显微切割技术

显微切割技术第四军医大学1234

组织成分的异质性（多样性）与研究需要的同质性（单一性）的矛盾如何解决？

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如何分离研究中需要的越来越小的单一的细胞内组分？8解决之道显微切割技术是解决的方法之一。9第一部分：显微切割技术概况

概念特点

方式材料

范围结合技术

影响因素应用领域

第二部分：激光捕获显微切割技术

10第一部分

显微切割技术概况11

显微切割（microdissection)技术是在显微状态下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织,细胞群，细胞，细胞内组分或染色体区带等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术。I.显微切割的概念12

II.显微切割技术的特点

细微

切割对象可为微米级；切割精度可达毫微米；

原位

在组织细胞或染色体的原位取材，因此所取材料的定位清楚，所研究对象的历史背景明确；13

同质

可以保证所取材料一定层次上的同质性；

结合

可以与多种分子生物学、免疫学及病理学技术结合使用。

14III.显微切割方式镜下手工操作机械微调辅助液压显微操纵激光捕获系统15镜下手工操作

特点：精度低，范围大，易开展。16机械微调辅助

特点：精度有提高，二维操作，简单易行低耗。17液压显微操纵系统特点：精度高；用途多；效率低。18激光捕获显微切割系统特点：电脑控制，激光切割，转移膜收集。19IV.显微切割材料

石蜡切片冰冻切片细胞爬片

细胞涂片细胞铺片染色体片20V.显微切割范围组织切割细胞群切割单个细胞切割单细胞内组分切割染色体区带切割2122232425VI.显微切割结合技术

免疫组织化学

原位杂交

FISHSouthern,Northern,WesternBlotsPCR

基因克隆26VII.显微切割用于PCR

分析所需细胞数的影响因素切片厚度

细胞大小固定方式

DNA提取方式

PCR扩增片段长度27

单个细胞用于突变分析所需要的最小细胞数：冰冻切片同流式细胞仪10个石蜡切片30个28VIII.显微切割应用领域

肿瘤基因突变检测肿瘤异质性研究新基因的发现染色体畸变分析细胞局部病变病因研究29

微阵列（microarray）分析特异基因表达分析杂和性丢失检测微卫星序列不稳定性分析核酸及蛋白质的定量研究30第二部分

激光捕获显微切割技术

LaserCaptureMicrodissection3132Twogeneralclassesof

laser-capturemicrodissectionInfrared(IR)capturesystemUltraviolet(UV)cuttingsystem

3334353637MoleculeMethodology/assayCellularyield/areaofmicrodissectionDNALossofheterozygosity100–1,000cellsDNAImprinting/DNAmethylation200cellsgDNAGeneticmosaicanalysis2,000cellsRNAcDNAlibraryconstruction25,000cells(93ngtotalRNA)

5,000cells(14.7–18.6ngtotalRNA)RNAGene-expressionarrays100cellsfromFFPERNAQRT-PCR100cells/1reactionor2,000cells/200

l

4,000–5,000cellsProteinWesternblot500cells(optimizedblottingprocedure)

2,500cells

8,000–10,000cellsProtein2Dgelelectrophoresis50,000–100,000cells

3.7mm2area

10,000cells(100–200

gin350

20,000–25,000cells

50,000cellsDifferentpurposesdecidedifferentamountofcells38UncoverHiddenMolecularSignaturesfromPureCellPopulations

39Laser-ca