水质丙烯酰胺的测定高效液相色谱-质谱质谱法

《水质丙烯酰胺的测定固相萃取-高效液相色谱-质谱/质谱法》

编制说明（送审稿）《水质丙烯酰胺的测定高效液相色谱-质谱/质谱法》

标准编制组2012年10月TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"1项目背景 1\o"CurrentDocument"任务来源 1\o"CurrentDocument"工作过程 12标准制订的必要性分析 1\o"CurrentDocument"丙烯酰胺的环境危害 1\o"CurrentDocument"相关环保标准和环保工作的需要 2\o"CurrentDocument"新建标准方法的优势 2\o"CurrentDocument"3国内外相关分析方法实施情况与存在问题 2\o"CurrentDocument"4标准制订的基本原则和技术路线 3\o"CurrentDocument"标准制订的基本原则 3\o"CurrentDocument"标准的适应范围和主要技术内容 3\o"CurrentDocument"标准制订的技术路线 3\o"CurrentDocument"5方法研究报告 5\o"CurrentDocument"方法研究的目的 5\o"CurrentDocument"方法原理 5\o"CurrentDocument"试剂和材料 5\o"CurrentDocument"仪器和设备 6\o"CurrentDocument"样品 6\o"CurrentDocument"分析步骤 7\o"CurrentDocument"结果计算与表述 9\o"CurrentDocument"检出限、精密度和准确度 10\o"CurrentDocument"质量保证和质量控制 12\o"CurrentDocument"6方法验证 12\o"CurrentDocument"方法验证方案 13\o"CurrentDocument"方法验证过程 13\o"CurrentDocument"7标准主要技术内容的解释 13\o"CurrentDocument"8对实施本标准的建议 149质量保证和质量控制 14\o"CurrentDocument"空白 14\o"CurrentDocument"加标 14\o"CurrentDocument"平行样 14\o"CurrentDocument"校准标准点 14\o"CurrentDocument"10参考文献 14《水质丙烯酰胺的测定高效液相色谱-质谱/质谱法》

编制说明.项目背景任务来源《水质丙烯酰胺的测定高效液相色谱-质谱/质谱法》标准的制定工作，是按照陕西省质量技术监督局陕质监标【2011】第6号文《关于下达2011年第一批地方标准修制订计划的通知》规定起草的，由陕西省环境监测中心站负责制定，项目计划编号为25号。工作过程标准制定任务下达后，陕西省环境监测中心站立即成立了标准编制组。编制组在查阅国内外相关文献、标准的基础上，制定实施方案，进行开题论证。按照方案，进行了方法的条件优化实验，确定方法蓝本，然后在实验室内和实验室间进行方法的验证实验，最后，根据验证结果，完成标准（征求意见稿）的编制。2.标准制订的必要性分析丙烯酰胺的环境危害丙烯酰胺，分子式：C3H5NO,分子量为71.08,为白色结晶固体，无气味，熔点：84.5℃，饱和蒸汽压：0.21Kpa（84.5℃）。溶于水、乙醇、乙醚、丙酮等，但不溶于苯。丙烯酰胺是聚丙烯酰胺的单体，聚丙烯酰胺是一种水溶性高分子聚合物，主要应用于水的净化处理方面。据统计，在发达国家水处理应用方面，美国占聚丙烯酰胺总用量的36%、西欧占35%、日本占49%；近年来，聚丙烯酰胺在我国水处理方面应用也越来越广泛，虽然聚丙烯酰胺被认为是无毒的，但其单体的毒性却是被肯定的；丙烯酰胺已被国家癌症中4（IARC）列为W类致癌物，急性毒性实验证明丙烯酰胺有神经毒性、生殖、发育毒性，动物实验证明丙烯酰胺可导致遗传物质的改变和癌症的发生。在饮用水和地表水中，丙烯酰胺主要来源于使用有丙烯酰胺单体残留的聚丙烯酰胺絮凝剂。所以水中丙烯酰胺的分析是环境分析中的一项重要内容。相关环保标准和环保工作的需要由于丙烯酰胺对环境的危害较大，它已被我国列入水中优先控制的污染物。我国的《地表水环境质量标准》（GB3838-2002）规定丙烯酰胺的标准限值为0.0005mg/L。在环境分析中还没有建立相关的国家及地方标准分析方法。因此，建立快速、灵敏的水中丙烯酰胺的监测分析方法，对了解水环境的质量，保护水质环境安全，保障公众饮水安全，对人群健康的影响具有重要的意义。新建标准方法的优势HPLC-MS/MS分析水样中的丙烯酰胺，其优势是：（1）提高了分析效率。由于取样量少，大大缩短了分析时间。（2）定性准确，在不能完全将干扰物质分离的情况下仍可以准确定性定量，扫描方式可以选择多反应监测（MRM）；抗干扰能力非常强。（3）检出限更低，三重四级杆质谱具有非常高的灵敏度，因此，检出限可达0.008口g/L,而GC方法检出限为0.15口g/L（取样量100ml水），HPLC方法检出限为0.1口g/L（取样量300mL）。.国内外相关分析方法实施情况与存在问题关于水中丙烯酰胺的测定，国外多采用气相色谱法、高效液相色谱法等方法进行测定；如美国EPA8032A用气相色谱法，前处理采用澳化衍生-液液萃取。EPA8316采用高效液相色谱法，但其主要检测对象为除水外的其它基质，而且方法检出限高达10口g/L。国内关于水中丙烯酰胺的测定主要是气相色谱法，气相色谱-质谱法。《生活饮用水卫生规范》（中华人民共和国卫生部2001）中，采用澳化衍生■液液萃取-气相色谱法测定饮用水中的丙烯酰胺；中华人民共和国出入境检验检疫行业标准《食品中丙烯酰胺的测定方法同位素内标法》（SN/T2096-2008）中使用气相色谱仪-质谱法。前处理采用石墨化碳黑层析柱净化，净化液中的丙烯酰胺经澳水衍生化后，用同位素标记的内标法，气相色谱-质谱联用仪检测。以上GC和GC-MS测定丙烯酰胺，一般都需要经过繁琐的澳化衍生-液液萃取过程，测定周期长，复杂的前处理过程也造成方法精密度、准确度等性能不稳定；HPLC方法，定性能力差，检出限高。.标准制订的基本原则和技术路线标准制订的基本原则（1）方法检出限和测定范围满足《地表水环境质量标准》（GB3838-2002）等相关环保标准和环保工作的要求。（2）方法准确可靠、满足各项方法特性指标的要求。（3）方法具有普遍适用性，易于推广使用。（4）标准的格式按照《环境监测分析方法标准制修订技术导则》（HJ/T168-2010）、《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》（GB/T1.1-2009）的要求制定。标准的适用范围和主要技术内容（1）本标准规定了测定地表水及饮用水中丙烯酰胺的固相萃取-高效液相色谱-质谱/质谱法的范围、方法原理、试剂和材料、仪器和设备、样品、分析步骤、结果计算、准确度和精密度、质量保证和质量控制。（2）本标准采用高效液相色谱-质谱/质谱法，侧重仪器分析条件的建立以及质量保证和质量控制，同时兼顾便捷、准确的可操作性。标准制订的技术路线本标准的制订是在查阅国内外相关文献的基础上，制定实验方案，进行实验室内的条件优化实验、验证试验后，编制标准的草稿，再通过实验室间的验证试验，完成标准（征求意见稿）的编制。通过在全省进行标准征求意见稿的意见征求、汇总、修订，完成标准送审稿的编制。陕西省质量技术监督局组织专家对标准送审稿进行评审，标准编制组根据评审意见，进行修改完善，最后形成标准报批稿。技术路线图见下图。标准管理部门下达制订计划成立标准编制组标准编制组进行文献调研标准编制组通过初步实验完善和确定实验方案开题论证，确定方法验证技术路线和疑难问题解决途径进行实验室内验证，完善实验方案标准主编单位按要求选择验证实验室，开展实验室间验证工作标准编制组编写标准征求意见稿及编制说明标准编制组对征求的意见进行汇总，形成送审稿及编制说明送审稿经审查合格后，提交报批稿及编制说明报批稿经审查合格后标准管理部门进行批准、编号、发布.方法研究报告方法研究的目的(1)本标准适用于地表水和饮用水中丙烯酰胺的测定。(2)通过本标准的制订，使该监测方法的检出限、精密度、准确度等满足地表水及饮用水等环境质量控制标准中对丙烯酰胺的测定要求。我国的《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)规定丙烯酰胺的标准限值为0.0005mg/L。制订后的标准中，按《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(HJ168-2010)附录A要求测定方法检出限，丙烯酰胺的检出限为0.008Hg/L,以4倍检出限作为测定下限，测定下限为0.032ug/L,测定下限可满足环境质量标准对丙烯酰胺的监测要求。方法原理本方法采用Sep-PakAC2-Plus固相萃取小柱对水样中的痕量丙烯酰胺进行富集，使用甲醇洗脱，洗脱液浓缩至刚干为宜，迅速加1mL超纯水定容，过PTFE一次性滤膜后，目标物经过HPLC分离进入三重四级杆质谱检测器，定性定量分析。试剂和材料除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的HPLC-MS专用试剂和高纯水。甲醇HPLC级。甲酸HPLC-MS专用。0.45um一次性PTFE微孔滤膜水系。固相萃取小柱SampliQC18ODS500mg/6mL固相萃取小柱；Oasis(R)HLB6cc(150mg)固相萃取小柱；Sep-PakAC2-Plus固相萃取小柱。丙烯酰胺标准溶液，P=1000.0mg/L市售有证丙烯酰胺标准溶液，浓度为P=1000.0mg/L,介质为甲醇，在4℃冰箱中保存。丙烯酰胺标准贮备溶液，P=1.0mg/L准确吸取丙烯酰胺标准溶液（5.3.5）100HL于100mL容量瓶中，用纯水稀释至标线，在4℃冰箱中保存。仪器和设备高效液相色谱-质谱/质谱联用仪（三重四极杆质谱）。色谱柱的选用。选用反相ODS柱即十八烷基硅烷化学键合相色谱柱，规格150mm（柱长）义2.1mm（内径），5.0Hm（粒径）。样品样品采集及保存样品应采集在棕色玻璃容器中。采样前用待测水样将样品瓶清洗2〜3次。采样后，水样应充满样品瓶并加盖密封，置于4℃冰箱内避光保存。样品制备关于取样量的选择由于HPLC-MS/MS具有极低的检出限，因此取用10mL水样进行固相萃取等前处理步骤，即满足定性定量要求。固相萃取条件的优化饮用水及地表水中的丙烯酰胺采用直接进样法就能满足分析需要，但实验发现，大部分地表水及饮用水对丙烯酰胺具有基质抑制效应，加标回收率仅能达到50%左右；而且随着加标浓度增大抑制效应越明显；因此，如果不考虑基质抑制作用，就会大大低估水中丙烯酰胺的浓度，故需要考虑固相萃取法对样品进行前处理。固相萃取小柱及洗脱溶液选择A.固相萃取小柱的选择本实验采用SampliQC18ODS500mg/6mL,Oasis（R）HLB6cc（150mg）,Sep-PakAC2-Plus三种固相萃取小柱（5.3.5）,先用10mL甲醇（5.3.2）,再用10mL水对其活化，留5mL水浸泡固相萃取小柱15min后上样过柱富集，小柱吹干后，用10mL甲醇（5.3.2）洗脱，洗脱液氮吹至干，力D1mL超纯水定容，过0.45um一次性微孔滤膜（5.3.4）过滤，上机测定。从萃取效果来看，用Sep-PakAC2-Plus柱萃取样品加标回收率能达到70%以上，而其它两种都低于5%。因此本实验选择Sep-PakAC2-Plus萃取小柱，见表1。表1不同萃取小柱对加标水样的回收率比较小柱规格C18HLBAC2丙烯酰胺加标回收率5%〜7%10%〜15%70%〜95%B.洗脱液用量的选择分别用2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL、15mL的甲醇对富集的目标物进行洗脱，结果发现，随着洗脱液用量的增加回收率越高，当洗脱液用量大于10mL时，回收率达到最高，且相差不大，为了节约氮吹时间，提高效率并保证回收率，本实验洗脱剂用量选择为10mL。5.6分析步骤有关色谱-质谱条件流动相条件选择分别使用水-甲醇、5mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇、5mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇等做流动相，发现用0.1%甲酸水溶液-甲醇梯度洗脱，灵敏度高，峰对称性好，见标准色谱图1,流动相梯度洗脱程序见表1。丙烯酰胺的保留时间为1.63min。

图1丙烯酰胺标准溶液色谱图表2流动相梯度洗脱程序时间(min)流速(UL/min)0.1%甲酸溶液（％）甲醇（％）0.004009910.404009912.5040040602.514009915.00400991质谱条件优化离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI+）；质谱扫描方式：多反应监测（MRM），母离子（Parent）（m/z）:72.375 子离子（Product）（m/z）:55.487碰撞能量（CollisionEnergy）:11V 管状透镜电压（Tubelens）:65V鞘气（Sheathgas）：35psi 辅助气（Auxiliarygas）:10arb毛细管温度£2口］廿2rTemperature）：350℃分辨率（FWHM）：0.70。蒸发器温度（VaporizerTemperature）:450℃极性：正喷雾电压（SprayVoltage）（V）:3500进样量选择由于质谱为质量型检测器，进样量越大，响应值越高，因此，加大进样量能最大限度的提高方法检出限，但进样量过大会加大色谱峰的拖尾;分别选择5uL、10uL、25uL、50uL、100HL进样量上机测定，实验证明，50uL进样量响应值高，且峰对称性好，而进样100HL时，峰拖尾严重。因此，进样量选择50uL。5.6.2标准曲线建立将丙烯酰胺标准贮备液（5.3.6）用甲醇（5.3.2）逐级稀释，最后用纯水配制浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16、制Hg/L的使用液，以峰面积对浓度作线性回归分析，回归方程见表3,标准曲线见图2。表3丙烯酰胺标准曲线测定编号12345678浓度（ug/L）0.20.51.02.04.08.016.020.0峰面积13033356617633314409329755856698311337411499140线性方程Y=73414X-3617线性相关系数r=0.99965.6.3每次分析前用中间浓度的标准溶液作常规校准试验和空白试验：采用和样品分析相同的试剂和步骤，制备全程序空白溶液，并做为日常的质控手段。结果计算与表述制定的标准中采用以样品的保留时间和标样的保留时间相比及特征离子来定性。用作定性的保留时间窗口宽度以当天测定标样的实际保留时间变化为基准。制定的标准中采用外标标准曲线法按式(1)来定量水中丙烯酰胺的浓度。P=(Y-a)V/(KXV) (1)t s式中：P 水样中丙烯酰胺的浓度，ug/L；Y 水样中丙烯酰胺的峰面积；a 校准曲线截距；Vt 洗脱液浓缩定容后的体积，mL；Vs 水样体积，mL；K 校准曲线斜率。检出限、精密度和准确度检出限按照《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(H168-2010)要求，方法分别测定空白加标浓度为0.02口g/L的水样8份，剔除离群值后，统计8份水样的标准偏差S,此时检出限MDL=SX2.998。具体数据及结果见表2。表2检出限测试数据平行号试样0.02ug/L测定结果(ug/L)10.01520.00830.01440.01450.01260.01370.00980.014平均值乂(ug/L)0.012标准偏差S(ug/L)0.003检出限0.008-10-

室内精密度和准确度测定(1)精密度测定取某地地表水10mL,各七份，分别加入一定量的标准物质，按样品步骤进行测定，计算其相对标准偏差，见表3。表3.精密度测试数据平行号试样0.040ug/L2.000ug/L测定结果(ug/L)10.0361.7620.0351.8430.0321.8140.0311.9150.0321.9060.0341.92平均值乂(ug/L)0.0331.86标准偏差S(ug/L)0.0020.064相对标准偏差(％)6.13.4(2)准确度测定取两个不同水样(饮用水和地表水)，各七份，分别加入一定量的标准物质，按样品分析步骤测定其回收率，分析结果见表4。表4实际样品加标测试数据平行号实际样品类型饮用水地表水样品加标样品回收率(%)样品加标样品回收率(%)测定结果(ug/L)10.008ND0.03485.00.008ND1.4773.520.008ND0.03280.00.008ND1.7788.530.008ND0.03280.00.008ND1.5075.040.008ND0.03280.00.008ND1.5376.550.008ND0.03382.50.008ND1.7286.060.008ND0.03177.50.008ND1.6884.0平均值(ug/L)0.008ND0.03280.80.008ND1.6180.6加标量(ug/L)0.0402.000测定结果相对标准偏差「RSD1(%)3.17.9-11-说明:力Xi（1）测定均值X计算公式为：X=i^—n'X1—X）2（2）标准偏差S计算公式为：S=i\n-1S（3）相对标准偏差RSD计算公式： RSDT=，100%X（4）加标回收率二（加标试样测定值-试样测定值）/加标量X100%室间精密度和准确度测定（1）精密度测定在饮用水中分别加入一定量丙烯酰胺标准溶液制得水样1和水样2,由西省环境监测中心站、西安市环境监测站、渭南市环境监测站、宝鸡市环境监测站、汉中市环境监测站、商洛市环境监测站等6个实验室分别对其进行6次测定，水样1实验室内相对标准偏差为：5.6%-9.1%,实验室间相对标准偏差为：6.3%,重复性限为：0.006ug/L,再现性限为：0.008ug/L；水样2实验室内相对标准偏差为：6.7%-11.7%,实验室间相对标准偏差为：2.8%。重复性限：0.403ug/L,再现性限：0.403ug/L。（2）准确度测定在饮用水中分别加入一定量丙烯酰胺标准液而制得水样1和水样2,由其6个实验室分别对其进行6次加标回收率测定，水样1加标回收率在70.0%-97.5%之间，加标回收率最终值为80.8%±9.3%；水样2加标回收率在73.0%-98.0%之间，加标回收率最终值为83.0%±4.6%。（实验数据详见各实验室验证报告）质量保证和质量控制（QA/QC）方法根据HPLC-MS/MS定性、定量分析特点和分析过程技术关键点，从空白干扰消除、仪器性能、校准曲线检查等几个方面制订了质量保证和质量控制的建议和要求。本次制定的标准，将QA/QC单独列为方法的一个主要内容。.方法验证-12-方法验证方案参与方法验证的实验室基本情况按照《环境监测分析方法标准制修订技术导则》（HJ168）和《国家环境污染物监测方法标准制修订工作暂行要求》（环科涵[2009]10号）的要求，组织6家实验室进行验证，陕西省环境监测中心站、西安市环境监测站、宝鸡市环境监测站、渭南市环境监测站、汉中市环境监测站、商洛市环境监测站。根据影响方法精密度和准确度的主要因素和数理统计学的要求，编制方法验证报告，验证数据主要包括精密度、准确度等。方法验证方案方法检出限：按照《环境监测分析方法标准制修订技术导则》（H168-2010）要求，方法分别测定空白加标浓度为0.02口g/L的水样8份，剔除离群值后将各自的8次测定结果计算其标准偏差S,此时检出限MDL=SX2.998。方法的测定下限：参照HJ168-2010,以4倍方法检出限确定为本方法目标物的测定下限。方法精密度和准确度：取某地地表水10mL,各六份，分别加入一定量的标准物质，按样品步骤进行测定，计算其相对标准偏差。加标回收率：取10mL水样各6份，加入标准品使其浓度为0.040Hg/L、2.000Hg/L,进行全程序分析，剔除离群值后将测定结果分别计算平均值、标准偏差、相对标准偏差、加标回收率等。方法验证过程首先，通过筛选确定方法验证单位。按照方法验证方案准备实验用品，与验证单位确定验证时间。在方法验证前，参加验证的人员应熟悉和掌握方法原理、操作步骤及流程。方