多重荧光定量PCR技术在唐氏综合征筛查中的应用

多重荧光定量PCR技术在唐氏综合征筛查中的应用张丹妍1,2，官燮1，苏燕3，杨玉有1，赵乐天1，李练兵1，杨柳1*（1.国家卫生计生委出生缺陷与生殖健康重点实验室//重庆市人口和计划生育科学技术研究院，重庆400020;2.第三军医大学基础医学部医学遗传学教研室，重庆400038;3.重庆医科大学，重庆400016）[摘要]目的探讨多重荧光定量PCR技术在唐氏综合征筛查中的应用。方法针对21号染色体上的基因座D21S1409、GATA163G03、D21S1422、D21S1435设计荧光引物，通过复合扩增，利用ABI3130遗传分析仪检测212个正常个体样本、6个唐氏综合征患儿家庭样本，并比较患儿家庭样本的外周血染色体核型结果，评价该技术的准确性。结果选取的4个STR基因座的杂合度(H＞0.64)、识别能力(DP＞0.802)和信息量(PIC＞0.58)均较高。检测的6个疑似唐氏综合征患儿家庭样本结果与染色体核型提示结果一致。结论多重荧光定量PCR技术具有较高的敏感性和特异性，可用于唐氏综合征的高通量快速筛查。[关键词]遗传学；多重荧光定量PCR；短串联重复序列；D21S1409；GATA163G03；D21S1422；D21S1435ApplicationofmultiplexfluorescentquantitativePCRtechniqueinDown'ssyndromescreeningZhangDanyan,GuanXie,SuYan,YangYuyou,ZhaoLetian,LiLianbing,YangLiu*（1KeyLaboratoryofBirthDefectsandReproductiveHealthofNationalHealthandFamilyPlanningCommission//ChongqingInstituteofPopulationandFamilyPlanning，Chongqing400020;2DepartmentofMedicalGenetics，CollegeofBasicMedicalScience，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038；3ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China）[Abstract]ObjectiveToexploretheapplicationofmultiplexfluorescentquantitativePCRtechniqueinDown'ssyndromescreening.MethodsFluorescentlabeledprimersweredesignedaccordingtoD21S1409,GATA163G03,D21S1422,D21S1435lociinthechromosome21.TheproductsofmultiplexPCRof212normalindividualsand6suspectedfamilieswithDown'ssyndromeweredetectedbyABI3130geneticanalyzer.Theresultsofsuspectedindividualscomparedwiththeirperipheralbloodkaryotypessoastoevaluatetheaccuracyofthetechnology.ResultsHighheterozygosis(H>0.64),abilitytoidentify(DP>0.802)andtheamountofinformation(PIC>0.58)ofselected4STRlociwereinpopulation.Thedetectionresultsof6suspectedfamilieswithDown'ssyndromewereconsistentwiththeirchromosomekaryotypes.ConclusionMultiplexfluorescentquantitativePCRtechniquehashighersensitivityandspecificity,andcanbeusedforrapidscreeninginhighthroughputforDown'ssyndrome.[Keywords]genetics;multiplexfluorescentquantitativePCR;shorttandemrepeat;D21S1409；GATA163G03；D21S1422；D21S1435SupportedbyChongqingfundamentalresearchfundsproject（2012cstc-jbky-01706，2012cstc-jbky-01708).Correspondauthor:YangLiu,Tel:86-23-86714517,E-mail:lily882@基金项目：重庆市基本科研业务费计划项目（2012cstc-jbky-01706，2012cstc-jbky-01708）通讯作者：杨柳，电话：（023）867145178，E-mail:lily882@

唐氏综合征（Down'ssyndrome，DS），又称21三体综合征或先天愚型，是最常见的染色体病之一，其主要表现为智力障碍，多伴有严重的心脏病及多发畸形[1]。其发生的主要机制是由于多出的21号染色体某一区段上基因的表达过量造成[2]。国内外研究表明，在染色体异常疾病中，DS的发病数量占首位，约占所有染色体疾病的91.60%；同时DS在新生儿中发病率约为1/800～1/600，这给家庭和社会带来沉重负担[3-4]。目前诊断DS主要以细胞遗传学技术为主，但所需时间长，对专业人员的自身技术要求高。随着疾病诊断技术的飞速发展，基因探针技术、PCR技术、生物芯片技术等相继被应用于多种遗传疾病的诊断。荧光定量PCR分析短串联重复序列(shorttandemrepeat，STR)，因其快速、准确、相对便宜,成为国外最常应用的快速产前诊断方法之一。但由于荧光定量PCR只能针对目标染色体的数目异常,故不能完全替代传统核型分析[5-6]。另外，目前DS筛查仍主要用化学发光法进行血清生化标志物甲胎蛋白、游离雌三醇和绒毛膜促性腺激素浓度测定，利用专门风险评估软件分析，假阳性和假阴性都比较高[7]。全基因组拷贝数变异分析尽管能很好反应基因组变异情况，但成本高，检测时间也较长。因此，本研究特定针对21号染色体，选取遗传信息高的多个STR基因座，通过多重荧光定量PCR技术复合扩增疑似唐氏综合征患儿家庭样本和正常样本，利用ABI3130遗传分析仪检测；同时比对其外周血染色体核型分析结果，评价多重荧光定量PCR技术在唐氏综合征筛查中的准确性及其应用价值。1资料与方法1.1样本212名重庆地区无关汉族个体的血样均来自重庆市正鼎鉴定所日常工作积累，用于构建基因座等位基因分型标准物及评价基因座的多态性。以去离子水为阴性对照，已知核型正常样本为阳性对照；6个疑似21三体综合征患儿家庭血样（共18个样本）为待测样本，样本来源于重庆市人口和计划生育科学技术研究院病残儿鉴定，疑似患儿具有类似唐氏综合征的临床特征，需进行染色体核型检测确认是否唐氏综合征。每个样本采集4-5ml全血，EDTA-Na2抗凝，4℃1.2方法1.2.1DNA提取采用全血基因组DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA。1.2.2多重荧光PCR扩增根据GenBank里面的序列，采用Primer5.0和Oligo6.0软件，设计D21S1409、GATA163G03、D21S1422、D21S1435这4个基因座的特异性引物，经Blast后，由英骏公司合成荧光引物，引物序列及荧光标记见表1。反应体系为25µl,含H2O9.875µl,混合引物1µl、Taq酶0.125µl、dNTP和Buffer-MgCl2混合物12.25µl、DNA1.5µl。PCR反应条件为95℃预变性5min；94℃30s、60℃30s、72℃45s,共30个循环；最后表1引物序列及荧光标记基因座引物序列(5’荧光染料名称荧光颜色D21S1409F:GGAGGGGAATACATTTGTGTAGGTAR:CTCTTTGTCTCTTGGAACATACGC6-FAM蓝色GATA163G03F:GAGGGTTCCCTAGAGAGACAGATR:CTCAAGACTCAAACTGGCTCTCT6-FAM蓝色D21S1422F:GCACCCCTTTATACTTGGCTGTR:AAGACTTCTCGATCTCCAGAATCACAlexa

Fluor532绿色D21S1435F:CCTCTCCAATTGTTTGTCTACCCTR:GCAAGAGATTTCAGTGCCATCAAGAlexa

Fluor546黄色1.2.3ABI3130遗传分析仪检测将1µlPCR产物与9µl混合物（甲酰胺和Liz500）加入上样板中，经95℃变性5min、4℃10min后通1.2.4等位基因分型标准物的制备根据检测的4个基因座多态情况，分别制备等位基因分型标准物后混合，作为多重等位基因分型标准上样，每一批上样样本中至少添加一个等位基因分型标准物,见图1。图14个基因座等位基因分型标准物图1.2.5数据分析利用GeneMapperIDv4.0软件对数据进行分型。应用Modified-powerstate、SPSS18.0软件进行数据统计及Hardy-Weinberg平衡吻合度检验（p-value＞0.05符合Hardy-Weinberg平衡），得出4个STR基因座的等位基因及基因型频率、各基因座的观察杂合度(Ho)、理论杂合度(He)、匹配概率（Pm）、个体识别率（DP）、多态性信息含量(PIC)、非父排除率(PE)等相关量值。每个STR基因座检测出现约1:1:1等比例峰或2:1(或1:2)峰为相应染色体的三倍体，出现单峰为无意义峰，两个峰值比例在大于0.65或小于1.8间或图形难以判断属于不明确意义峰[8]。本研究判定单样本出现1个等比例三峰或1个以上2:1(1:2)峰为筛查结果阳性，其余为筛查阴性结果。结果1.3.1基因频率及群体遗传数据重庆地区汉族群体这4个STR基因座基因频率分布见表2，基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。各基因座遗传学参数统计分析结果见表3。通过SPSS18.0分析表3可见，本研究的4个STR基因座的观察杂合度为0.731±0.051，理论杂合度为0.725±0.035；匹配概率值为0.128±0.028，多态信息含量值为0.68±0.086；个体识别能力和非父排除率值分别为0.872±0.028和0.491±0.084。可见，4个基因座的杂合度(H＞0.64)、识别能力(DP＞0.802)和信息量(PIC＞0.58)均较高。表2重庆地区汉族群体4个STR基因座的等位基因及基因频率（n=212）D21S1409GATA163G03D21S1422D21S1435AFAFAFAF90.434080.002440.004760.0967100.009490.025950.014270.3255110.0094100.221760.073180.2311120.1887110.450570.103890.2406130.3585120.235880.2406100.0943130.044890.3090110.0118140.0118100.1580150.0071110.0684120.0212130.0071140.0047150.0142注：A—等位基因；F—基因频率表34个STR基因座的遗传学数据（n=212）基因座等位基因数基因型数HoHePmDPPICPEp-valueD21S14095110.6460.6470.1980.8020.580.3500.935GATA163G038190.6420.6890.1420.8580.640.3440.118D21S142212310.8350.8000.0700.9300.770.6650.230D21S14356160.8020.7640.1010.8990.730.6030.219注：Ho观察杂合度；He理论杂合度；Pm匹配概率；DP个体识别能力；PIC多态信息含量；PE非父排除率.1.3.2待测样本的检测结果及染色体检查结果18个样本的4个STR基因座的分型结果峰形均较好，清晰，可清楚判型。18个样本的染色体核型结果由重庆市人口和计划生育研究院实验中心检测提供。2～6号家庭的疑似患儿均出现三个检测峰，1号家庭患儿虽然没有出现三峰，但是D21S1422基因座检测结果8与10的峰值比为3：1，可判定为阳性。根据所检测的结果对待测样本进行判定，提示这6个家庭的小孩均为21三体综合征，而他们的父母为正常的。这与染色体检查结果相一致(表4、图2)。表4待测样本的检测结果及染色体检查结果序号染色体核型基因型D21S409GATA163G03D21S1422D21S14351F46,xy9，1211，118，97，8M46,xx9，1111，129，108，9C47,xy,+21/46,xy9，911，118，10（3：1）8，82F46,xy9，910，107，97，8M46,xx9，1311，128，87，9C47,xy,+219，1310，11，127，87，8，93F46,xy9，1311，118，117，7M46,xx12，1310，119，107，7C46,xy/47,xy,+219，12，1310，119，10，117，74F46,xy12，1312，129，97，7M46,xx13，1310，107，88，9C47,xy,+2112，1310，127，8，97，8，95F46,xy9，1312，139，118，9M46,xx9，1211，128，87，8C47,xx,+219，1310，115，6，97，8，106F46,xy9，1311，116，97，9M46,xx9，1212，127，107，10C47,xx,+219，12，1311，126，7，107，10（2：1）注：F—父亲；M—母亲；C—小孩图26号家庭父（F）、母（M）、子（C）的检测分型图1.4讨论唐氏综合征是一类以特异性容貌和器官畸形为特征的染色体常见病，是人类最常见的染色体疾病，也是出生缺陷和遗传性智障最常见的形式。约90%是由于减数分裂时21号染色体不分离而形成的21三体，约有2%～3%是由于唐氏综合征致病基因关键区域发生了染色体隐蔽性重复所致[9]。经典的检验方法是取患者外周静脉血培养，制备染色体，经胰酶分带，吉姆萨染色，经染色体图像分析系统摄影分析，进行染色体鉴定。这种方法费时费力，方法繁琐，检验周期长(一般需要1～2周)。由于该病的发病机制是染色体异常所致，所以针对患者、疑似患者或胎儿的遗传基因进行鉴定是最直接的方法。全基因组拷贝数分析可以对全基因组拷贝数变异进行分析，但是该方法依赖公司芯片及大型分析设备，成本高，操作复杂，数据信息量大以致于分析相对复杂。本研究所采取的方法，原理类似从全基因组探针中挑取出针对21号染色体部分探针，这样可以过滤很多无关数据，检测迅速，分析简单，最快在1天内即可完成。STR通常是由2～6个碱基对作为核心单位，串联重复核心序列而成的一类DNA序列，由于核心重复序列拷贝数的变化构成了STR位点高度的遗传多态性，它在人类基因组中广泛分布，是遗传分析中常用的一类遗传标记。目前研究也表面STR是PCR检测染色体数目异常最方便的遗传标记[10]。本研究中所选取的D21S1409、D21S1435基因座据报道的多态性信息含量分别为0.632和0.710；杂合度分别为0.69和0.75[11]，本研究结果与我们在重庆地区汉族人群检测结果基本相同，另外选择的两个位点GATA163G03和D21S1422也具有很好的遗传信息。我们研究表面21号染色体上这4个基因座（D21S1409、GATA163G03、D21S1422和D21S1435），通过设计特异性的荧光引物复合扩增后采用ABI3130检测，均发现特异性的检测峰——1:1:1等比例峰或2:1(或1:2)峰现象，与染色体核型分析诊断结果进行比对，判别一致。通过本研究提示我们选择第21号染色体上的遗传标记，采用多重定量PCR技术检测第21号染色体的数目，可快速筛查确诊唐氏综合征，该技术不仅可以进行产前诊断，甚至应用于产前普查。但是由于我们病历数较少，后期仍然需要扩大样本检测量和检测有效基因座的数目进一步验证和规范基因型判定和定量分析标准，参考文献：[1]胡美红,刘雨生,何国平,等.羊水细胞培养及染色体核型分析在产前诊断中的应用[J].临床输血与检验,2011,13(1):23-25.[2]王志敏,杜绍敏.唐氏综合征系列产前筛查对优生优育必要性的临床研究[J].中国伤残医学,2010,18(1):57-58.[3]Ulate-CamposA,NascimentoA,OrtezC.Down’ssyndromeandepilepsy[J].RevMedIntSindrDown,2014,18(1):3-8.[4]SunL,FanZQ,WengXJ,etal.RapiddetectionofDown'ssyndromeusingquantitativereal-timePCR(qPCR)targetingsegmentalduplicationsonchromosomes21and11[J].Gene,2014,552:272–276.[5]WendyH