北京耐多药肺结核控制项目室相关问题

结核病细菌学检验的标准化与新诊断技术进展王甦民2022年4月第一页，共七十四页。强化结核病实验室诊断标准化的必要性1、全球结核病控制的三大挑战：耐药结核病、HIV/艾滋病合并结核病、移民〔流动人口〕2、我国结核病疫情依然严重3、目前结核病实验室诊断技术的缺乏第二页，共七十四页。第三页，共七十四页。分类结核分枝杆菌属原核生物界、厚壁菌门、裂植菌纲、放线菌目、分枝杆菌科的分枝杆菌属，分枝杆菌属种类甚多，目前已命名的有200多种，一般可分为缓慢生长和快速生长两大类。第四页，共七十四页。结核分枝杆菌特点结核菌生长缓慢，在一般培养基上分裂一代需要10-20小时细胞壁厚度为10~35nm，较一般细菌的细胞壁厚，含有大量脂类，具有坚韧性和疏水性。抗酸性是分枝杆菌的重要特征。第五页，共七十四页。结核病细菌学检查的重要作用细菌学检查是结核病最客观、最科学和最重要诊断方法和流行病学研究工具。因此结核病的实验室检验仍然面临着较多的问题。第六页，共七十四页。细菌学检验存在的问题不易于标准化操作误差较大〔可到达30%〕1、个人操作误差2、标本性状3、标本来源对结果的理解差异可影响检验结果对临床治疗的参考或指导意义。第七页，共七十四页。主要的细菌学检验技术1、痰涂片抗酸染色、镜检技术2、分枝杆菌别离培养技术3、分枝杆菌快速培养技术4、药物敏感性实验技术5、分枝杆菌菌种鉴定技术第八页，共七十四页。标准的痰涂片抗酸染色、镜检技术标本的收集，特别是痰标本的采集、保存制片和染色过程的标准化读片操作的熟练程度和标准化对结果的理解第九页，共七十四页。痰标本的采集、保存和运送脓样、干酪样或脓性粘液样痰为合格标本，痰量应为3-5毫升。难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状，以供分析结果时参考。容器上应注明与检验单一致的病人姓名、编号及日期。不能及时检验的痰标本应置4C冰箱保存，如需转运，外送前要认真核对检验单与痰瓶上标注，放在专用的转运箱内运送。第十页，共七十四页。标本的采集

标本留取方法痰标本的留取应在医护人员的指导下进行。医护人员应告知病人如何咳痰，合格的痰标本是深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物，并说明唾液检出的可能性很小。检验人员检查痰标本的性状，并在登记本和检验报告单上注明〔按干酪痰、血痰、黏液痰和唾液分类登记〕。第十一页，共七十四页。如何正确留痰查痰对于结核病的诊断是非常重要的，通过痰检可以知道您是否痰中带菌。如果痰中带有结核菌说明您患有肺结核，具有传染性，应该及时遵医嘱治疗。送检痰标本的质量直接影响检验结果的准确性。请您一定按照以下要求和方法留取合格的痰标本。每个痰盒应分别留取1～2口痰，请不要将1口痰分开放到2或3个痰盒中。正确的咳痰方法：1、咳嗽前应缓慢地深吸气，吸气后稍屏气片刻。2、躯干略向前倾，两侧手臂屈曲，平放在两侧胸壁下部，内收并稍加力。3、咳嗽时腹肌用力快速收缩，使腹壁内陷。一次深吸气，可连续咳嗽三声。4、停止咳嗽后，收缩腹肌将剩余的气体尽量呼尽。5、重复缓慢吸气动作或平静呼吸片刻，准备再次咳嗽的动作。*注意：局部人如果突然深吸气容易诱发咳嗽，您可以尝试缓慢或分几次吸气，争取肺泡内充分充气，以增加咳嗽的效率。在这一过程中，要注意动作的连贯性，一气呵成。同时，也可以叩击前胸，或由家属协助叩击后背胸壁。这样震动支气管内的分泌物，能够增加咳嗽排痰的力度。第十二页，共七十四页。直接痰涂片检查法

萋尔-尼尔逊氏〔Ziehl－Neelsen〕抗酸染色法〔热染法〕第十三页，共七十四页。细菌学常规检查

—直接涂片法操作流程涂痰膜自然干燥复红加热初染5分钟自然干燥镜检流水冲洗美兰复染30秒盐酸酒精脱色流水冲洗流水冲洗第十四页，共七十四页。载玻片〔一〕新载玻片必须经95%乙醇脱脂，检查无划痕后方可使用。〔二〕一张载玻片只能涂抹1份痰标本。〔三〕载玻片只允许一次性使用，严禁清洗后重复用于AFB检查。〔四〕载玻片正面一侧1/3处标注实验室序号(如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可使用2B铅笔在磨砂面上直接书写)。〔五〕载玻片正面另一侧2/3中央处均匀涂抹成面积为10×20mm的卵圆形痰膜。第十五页，共七十四页。染色〔一〕严格按照操作标准完成染色程序。〔二〕染色后的痰膜应呈均匀亮蓝色，无红色斑块。〔三〕将染色后的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字，那么说明该玻片涂抹过厚，或染色过程有误。〔四〕染色后的痰膜脱落局部应小于整个涂抹面积的10%。第十六页，共七十四页。〔一〕为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁油镜头直接接触玻片上的痰膜。〔二〕仔细观察300以上的视野。〔三〕每个工作日，一名镜检人员的玻片阅读量一般不应超过25张。〔四〕连续阅读10～12张玻片后，应休息20分钟左右。镜检读片第十七页，共七十四页。

痰涂片抗酸菌浓度与阳性结果机率检出菌数每毫升标本估算菌数阳性结果机率0/100或更多视野＜1000＜10％1-2/300视野5000-1000050％1-9/100视野约3000080％1-9/10视野约5000090％〔cv〕1-9/每视野约10000096.2％〔cv〕10或更多/每视野约50000099.95％〔cv〕第十八页，共七十四页。

查痰次数与阳性机率关系为什么诊断前强调三涂两培〔3S2C〕

12345第十九页，共七十四页。细菌学常规检查

—直接涂片法显微镜检报告方式：0条/300视野：萋-尼氏抗酸杆菌阴性1-8条/300视野：实报菌数3-9条/100视野：萋-尼氏抗酸杆菌阳性〔+〕1-9条/10视野：萋-尼氏抗酸杆菌阳性〔2+〕1-9条/1视野：萋-尼氏抗酸杆菌阳性〔3+〕10条/1视野：萋-尼氏抗酸杆菌阳性〔4+〕第二十页，共七十四页。细菌学常规检查

—直接涂片法本卷须知：选择痰标本中脓性、血样、干酪样的局部涂片阳性率较高；一张玻片只涂一份标本，玻片一次性使用，防止交叉污染；翻开痰盒、涂抹痰膜时容易产生气溶胶，应注意正确操作和自身防护；石炭酸复红初染时必须加温。第二十一页，共七十四页。细菌学常规检查

—直接涂片法优点：是直接发现原菌的检查方法，适用于痰、尿、便、体液、组织等几乎一切标本，有重要的临床诊断价值。是发现和确定传染源的重要途径，是考核和评价疗效的重要指标，有重要的流行病学意义；操作简便，价格低廉，适于各级实验室开展；快速，数小时可报告结果。第二十二页，共七十四页。细菌学常规检查

—直接涂片法缺点：敏感性低：通常每毫升含5000-10000条以上抗酸菌才可得到阳性结果；特异性较低：只能报告“抗酸菌阳性〞，不能区分结核和非结核分支杆菌；镜下只能观察菌体形态，不能区分死、活菌。第二十三页，共七十四页。涂片镜检质量保证系统—室内质控标本收集、染色液制备、涂片染色程序、显微镜镜检、显微镜的保养和维护、结果的报告和登记、痰片的分类保存等应按照国家参比实验室的统一标准严格进行操作。复查方式：自查：试验员当日对已查涂片抽样复查。互查：由本实验室其他试验员抽查当日10%涂片。第二十四页，共七十四页。涂片镜检质量保证系统—室间质控以现场和非现场督导为主要方式。现场督导：质控实验室人员赴被质控实验室就实验室布局、平安防护、污染物处理、涂片染色操作、显微镜维护状况、日常实验记录等进行考核和指导，并以盲法、按比例抽取涂片复查。非现场督导：防治人员依据盲法、按比例的原那么抽取涂片交实验室复查。第二十五页，共七十四页。复检玻片样本量1.样本量估算：盲法复检的关键是复检结果能否真正代表被督导实验室的实际水平。世界卫生组织推荐80%灵敏度、100%特异性〔针对阴性玻片〕、误差为0的可接受数量以及95%可信限样本量表，可以极大地减少样本量，保证了盲法复检在统计学意义上可以代表被评估实验室的总体水平。第二十六页，共七十四页。复检样本量计算表上一年阴性玻片的总数

玻片阳性率2.5%5.0%7.5%10.0%13.0%15.0%18.0%30018512910180675950400217143108867061515002431541148971625270028116712192756554100031818012896766655200037619713510079685650004232081411038069571000044121314210480695720000450215143104826957第二十七页，共七十四页。复检样本量计算表说明：

a、玻片阳性率：指所有检测的玻片中阳性玻片的比例〔平均阳性率〕。b、上一年阴性玻片总数：每年玻片的总数减去全年阳性玻片数。c、抽样时，当上一年阴性玻片数量和玻片阳性率不在选择点，阴性玻片数值采用区间上限，玻片阳性率采用区间下限。第二十八页，共七十四页。复检结果评价盲法复检的目的不是为了验证某个病人诊断正确与否,而是评价整个实验室操作水平。评价的内容除了玻片镜检结果存在的误差之外，还包括检查标本的质量〔合格标本与不合格标本的比例〕、涂抹的大小和厚度、染色质量如何等,以便采取纠正措施，提高实验室的工作质量。第二十九页，共七十四页。1.误差分类：分为定性误差和定量误差〔1〕定性误差包括高假阳性和高假阴性高假阳性〔HighFalsePositiveHFP〕：阴性片被错误地判读为2＋以上的阳性。高假阴性〔HighFalseNegativeHFN〕：2＋以上的阳性玻片被错误地判读为阴性。第三十页，共七十四页。〔2〕定量误差包括量化误差、低假阳性和低假阴性量化误差〔QuantificationError，QE〕：同一张阳性玻片初检者和复检者阳性判断级别的差异。低假阳性〔LowFalsePositive，LFP〕：阴性玻片被错误地判断为1＋及以下的阳性。低假阴性〔LowFalseNegative，LFN〕：1＋及以下玻片被错误地判断为阴性。第三十一页，共七十四页。常见“误差〞原因误差类型可能原因建议假阳性（FP）1)例如染料沉渣或结晶等被误识为抗酸杆菌2)原始报告后着色的抗酸杆菌退色1）对技术人员复训。2）对假阳性玻片重新染色并复检。假阴性（FN）1）观察玻片的视野数量不足2）镜检技术能力差3）染色操作不规范（抗酸杆菌颜色暗淡、背景对比不足或过高）4）显微镜存在问题5）染液质量差1、2、3）对技术人员复训4）现场检查显微镜工作状态5）重新购置质量合格的染料并重新配制染液量化误差（QE）1）观察玻片视野数量不足2）阳性玻片的分级报告标准掌握差3）镜检技术能力差4）显微镜存在问题1.2.3）对技术人员复训4）现场检查显微镜工作状态第三十二页，共七十四页。实验室诊断的新进展1、扩大开展液体培养和药敏试验2、引入现代分子生物学快速检测技术3、引入现代免疫学快速检测技术第三十三页，共七十四页。1、现代分子生物学检测主要技术实时荧光定量PCR环介导等温扩增基因检测(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)分子线性探针〔Hain技术〕(2022WHO推荐)基因芯片技术GeneXpertMTB/RIF快速诊断技术第三十四页，共七十四页。〔1.1〕聚合酶链反响〔PCR〕

PCR诞生于1985年，由美国Muliis等创造。PCR是一种根据脱氧核糖核酸〔DNA〕复制原理而设计的体外DNA或核糖核酸〔RNA〕扩增方法，由高温变性、低湿退火及适温延伸等反响组成一个周期，经过n个周期后，理论上可以获得2n双链DNA分子，使DNA特定区段大量扩增。此检测技术灵敏度高、特异性强、简便、快速，但也存在假阴性、假阳性、污染等方面的问题，研究人员对其进行了不懈的研究，使该技术不断得到改善，新的PCR及其衍生技术不断建立。第三十五页，共七十四页。实时荧光定量PCR实时定量PCR(RealTimeQuantitativePCR)是指在PCR反响体系参加荧光基团，利用荧光积累能够监控PCR扩增的每一个循环，在靶ＤＮＡ扩增的同时可获得定量的结果.即在同一个反响体系内完成扩增和扩增产物的检测,从而省去了靶ＤＮＡ扩增后复杂的定量检测工作。第三十六页，共七十四页。实时荧光定量PCR该技术的优势在于其扩增产物的自动和实时检测,减少了常规ＰＣＲ产物检测步骤,也减少了人工判断结果的主观性，提高了结果的客观性和可比较性。同时工作效率大大提高。研究发现，该方法的特异性和敏感性较普通ＰＣＲ有所提高。与Southern杂交和酶促化学发光技术检测的灵敏度相似,但要比酶促比色法提高10倍。第三十七页，共七十四页。〔1.2〕环介导等温扩增基因检测(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)检测是连续等温进行的。扩增效率十分高，反响灵敏。采用4条引物，识别6个位点，特异性强。不需要特殊的试剂与仪器，总费用很低。反响不需要开盖，在一管内完成全部检测。利用Bst酶的链置换功能进行反响。参加反转录酶，可以完成ＲＮＡ的一步法检测。第三十八页，共七十四页。PurificationforUltraRapidExtraction

(PURE)LAMP方法PURE方法等温反响高扩增效率高特异性实验周期短(几乎一个小时)简单去除核酸扩增抑制因子缩短处理时间Pre-treatmentkitLAMPtestSampleLysisMixtureFilterDNA第三十九页，共七十四页。LAMP检测阴性阳性不需要离心,等温,快速(整个过程只需一个小时)；DNA与SYBRGreen结合现示绿色，Bst聚合酶于30分钟到一个小时内可将毫微微克/毫升(fg/ml)〔或500-100拷贝/毫升〕的DNA或RNA扩增到10微克左右。第四十页，共七十四页。LAMP敏感度101001000NCcopies/reaction模板:纯化的TB基因组DNA反响条件:67℃,40min第四十一页，共七十四页。LAMP结果分析仪器特点：1.LAMP检测专用，每隔6秒测定反响产物的浊度．2.可以设定相应的反响条件与检测要求．3.测定结果可直接输入电脑进行实时分析．4.检测结果〔图像等〕可以打印．5.可同时检测32个样本，８联管适用．第四十二页，共七十四页。〔1.3〕、分子线性探针〔Hain技术〕原理：基于PCR扩增的检测方法。扩增后的产物与预先固化在膜上的特异性探针杂交，通过显色反响判断结果，可以鉴定TB和NTM、鉴定TB复合群、快速检测RIF、INH、EMB、喹诺酮类、氨基糖苷类耐药性第四十三页，共七十四页。

GenoType®分支杆菌试剂盒系列GenoType®MTBC〔来自于培养标本的结核分枝杆菌复合群菌种间的鉴定〕GenoType®MycobacteriaDirect〔来自于病人标本的结核分枝杆菌复合群，非结核分枝杆菌复合群的鉴定〕GenoType®MycobacteriumCM〔来自于培养物的结核分枝杆菌复合群，非结核分枝杆菌的鉴定〕GenoType®MycobacteriumAS〔来自于培养物的其他非结核分枝杆菌的鉴定〕GenoType®MTBDRplus〔结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药性检测〕GenoType®MTBDRsl〔结核分枝杆菌乙胺丁醇、喹诺酮类、氨基糖苷类耐药性检测〕第四十四页，共七十四页。技术设备TwinCubator®

手工杂交仪第四十五页，共七十四页。自动操作-全自动杂交仪GT-Blot®48或GT-Blot®20第四十六页，共七十四页。GenoTypeMTBDRplus结果MTBC及其对利福平和/或异烟肼的耐药性第四十七页，共七十四页。

适用于培养物和痰液。检测快速，对于直接采集的样本或阳性培养物在数小时后内即可完成检测；检测INH单耐药型TB、MDR和XDR；符合WHO推荐的线性探针分析标准。GenoTypeMTBDRplus/sl–优点第四十八页，共七十四页。验证数据产品目的材料靶点敏感性专属性对照方法*GenoType®

MycobacteriumCM普通分支杆菌的鉴定阳性的固体/液体培养物DNA97%93,5%测序；生化技术GenoType®MycobacteriumAS其他菌种的鉴定阳性的固体/液体培养物DNA96%94%测序；生化技术GenoType®

MTBC结核分支杆菌复合群的菌种区分阳性的固体/液体培养物DNA100%100%生化技术；分子遗传学方法GenoType®

MTBDRplus结核分支杆菌复合群的鉴定及其对利福平和/或异烟肼的耐药性直接采集的标本（显微镜检查阳性，经过纯化）；阳性的固体/液体培养物DNA直接采集的标本RMP:96,8%INH:90,2%固体/液体培养物RMP:98,7%INH:92%直接采集的标本RMP:95%INH:100%固体/液体培养物RMP:100%INH:100%传统的药敏试验(DST)GenoType®

MTBDRsl结核分支杆菌复合群的鉴定及其对氟喹诺酮类和/或氨基糖苷类/环肽和/或乙胺丁醇的耐药性直接采集的标本（显微镜检查阳性，经过纯化）；阳性的固体/液体培养物DNA直接采集的标本氧氟沙星：88,9%阿米卡星/卷曲霉素：75%乙胺丁醇：38,5%固体/液体培养物**氧氟沙星：90,6%阿米卡星/卷曲霉素：84,8%乙胺丁醇：69,2%直接采集的标本氧氟沙星：100%阿米卡星/卷曲霉素：100%乙胺丁醇：100%固体/液体培养物氧氟沙星：100%阿米卡星/卷曲霉素：100%乙胺丁醇：100%传统的药敏试验(DST)GenoType®

MycobacteriaDirect结核分支杆菌复合群鸟分支杆菌M.avium、胞内分支杆菌M.intracellulare、堪萨斯分支杆菌M.kansasii、玛尔摩分支杆菌M.malmoense的鉴定经纯化后的直接采集的标本RNA涂片阳性样本97,5%涂片阴性样本83,3%涂片阳性样本99%培养第四十九页，共七十四页。结论DNA-Strip技术系列涵盖了分枝杆菌菌种鉴定、TB-复合群的区分和药敏试验。所有检测都采用通用试剂盒和相同的方案进行扩增和杂交。所有检测均可在4-5小时内完成。本法适用于大样本量的检测〔每天检测数百份样品〕。第五十页，共七十四页。〔1.4〕、基因芯片技术科学的开展人类的进步要求进行大规模基因信息的解析鉴于基因芯片的多种用途和其远大的开展前景，不少生命科学研究机构和生物技术公司都先后参与了这项技术的研究。据不完全统计目前仅国内就有十多家单位从事该技术的研究与开发工作，全世界估计至少有二三十家。它已象半导体技术一样成为一个重要的产业方向。当前已正被广泛地应用于诸多领域，包括生物医学、临床诊断学和基因组学研究。第五十一页，共七十四页。什么是基因芯片基因芯片指对数以千记的DNA片段同时进行处理分析的技术，诸如基因组DNA突变谱和mRNA表达谱的检测等〔TrendsinBiotechnology)。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。第五十二页，共七十四页。基因芯片技术的主要特点技术操作简单自动化程高序列数量大检测效率高应用范围广本钱相对低第五十三页，共七十四页。博奥分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(DNA微阵列芯片法)主要分为样品制备、芯片反响和结果判读三局部。

首先，将检测菌的DNA从培养、别离纯化的菌株或者直接从临床样品中提取出来；

然后，对样品中的靶基因进行扩增和荧光标记；

接着，将扩增并荧光标记的基因序列与芯片上的探针进行杂交反响；

最后芯片扫描成像，用配套软件进行判读。第五十四页，共七十四页。芯片扫描结果1第五十五页，共七十四页。临床验证第五十六页，共七十四页。〔1.5〕GeneXpertMTB/RIF快速诊断技术Cepheid®MTB/RIF:可直接检测痰液，检测结核分支杆菌的同时，鉴定是否有利福平耐药性，2小时出结果。GeneXpert检测平台采用实时荧光定量PCR检测原理。所有检测均无需提取核酸，手工操作时间不超过2分钟。第五十七页，共七十四页。GeneXpert最大程度简化TB检测！！！将痰液参加处理瓶，放置15分钟；将处理后的样品参加样品反响盒；将该盒子放置在GeneXpert中，轻松按下“开始〞键；得到结果〔2小时〕：检测是否含有结核分支杆菌的同时，可对利福平耐药性进行判读。第五十八页，共七十四页。XpertMTB/RIF检测操作步骤1、痰液参加处理瓶，放置15分钟。2、取处理后的痰液2mL参加Xpert反响试剂盒3、将反响试剂盒放入GeneXpert仪器，点击“开始〞〔手工操作至此结束！〕4、自动过滤洗涤样品5、自动超声破碎，纯化样品6、荧光定量PCR扩增7、巢氏PCR扩增8、自动结果判读〔MTB/RIF〕第五十九页，共七十四页。“Samplein.Answerout.〞全自动操作完全封闭系统污染可能性小减少人为错误结果精确度高检测时间短无需专业技术人员和特殊实验室第六十页，共七十四页。研究人数>1,700Patients•秘鲁、南非、阿塞拜疆、印度•涂片阳性样品：•灵敏性98.2%,特异性99.2%•涂片阴性,培养阳性样品：•三次检测灵敏性90.2%•一次检测灵敏性72.5%•对利福平耐药性检测：•灵敏性97.6%,特异性98.1%第六十一页，共七十四页。结论GeneXpert检测Mtb简单、易于操作，对操作者技术要求不高：只需要把痰液、反响液参加仪器即可得出诊断报告；GeneXpert检测Mtb快速：整个过程大约2小时。GeneXpert检测Mtb对操作人员平安：整个检测过程全封闭、一次性完成。高灵敏性：BCG—176cfu/ml；H57Rv—112cfu/ml耐药性诊断：可对利福平耐药性进行检测第六十二页，共七十四页。现代免疫学诊断技术1、体液免疫诊断技术：是利用结核分枝杆菌或其提取物抗原检测结核病患者血清抗体的方法。目前，通过检测抗结核杆菌的抗体(IgG)诊断结核病的商品化试剂盒已较多。采用的方法包括：酶联免疫吸附试验〔ELISA)和免疫金标记技术的免疫层析法和胶体金标记的渗滤法等，采用的抗原也各不相同。第六十三页，共七十四页。体液免疫学诊断技术的意义在国内应用较广泛，是结核病的辅助诊断方法之一,尤其对肺外结核、菌阴肺结核的诊断具有应用价值。缺乏之处：单独使用时，其检测的特异性和灵敏度都有些缺点。目前国际上反对使用该项技术的呼声在增加。原因主要是特异性问题。第六十四页，共七十四页。2、细胞免疫学诊断技术细胞免疫诊断技术应用较少，过去主要应用PPD皮试技术，近年来英国和澳大利亚研制了ELISpot、T-Spot技术和QFT-Gold。此项技术用于感染情况的检测是一项特异性较强、灵敏度较高很有希望的新技术。第六十五页，共七十四页。酶联免疫斑点(ELISpot)技术是检测细胞分泌细胞因子的一种实验方法，采用可定量的夹心ELISA方法，利用结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6&CFP-10刺激和激活免疫活性细胞使其产生IFN-，并检测IFN-的浓度变化进行诊断的方法。通过ELISpot酶联斑点分析系统对加底物后形成的斑点分析后得出结果。ELISpot具有较高的特异性和敏感性。第六十六页，共七十四页。ELISPOT技术原理细胞免疫主要由T淋巴细胞发动，T淋巴细胞分成效应T淋巴细胞和记忆T淋巴细胞。记忆T淋巴细胞在首次感染病原体后长期存在免疫系统中。当再次受到感染刺激后。这些记忆T淋巴细胞发出信号分子并增殖成为效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞分泌细胞因子，如干扰素(INF-γ)。所以无论是否有临床病症，检测效应T淋巴细胞在血中的水平可作为机体是否被感染的指标。第六十七页，共七十四页。ELISPOT在结核病诊断中的应用在MTB潜伏感染诊断中的应用早期诊断MTB潜伏感染对控制结核病意义重大。目前诊断MTB潜伏感染仍沿用100年来使用的TST，但TST不能区分MTB感染患者和接种BCG的健康人以及感染环境中的分枝杆菌患者。Lalvani在土耳其检查了暴露于肺结核家庭环境中的908名健康儿童。皮试结果说明580名儿童患有潜伏性肺结核,需要进行药物治疗,以免转化为活动性肺结核;而ELISPOT结果发现只有380名儿童患有潜伏性肺结核。通过ELISPOT检测,只需要治疗380名儿童,而不是580名,但却能够预防同样数量的活动性肺结核病例发生。因此，ELISPOT比TST筛选结核潜伏感染更有效,而且ELISPOT检测结果与MTB的接触程度相关性更强。第六十八页，共七十四页。ELISPOT早期技术评估英国Ewer等用ELISpot检测对结核分枝杆菌分泌的抗原有特异性反响的T淋巴细胞来诊断早期结核病。这项研究共纳入了结核流行区有不同程度结核病接触史的535名学生，结果显示结核菌素皮肤试验(TST)和ELISpot的一致性达89%(P<0.0001)。但ELISpot与研究对象结核病接触程度之间的正相关性显著强于TST。在接种过BCG的儿童中，TST假阳性的可能性较大，而BCG接种对ELISpot结果没有影响。作者认为ELISpot可开始替代TST，这将使更多的人能在感染仍处于隐匿期时就可进行预防，而不至于开展成为严重的结核病。第六十九页，共七十四页。ELISPOT法的优点(1)灵敏、特异，能从100万个细胞中测出1个分泌INF细胞；只有MTB和少数非结核分枝杆菌才会出现阳性反响，而BCG及多数非结核分枝杆菌因不分泌ESAT-6和CFP-10蛋白，因此本法能区别BCG接种出现的阳性反响。(2)快速：能早期诊断结核感染，检测全过程2天。(3)应用面广：在肺结核、肺外结核及免疫抑制的结核患者均能检测。(4)疗效评估：当结核菌被消灭后，效应T淋巴细胞即消失，测定效应T淋巴细胞也可检测机体是否去除了结核菌，进行临床疗效评估。第七十页，共七十四页。ELISPOT技术的缺点细胞培养及抗原刺激时,有发生细菌污染的可能,以致实验失败;实验过程步骤较多,实验人员需有一定的理论根底并经屡次操作的培训方能胜任;目前试剂价格比较昂贵。第七十一页，共七十四页。结束语结核病准确、快速的诊断是结核病防治人员多年期盼的。随着科技不断进步，今天企盼已经成为可能。经过不断的对现有技术的优化和继续努力开发更新的技术，相信未来的结核病实验室诊断，一定可以最大限度的满足临床和防治工作的需要。第七十二页，共七十四页。谢谢！第七十三页，共七十四页。内容总结结核病细菌学检验的标准化与新诊断技术进展。5、重复缓慢吸气动作或平静呼吸片刻，准备再次咳嗽的动作。如使用的载玻片一端有磨砂面，可使用2B铅笔在磨砂面上直接书写)。以现场和非现场督导为主要方式。〔1〕定性误差包括高假阳性和高假阴性。5）重新购置质量合格的染料并重新配制染液。与Southern杂交和酶促化学发光技术检测的灵敏度相似,但要比酶促比色法提高10倍。固体/液体培养物**。谢谢第七十四页，共七十四页。儿童休克的诊断与治疗思路LOREMIPSUMDOLOR正常的血液循环过程1.正常的血液循环过程血容量→心泵→血管→组织灌注→器官功能2.血压维持的三大要素有效循环血量心泵功能（心输出量）外周血管阻力3.收缩压、舒张压、脉压与平均动脉压收缩压：反应心肌收缩力与心搏量舒张压：反应大动脉弹性与外周血管阻力脉压：是一个计算值，收缩压与舒张压之差值平均动脉压：是一个计算值，1/3收缩压+2/3舒张压中心静脉压：反映循环容量符合与右心功能状况休克的定义

休克（shock）：是由多种致病因素引起的急性循环功能障碍，因有效循环血容量减少，使全身组织和重要器官血流灌注不足，集体不能输送足够的氧和营养物质、并去除代谢产物，从而导致一系列代谢紊乱、细胞损伤及脏器功能不全的急性临床综合征。在休克病程的不同阶段，有不同的矛盾特点：早期以有效循环血容量减少，心输出量减少，微循环障碍为主晚期以代谢紊乱、细胞损害和器官功能障碍为主最后发展至MODS，可致死亡。休克的本质组织器官血流灌注不足组织氧和营养物质利用障碍休克的病理生理过程1.休克的基本发病过程有效循环血容量不足→微循环障碍→MMDS→MODS2.休克的病理生理（早期）有效循环血容量减少心输出量减少微循环障碍（痉挛、扩张、麻痹、血栓、CLS）3.休克的病理生理（晚期）组织缺血缺氧代谢紊乱表现器官功能不全或衰竭→MODS（难治期）休克时血压与心输出量变化1.休克时收缩血压的状况升高正常下降2.休克时心输出量的状况升高正常下降休克的分类（一）根据病因学分类1.脱水性休克2.过敏性休克3.脓毒症休克（感染性休克）4.心源性休克5.神经源性休克6.失血性休克7.贫血性休克8.混合性休克休克的分类（二）根据血流动力学特点分类1.低血容量性休克（如脱水性休克、失血性休克）2.分布异常性休克（如脓毒症休克、过敏性休克、神经源性休克）3.心源性休克4.梗阻性休克5.贫血性休克6.混合性休克休克的分类（三）根据病程分期1.休克代偿期（休克早期）脏器低灌注血压正常或者偏高2.休克失代偿期（休克晚期）脏器功能不全，伴血压下降3.休克不可逆期（休克难治期）多脏器功能衰竭伴顽固性低血压休克的分类（四）根据临床表现分型1.暖休克：高排低阻。可有意识改变、尿量减少或乳酸性酸中毒等，但四肢温暖、皮肤干燥、无花斑纹，脉压增大，脉搏搏动有力，毛细血管再充盈时间正常，心率快，休克代偿期血压正常，失代偿期血压降低。多为休克早期，极容易漏诊，且可很快转变为冷休克。2.冷休克：低排高阻或者低排低阻。除意识改变、尿量减少外，还表现为皮肤苍白或花斑纹，四肢凉，脉搏增快、细弱，毛细血管再充盈时间延长（≧3s）。休克代偿期血压正常，失代偿期血压降低。儿科休克多为此型。脓毒性休克的定义脓毒性休克（septicshock）是发生在各种严重感染的基础上，由致病微生物及其产物所引起的急性循环功能障碍，有效循环血容量减少，使全身组织和重要器官的血流灌注不良，不能输送足够的氧和营养物质以满足组织代谢需要，从而导致一系列的代谢紊乱、细胞受损及脏器功能障碍的急性综合征。sepsis+急性循环功能障碍（顽固性组织低灌注，伴或不伴低血压）即为脓毒性休克。在脓毒性休克病程的不同阶段，有不同的矛盾特点：早期以有效循环血容量减少、心输出量减少、微循环障碍为主；晚期则以细胞损害、代谢紊乱和器官功能衰竭为主；最后发展至MODS，可致死亡。承认脓毒性休克2016年最新定义，指在脓毒症的基础上，经充分液体复苏后，仍持续低血压（需要升压药以维持平均动脉压≧65mmHg）且乳酸水平>2mmol/L。脓毒性休克诊断

根据儿童脓毒性休克诊治专家共识（2015版）（一）脓毒性休克代偿期：在下列各项脏器低灌注表现中，6项满足3项或以上+血压不下降者1.意识改变早期烦躁不安或萎靡，表情淡漠或嗜睡，晚期意识模糊，甚至昏迷、惊厥（多见于失代偿休克）2.心率脉搏改变心率、脉搏增快，外周动脉搏动细弱，外周动脉搏动可有力3.皮肤改变面色苍白或苍灰，肢端湿冷，大理石样花斑纹。如为暖休克可表现为四肢温暖、皮肤干燥、无花斑纹4.毛细血管再充盈时间（CRT）延长CRT≧3s（或>2s）（除外环境温度影响）。如为暖休克，CRT可正常。5.尿量减少充分液体复苏后，尿量<0.5ml/（kg.h）（无尿），持续至少2h；或者尿量<1ml/（kg.h）（少尿）6.乳酸酸中毒动脉血乳酸>2.0mmol/L（除外其他缺血缺氧以及代谢因素）脓毒性休克诊断

根据儿童脓毒性休克诊治专家共识（2015版）（二）脓毒性休克失代偿期：代偿期脏器低灌注表现加重+出现低血压（主要指收缩压）者<1月收缩压<60mmHg1-12月收缩压<70mmHg1-10岁收缩压<70+2×年龄（岁）mmHg≧10岁收缩压<90mmHg2.需要使用心血管活性药物才能够维持血压在正常范围（多巴胺>5ug/（kg.min））或任何剂量的多巴酚丁胺、去甲肾上腺素、肾上腺素等）脓毒性休克诊断

根据儿童脓毒性休克诊治专家共识（2015版）（三）脓毒性休克不可逆期（难治性）：多脏器功能衰竭血压明显持续下降，心音嫉妒低钝，严重心肌损害，严重心律紊乱，常合并心功能衰竭、肺水肿或ARDS、脑水肿、肾功能衰竭、胃肠道功能衰竭、DIC、严重的内环境紊乱与电解质紊乱（低钙血症、低钠血症等）等多器官功能衰竭表现。治疗难度极大，大多最终死亡。儿童危重症的基本处理原则（1）除告知病情危重，并做相应处理外，还应把我以下基本原则1.通道2.氧气3.盐水4.监护5.上级6.住院（PICU）7.强调病情变化，动态监测，即使评估，随时调整。儿童休克的治疗原则各种儿童休克治疗的基本原则1.早期、积极、持续，并采取综合治疗措施2.重症监护（包括血流动力学监测）与一般治疗3.抗休克治疗（液体复苏与心血管活性药物应用）4.器官功能饱和与支持对症治疗5.针对病因与基础疾病治疗6.基础治疗，如氧疗、镇静镇痛治疗，胃肠道减压治疗7.监测评估调整相统一脓毒性休克的治疗

脓毒性休克治疗的主要内容与方法重症监护（包括血流动力学监测）与一般治疗抗休克治疗（液体复苏与心血管活性药物应用）抗感染治疗及感染灶清除，并与抗炎治疗协同进行肾上腺皮质激素应用静脉大剂量免疫球蛋白治疗纠正凝血功能障碍与DIC连续血液净化治疗（肾脏替代治疗）器官功能保护与支持对症治疗（ECMO）维持内环境平衡与稳定危重症的营养支持治疗（暂禁食与静脉营养）基础治疗，如氧疗，镇静镇痛治疗，胃肠道减压治疗脓毒性休克的重症监护与一般治疗1.重症监护：生命体征、临床症状及实验室指标：a心电监护、SPO2监测以及动脉血气分析。bT、R、BP、意识改变、肢端温度、皮肤颜色、CRT、尿量、肝脏大小、心肺听诊等。c血常规、尿常规、血气、血乳酸、血糖、血电解质、肝肾功能、凝血功能指标、心肌损害指标、其他器官功能指标d炎症反应指标（如CRP、PCT、IL-6、铁蛋白等）e床旁胸片、彩超、心电图、脑电图等f病原学指标g无创或有床血流动力学监测与氧代谢指标监测h准确记录液体出量、入量脓毒性休克的重症监护与一般治疗2.合适体位：头部及双下肢抬高30°3.对症治疗：积极控制体温；四肢末梢保暖；亚低体温脑保护；保证气道畅通。4.基础治疗：氧疗（给予高流量鼻导管供氧或面罩氧疗，如鼻导管或面罩氧疗无效，则予无创正压通气，或尽早进行气管插管机械通气），胃肠道减压（如鼻胃管持续负压吸引减压/肛门直肠减压、灌肠/导泻、导尿），镇静镇痛肌松治疗，维持内环境平衡，营养治疗等。脓毒性休克的液体复苏（一）脓毒性休克液体复苏目的1.恢复有效循环血容量，即容量复苏。休克时微循环障碍，血液淤滞在微循环内，毛细血管通透性增加，血管内页渗漏到组织间隙，血流分布一场，有效循环血容量急剧减少，心输出量下降。因此患儿无论是否有额外体液丢失，液体复苏都是重要的治疗措施。且往往需要大容量液体复苏，液体入量远高于出量。由于血液重新分配及毛细血管渗漏等，脓毒性休克的液体丢失和持续低血容量可能持续数日。因此要继续和维持输液，应维持数日。2.恢复有效的器官血流灌注休克时，血流比血压可能更重要。3.纠正各种代谢紊乱，维持内环境平衡稳定如维持水电解质平衡、渗透压平衡、纠正代谢性酸中毒、维持血糖稳定（5个平衡）脓毒性休克的液体复苏

(二)脓毒性休克液体复苏原则1.及时充分液体复苏是逆转休克病情，降低病死率最关键的措施。