抗体制备研究生课件

抗体制备技术

广州医科大学金域检验学院徐霞抗体技术的发展多克隆抗体（polyclonalantibody,pAb）：用一种包含多种抗原表位的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体.单克隆抗体（monoclonalantibodies,mAb）由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。基因工程抗体（geneticengineeringantibody）：应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同需求进行改造和装配，经导入适宜的受体细胞后重新表达的抗体。表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗体单克隆抗体抗体制备技术一、多克隆抗体制备（一）免疫原的制备（二）免疫动物（三）免疫血清的纯化（四）免疫血清的鉴定（五）免疫血清的二、单克隆抗体制备（一）单克隆抗体制备原理抗体制备技术（二）单克隆抗体制备的技术要点（三）影响杂交瘤技术的因素（四）单克隆抗体的应用三、基因工程抗体技术（一）人源化抗体（二）小分子抗体（三）双特异性抗体（四）抗体库技术一、多克隆抗体制备

（一）免疫原的制备免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）免疫原—天然抗原、人工或合成抗原；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；具体制备—细胞性抗原、可溶性抗原、半抗原和免疫佐剂～

摇动15-20min

可保存3周取适量NS洗涤3次2000r/min10minNS稀释至2～5%绵羊红细胞的制备流程图2、可溶性抗原制备：蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸等都是良好的可溶性抗原，成分比较复杂，来源于人和动物的组织和细胞，通常需要将组织或细胞破碎，再经一定的方法提取和纯化。细胞破碎技术：酶处理法冻融法超声破碎法表面活性剂处理原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。特点：此法适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。2.冻融法原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。由于超声波发生空化作用（cavitation）使得液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声波使用的频率从1kHz～20kHz不等，间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。特点：①操作简单，重复性较好，节省时间；②多用于微生物和组织细胞的破碎。3.超声破碎法原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。应用：①破碎细菌，且作用比较温和；②提取核酸时，常用此法破碎细胞。4.表面活性剂处理可溶性抗原的提取①超速离心分离—是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分离。②选择性沉淀—选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或利用某些条件促使抗原成分沉淀的方法。最常用盐析法。③层析法—包括凝胶过滤、离子交换、亲和层析等，用于抗原等物质的精提～

用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。

亲和层析的作用机理3）鉴定：鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性。蛋白的含量—定氮（紫外光280nm等）分子的质量—电泳、质谱蛋白的纯度—电泳、高效液相层析免疫学活性—免疫双扩散、免疫印迹3、半抗原性免疫原的制备半抗原（hapten）蛋白质等载体（carrier）连接—物理法：即利用电荷和微孔吸附半抗原化学法：利用某些功能基团把半抗原连接到载体分子上4、免疫佐剂（immunoadjuvant），与抗原同时或预先注射于机体，能增强机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。

种类—无机、生物性、人工合成、油剂和纳米颗粒。用途—抗原表面积增加，构型改变；延长抗原的滞留时间；增强吞噬～（二）免疫动物

1、免疫动物的选择：

①抗原来源与动物种属的关系（越近越差）②动物个体的选择（年龄、体重与健康，）③抗原性质与动物种类2、免疫的方法：免疫原的剂量～免疫的途径与其间隔时间～免疫动物采血～（对实验成功与否至关重要）（(四)免疫血清的鉴定1、抗体效价的测定（凝集、扩散、ELISA）2、特异性的鉴定（免疫印迹、双扩散）3、纯度的鉴定（SDS-PEAG）4、亲和力的鉴定—affnity指抗体与抗原结合的牢固程度，以亲和常数表示。测定方法有平衡透析、ELISA、竞争（非竞争）结合等。

（五）免疫血清的保存1、4℃保存（6个月）2、低温保存（-70℃～-20℃，5年）3、真空干燥保存（5～10年）注意点：保存前需经除菌保存液含防腐剂避免反复冻融（分装）

多克隆抗体的缺点传统抗血清对相似抗原会有交叉反应性：

对于分子构造相似的抗原，由于它们含有共同或相似的抗原决定基，所产生的抗血清对这两种相似的抗原都会产生反应；因此在检定此类抗原时，其专一性不很理想，常常会出现假阳性，也称为交叉反应性。同时又由于免疫动物的个体差异，对抗原的反应也有相当的差异，以致无法准确控制所得到每批抗血清效价的高低二、单克隆抗体制备单克隆抗体（monocloneantibody，McAb）是由抗原致敏的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，经克隆化培养后由一个细胞克隆所分泌的只识别单一抗原决定簇的纯的抗体。其理化性状高度均一，生物活性单一，高度特异及高效价特性，用于临床实验室诊断与临床疾病治疗。单克隆抗体制备—杂交瘤技术的理论基础淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb一个B细胞只会生产一种抗体：

血清中的每一种抗体是由单一种B細胞

所分泌产生，若能把此B细胞由脾脏中挑出來，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定基反应，其专一性极高。大量培养此细胞株，即可有品质一定、纯度均一的抗体，此即为单克隆抗体。致敏的脾细胞小鼠骨髓细胞

（B细胞）（B细胞恶性肿瘤）抗体分泌具永生性

HGPRT+HGPRT-株（8-AG筛选）

PEG

脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）

（HGPRT+、Ig+）融合后细胞类型杂交瘤细胞未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞脾-脾杂交细胞骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞HAT选择培养原理核苷酸从头合成途径（denovosynthesis）核苷酸补救合成途径（salvagesynthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黄嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）融合后的细胞命运细胞组合HGPRT生长状态淋巴细胞+骨髓瘤+长期生长淋巴细胞+淋巴细胞+短期生长骨髓瘤+骨髓瘤—不能生长未融合淋巴细胞+短期生长未融合骨髓瘤—不能生长单抗制备的流程图单克隆抗体制备的技术要点1抗原提纯与动物免疫2骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备3细胞融合4抗体检测5杂交瘤的克隆化和冻存6McAB的制备7单克隆抗体的纯化小鼠免疫及脾脏细胞：

小鼠(balb/c)先以目标抗原(如菌体)免疫，抗原需加佐剂(adjuvant）注入小鼠体内慢慢释出(免疫流程)，诱使B细胞成熟增殖并生产抗体。试采血

确定有抗体产生后，即可取出

脾脏以收集脾脏细胞(大多为B细胞)与骨髓瘤细胞進行细胞融合。

蛋白质抗原：与免疫动物的遗传背景离得越远的蛋白质，抗原性越好。如植物蛋白质都是很强的抗原小分子抗原：分子量很小的多肽（在数千左右），本身无法诱生抗体，要先结合到大蛋白质（称为carrier，通常用BSA或KHL）上。半抗原：分子量极小的一些小分子称为hapten，接到carrier后也可诱生抗体人工合成肽抗原：若已知某蛋白质的氨基酸序列，可以人工合成某些肽段（约十几个氨基酸），连接到carrier后可得抗血清。通常都先以电脑程序预测抗原性较强的氨基酸序列，选出数段进行免疫。DNA抗原：将目标蛋白质的基因植在某种表达载体中，再以基因枪打入肌肉细胞中，此基因可以在体內表达出目标蛋白质，引发产生抗体或者細胞免疫。骨髓瘤细胞

(NS-1)NS-1

是稳定的BALB/c小鼠

瘤细胞株，除了能在培养基中永久生长外，尚有一重要特性，其细胞缺乏两种核酸代謝重要的酶(TK,thymidine

kinase

及HGPRT,hypoxanthine-guaninephosphoribosyl

transferase)小鼠脾细胞B

与NS-1細胞

N

以PEG

进行融合，操作在10min內完成，随即把细胞平均分配在96孔细胞培养板中细胞融合1.融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％。防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤），防止支原体污染（胎牛血清）。脾细胞取出后可以不用除去紅血球，直接以RPMI洗三次，要小心自行调整离心力不致太大，也不能太小2.要用可靠的PEG1500，每次0.7~1mL；在高压灭菌时，尽量缩短灭菌时间(5min足够)，并且要迅速由灭菌锅內取出3.把NS-1与脾细胞混合（融合比例脾细胞：骨髓瘤细胞=1-10：14.在2min內慢慢加入PEG，摇动，让PEG均勻地混合细胞。然后在2min內加入2mLRPMI，边加边混勻；接下来的2min內，再加8mLRPMI。此时镜检可看到许多细胞聚合，若在融合后1h內看不到很多融合細胞，可能已经失敗离心去掉上清，轻轻加入30mLHAT-RPMI，并均勻悬浮细胞。离心力不可过大，以免把融合后的脆弱细胞压成一块；把细胞放在保温箱30min后，均分到三片96孔培养板，每孔加三~四滴，分配要平均添加或换培养液时，不要搅动细胞，並且不要在培养箱外面放置太久。第二或第三天镜检可以看到很多二元体，是融合后的第一次分裂；这种二元体数目应该很多，培养孔內到出都会冒出來(约25至50对)，可以用『雨后春笋』来形容之，否则可能已经失败。但细胞仍然迅速死亡，最后每孔只剩下一或二个稳定细胞群落，约一周內可以看到如下面彩色图片所示的细胞堆，此时可以进行ELISA筛选。初步筛选：融合后马上以HAT培养，能活下來的都是B细胞与NS-1的正确融合细胞，但此时细胞的遗传背景尚未稳定。

筛选特异性抗体：并非所有B细胞都会产生我们所要的抗体，小鼠原先就存在许多B细胞株对抗一般疾病；因此要用酶联免疫分析法挑出特异性抗体。

克隆化(亚克隆subcloning)：这样所挑出来的细胞株，也許仍含有两群以上的细胞，因此要进行克隆化（从抗体阳性孔中分离出单个细胞进行培养，使之繁殖成单一细胞集落的过程）；先将该细胞株稀释，重新平分到96孔细胞培养板中，以计算使得每孔中只含有一个细胞，待其生长成群落后，再次以ELISA筛选特异性抗体。筛选方法克隆化是要确定每个细胞株的纯系，因为细胞可能还会变化，成为不产生特异性抗体者，如上图最右边的灰色3号细胞。一般使用有限稀释法进行，细胞的数目可用cellcounter数得，并且稀释到所要的浓度，例如每mL含有100个细胞，若只要取一个细胞放到一个培养孔中，那你应该吸取多少mL？(0.01mL)1)小鼠体内诱生法：先向小鼠腹腔注射降植烷，一周后把挑选出来的杂交瘤细胞打入小鼠腹部，诱生肿瘤，然后以针头收集所产生的腹水，通常可取得15mL左右；腹水中的抗体浓度非常高，每mL可达数mg。

2)体外增量培养法：把杂交瘤细胞在大型培养槽中培养，收集培养液上清即得抗体，但每mL只得約数mg，浓度较腹水稀约一千倍。有一种细胞培养瓶，可产生如腹水般浓度的上清，但价格极为昂贵(IBSIntegraBioscience:IntegraCelline)。3)得到稳定的抗体后，通常要再以ELISA方法检定该抗体的subclass是属于IgG,IgM或IgA等。注意IgG又可分成几种sub-subclass。抗体生产可用下列各种方法的组合︰硫酸铵盐析：收集约40%饱和度的沉淀，是最经济、方便的方法。

离子交換法：用DEAE阴离子交換法，多用在纯化IgG。凝胶过滤法：以分子量的差异分离出各种抗体，多用在纯化IgM。亲和层析法：以ProteinA-亲和层析柱專一性地吸住抗体分子(IgG)。抗体纯化克隆化过程

概念：建立单一细胞克隆方法：有限稀释法克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞有限稀释法计数103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔（三）影响杂交瘤技术的因素1、试剂与器材用前必须经严格的筛选，尤其血清、融合剂2、培养技术防止污染，细胞培养的娴熟技能～3、早期克隆化避免无关细胞克隆的过度生长，但又应避免克隆细胞的丢失。（四）单克隆抗体的应用1、医学检验诊断试剂利用单抗具有的特质-特异性与纯度高，理化性均一～2、蛋白质的提纯将其作为亲和层析中的重要配体～3、肿瘤的导向治疗协助示踪

三、基因工程抗体技术基因工程抗体（geneticengineeringantibody）又称重组抗体，指应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同需求进行改造和装配，经导入适宜的受体细胞后重新表达的抗体。包括：（一）人源化、小分子、双价特异及抗体融合蛋白等。