螺旋脂质双分子层。胞内的氨基酸被磷酰化后有利于细胞外信息向胞内传递。

β2m无同种特异性，与α3功能区连接，其功能为有助于Ⅰ类抗原的表达和稳定性。169MHCI分子的结构容纳抗原的口袋170MHC

II171MHCII，α1和β1区各自盘绕成一个α螺旋和β片层构成沟槽的一个侧壁和半个底面。由于它的末端是开放的，故可容纳较长的多肽(约12-20个氨基酸)。该沟槽与多肽结合的特点基本上与Ⅰ类抗原相似，但被结合的多肽

一般来自外源性抗原经加工处理降解的产物。Ⅱ类抗原是由Ⅱ类 编码的α链(34kD)和β链(29kD)非共价连接的糖蛋白。α链和β链在内质网分别

后，很快与第3条链—γ链(或称Ii链)结αβγ复合体，当复合体到达溶酶体样结构，γ链解离、降解。γ链的存在，使α、β链不能与其他胞内蛋白结合，并协助αβ复合体转运以及与抗原的结合。α链和β链，均由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区各含两个功能区α1、α2和β１、β2172TCR识别抗原1731742.蛋白质与DNA的相互作用Helix-Turn-HelixZinc-fingerLeucine

zipper175非特异性:特异性:HistonesDNA-蛋白质相互作用的化学键1、氢键:具有识别功能蛋白质的螺旋结构常与DNA的大沟相互作用。2、疏水键： 于大沟侧缘的T-CH3基团是疏水性的，可与疏水氨基酸残基侧链相互作用。3、离子键：蛋白质的带电的氨基酸残基的侧链与DNA分子上的带电基团形成离子键。176组蛋白（Histone)组蛋

正电荷，含Arg、Lys，含量恒定，真核细胞中组蛋白共有5种，分为两类：一类是高度保守的

组蛋白（corehistone）包括H2A、H2B、H3、H4四种；另一类是可变的连接组蛋白（linker

histone）即H1。组蛋白的结构是非常保守，特别是H4，牛和豌豆H4的102个氨基酸中仅有2个不同。

组蛋白高度保守的原因可能有两个：其一是

组蛋白中绝大多数氨基酸都与DNA或其它组蛋白相互作用，可置换而不引起致命变异的氨基酸残基很少；其二是在所有的生物中与组蛋白相互作用的DNA磷酸二酯骨架都是一样的。177四种组蛋白通过C端疏水的氨基酸相互结合，N端带正电荷的氨基酸向外伸出，与DNA分子结合，使DNA分子缠绕在组蛋白周围，形成核小体。尾部含有大量Lys和Arg残基，为组蛋白翻译后进行修饰的部位，如乙酰化、甲基化、磷酸化等。H1不仅具有种属特异性，而且还有组织特异性，所以H1是多样性的。178Histones组蛋白构成核小体179180181核小体的结构要点每个核小体单位包括约200

bp的DNA、一个组蛋白 和一个H1。由H2A、H2B、H3、H4各两分子形成八聚体，构成盘状颗粒；

H3、H4形成4聚 于颗粒 ；

H2A、H2B二聚体分别位于两侧。DNA分子以左手螺旋缠绕在 颗粒表面，每圈80

bp，共1.75圈，约146bp，两端被H1锁合，H1结合20bp

DNA.相邻

颗粒之间为一段60

bp的连接线DNA

(linker

DNA)，典型长度60

bp。组蛋白与DNA是非特异性结合，核小体具有自主装性质。182核小体上DNA与组蛋白的接触点183非组蛋白上与特异DNA序列结合的蛋白质，又称序列特异性DNA结

合蛋白（凝胶迟滞电泳实验）。包括多种参与核酸代谢与修饰的酶类、核质蛋白、骨架蛋白、 表达和 结构调节蛋白等。①含有较多的Asp和Glu，酸性蛋白质；②整个细胞周期都进行

，不象组蛋白只在S期 ，并与DNA同步进行；③能识别特异的DNA序列，识别信息存在于DNA本身，位点在大沟部分，识别与结合靠氢键和离子键；④具有多样性和异质性；⑤具有多种功能，如帮助DNA分子折叠，以形成不同的结构域，从而有利于DNA的和的转录，协助启动DNA，控制基因转录，调节表达。184HTH:螺旋-转角-螺旋模式HLH:螺旋-环-螺旋模式Zinc

Finger:锌指模式Leucine

Zipper:亮氨酸拉链式模式序列特异性DNA结合蛋白的不同结构模式185HTH

Motif186蛋白质形成对称的同型二聚体，每个单位由20个氨基酸的小肽组成，两个螺旋相互连接成β转角。羧基端的螺旋负责识别DNA大沟的特异碱基信息，另一个螺旋与磷酸戊糖链骨架接触。最初发现于λ噬菌体的阻遏蛋白中，现发现在很多原核及真核DNA结合蛋白中存在。由两个较短的α螺旋与其间含Gly残基的绞链组成。如大肠杆菌的CAP蛋白含一HTH结构域，HTH通过DNA双螺旋大沟识别、结合反向重复序列TGTG/CACA。HTH的分子识别机制187-repressor的结构188HLH

(Helix-loop-helix)a

protein

structural

motif

thatcharacterizes

a

family

of

transcriptionfactors

;bHLHproteins

typically

bindto

aconsensus

sequence

called

an

E-box,CANNTG.189指状结构约含23个氨基酸残基，锌以4个配价键与4个Cys或2个Cys和2个His相结合。整个蛋白质分子可有2-9个这样的锌指重复单位。每一个单位可以其指部

DNA双螺旋的深沟，接触一定数量和序列的核苷酸。Zinc

finger蛋白结构特征190碱性亮氨酸拉链(bZIP)191可形成蛋白质－蛋白质二聚体的亮氨酸拉链(leucine

zipper，LP)；具有35个氨基酸残基，其中有4个亮氨酸，每7个氨基酸

出现一次，形成α-螺旋时，每两圈伸出一个亮氨酸，由亮氨酸残基间的疏水作用力形成一条拉链，产生蛋白质二聚体；碱性α-螺旋与DNA磷酸残基和碱基互作，二聚体剪刀结构。蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有1个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在螺旋的同一个方向出现。两个相同结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结 二聚体，该二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低。这类蛋白质能够与CAAT框和 增强子结合，其特征就聚体形成域是能形成bZIP二聚体结构。Leucine-zipper的结构特征192pha

helix

with

a

leucine

atevery7th

amino

acidLeucine-zipper的蛋白的剪刀型结合模式193法技术用于测定与特殊蛋白质结合在DNA上的结合位点和相应的核苷酸顺序。如该技术提供了RNA聚合酶与启动子之间相互作用的信息并确定了作用位点（启动子）的核苷酸顺序。法：Foot

Printing194研究蛋白在DNA上的结合位点法：DNA

Footprinting195法原理196利用

法确定RNA聚合酶结合位点的实验1973.蛋白水解酶与 疾病Cardiovascular

diseases

心血管疾病Hemophilia

A/B

血友病Programmed

cell

death

/

appotosisAlzheimer

dise