PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测

阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测

李智伟第一页，共三十七页。PNH

(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria)是一种罕见的获得性克隆造血干细胞疾病。但近年来有增多趋势。我国北方多于南方。半数以上发生在20-40岁青壮年。男性多于女性，与遗传及种族无关。本病起病隐袭缓慢，呈慢性过程，以贫血、出血为首发病症者较多，以血红蛋白尿起病者较少。第二页，共三十七页。第三页，共三十七页。血红蛋白尿

睡眠有关，早晨较重，下午较轻

尿液外观为酱油或红葡萄酒样;伴乏力、胸骨后及腰腹疼痛、发热等

第四页，共三十七页。原因因为补体作用最适宜的pH是6.8～7.O，而睡眠时呼吸中枢敏感性降低，酸性代谢产物积聚

第五页，共三十七页。第六页，共三十七页。研究历史Strubing第一次报道PNH

Ham和Dingle证明了PNH患者的红细胞在血清酸化条件下，易发生溶血，这就是现在普遍使用的Ham实验1983年证实PNH患者GPI合成异常1993年pig-a基因突变第七页，共三十七页。流式细胞术

原理：X染色体上PIG-A〔造血干细胞经获得性体细胞基因〕突变导致糖化肌醇磷脂(GPI)锚合成障碍导致由GPI锚接在细胞膜上的一组膜蛋白丧失，包括CD16、CD55、CD59等第八页，共三十七页。第九页，共三十七页。GPI锚连接蛋白补体调接蛋白衰变加速因子(DAF或CD55)、膜攻击复合物抑制因子(MACIF或MIRL或CD59)、补体C8结合蛋白(HRF或C8bp)、膜辅助蛋白(MCP)。

粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-3(LFA-3或CD58)、Blast-1/CD48、CD67、CD66。第十页，共三十七页。GPI锚连接蛋白酶类红细胞乙酰胆碱脂酶(AchE)、中性粒细胞碱性磷酶酸酶(NAP)、5’外核酸酶(CD73)。受体类中性粒细胞III型Fc受体(FcRIIIb或CD16)、单核细胞分化抗原(CD14)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(u-PAR)。血型抗原CD55携带的Comer抗原、AchE携带的Yt抗原。第十一页，共三十七页。1型细胞CD59完全阳性第十二页，共三十七页。补体激活途径C1C1C2,C4C4b2b(C3转化酶〕C3C3bP〔备解素〕PC3bBbC3bB

(C5转化酶〕C4b2b3b或PC3bBbC8C9C6C7C5C5bC5b678C5b-9(MAC)CD59替代途径经典途径CD55Ag-Ab第十三页，共三十七页。分析1.红系及粒系FSC/SSC设门 报告标本中CD55、CD59阴性比例第十四页，共三十七页。做20~30份正常人血样划定阳性区〔Ⅰ区〕范围同型阴性对照界定Ⅲ区范围，中间的区域即为Ⅱ区。第十五页，共三十七页。第十六页，共三十七页。根据CD59可以将PNH细胞分为3型1型细胞CD59完全阳性正常细胞2型细胞CD59局部阳性补体中度敏感细胞3型细胞CD59完全阴性补体敏感细胞第十七页，共三十七页。第十八页，共三十七页。第十九页，共三十七页。第二十页，共三十七页。CD55和CD59同时局部或完全缺失是PNH的典型表现，单GPI缺失不能确诊。CD59重要性大于CD55单CD55缺乏时并不因此改变红细胞对补体的敏感性而造成溶血CD59的缺失会增加补体的敏感性临床上以CD59缺失作为诊断标准是一个趋势。解决了一切以补体溶血为根底的实验诊断方法在诊断PNH的不确定性意义第二十一页，共三十七页。其它细胞的PNH检测PNH患者的红细胞、粒细胞、单核细胞及淋巴细胞上GPI锚连膜蛋白局部或全部丧失。粒细胞>单核细胞>淋巴细胞>红细胞骨髓PNH克隆出现比外周血早，网织红细胞略早于红细胞第二十二页，共三十七页。其它细胞的PNH检测应用FSC/SSC设门分析时会有许多脱颗粒的中性粒细胞，这时只使用物理特征无法准确设定粒细胞门了，这时必须使用系列标志/SSC设门:CD15，CD33。CD64设门，分析单核CD14,CD55,CD59，PNH病人检测GPI缺乏的血小板不容易分辨不能只根据淋巴细胞上GPI相关蛋白的表达来诊断。

第二十三页，共三十七页。与其他实验比较1.酸溶血试验(Ham试验)患者红细胞与含5%盐酸的正常同型血清混合，pH6.4，37℃孵育2小时，溶血明显。本试验特异性高，敏感性差。2.蛇毒因子溶血试验蛇毒因子能通过补体交替途径，使补体敏感的红细胞发生溶血。本试验特异性强，敏感性优于酸溶血试验。3.热溶血试验和蔗糖溶血试验

因特异性差，常作为筛选方法。第二十四页，共三十七页。具有PNH克隆的血液病

检测粒细胞GPI锚连蛋白表达

病种检测例数缺失例数(%)AA11525(22%)MDS399(23%)并发现MDS有PNH表达者ATG〔人胸腺细胞免疫球蛋白〕治疗有效

(AnInternMed1999，131:401)第二十五页，共三十七页。PNH和AA关系相当密切，可以相互转化且并存AA→PNH较多(15%)，PNH→AA少20%`~30%PNH可伴骨髓再障AA(ATG治疗后)→PNH10~31%AA-PNH综合征16.5%(我国)50%AA外周血或骨髓可检出PNH克隆AA→PNH生存率要高于PNH→AAMDS-RA如捡出PNH克隆者预后好，且ATG(人胸腺细胞免疫球蛋白)治疗有效。PNH对AA和MDS的“自然治疗〞，而“AA救了PNH〞。第二十六页，共三十七页。PNH克隆见于淋巴增殖性疾病检测病种例数

NHL87HD55红细胞CD55/CD59CLL49缺失检出率9.2%ALL22HCL4

(HematolJ2001，2:33)

第二十七页，共三十七页。PNH克隆见于浆细胞病检测红细胞CD55/CD59缺失

病种检测例数缺失例数(%)MM626WM72MGUS61HCD21

合计7710(12.9%)

(IntJHematol2002,75:40)第二十八页，共三十七页。FLAER嗜水气单胞菌溶素变异体(FLAER)。1998年Diep等报道嗜水气单胞菌(HEC)毒素能特异地与细胞膜上GPI锚连蛋白结合，随后立即聚合成多具体，插入细胞膜脂质双层，在膜上形成孔洞致溶破。PNH细胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持细胞完好。第二十九页，共三十七页。FLAERFLAER在所有具有GPI锚连蛋白的白细胞上都有特异性表达，所以正常人及非PNH贫血FLAER成100%阳性。是目前诊断PNH最敏感、特异的方法。FLAER对PNH克隆检出的敏感性为0.1%，其它靶向标记检出率的敏感性为1%；第三十页，共三十七页。结果分析1.设门CD45/SSC2.标记CD15，CD14，CD45，FLAER 检测PNH粒、单核及淋巴细胞，报告标本中各系细胞FLAER阴性比例第三十一页，共三十七页。第三十二页，共三十七页。第三十三页，共三十七页。FLAER目前FLAER一般用于有核细胞的检测，不能评价红细胞的PNH克隆。由于红细胞外表没有气单胞菌溶素前体产生所需要的蛋白水解酶类，尽管表达在红细胞外表的血型糖蛋白不是锚连蛋白，但是由于血型糖蛋白与气单胞菌溶素前体结合力较弱，因此限制了FLAER在红细胞中的应用。第三十四页，共三十七页。与CD55、CD59比较，Flaer对PNH患者对中性粒细胞的测定最为清晰、准确临床上高度疑心，而CD55、CD59不能确诊的病例，可以结合F1aer检查，获得明确诊断第三十五页，共三十七页。谢谢！第三十六页，共三十七页。内容总结阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测。做20~30份正常人血样划定阳性区〔Ⅰ区〕范围。CD55和CD59同时局部或完全缺失是PNH的典型表现，单GPI缺失不能确诊。本试验特异性强，敏感性优于酸溶血试验。3.热溶血试验和蔗糖溶血试验因特异性差，常作为筛选方法。PNH细胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持细胞完好。谢谢第三十七页，共三十七页。养素过量与中毒维生素A可以促进生长、保护上皮组织，对防治皮肤干燥、眼干、夜盲症有一定的作用。超量摄入可导致中毒。人体摄入过量的维生素A所引起中毒综合征，称维生素A中毒。最早报道于16世纪90年代,北极探险者食用了含有大量维生素A的北极熊肝后数小时发生头痛、呕吐、嗜睡等症状，近年来，国内由于滥用维生素A浓缩剂,产生中毒症状者也时有报道,值得重视。病因成人多为食用含维生素A极高的食物,如鳕鱼、北极熊的肝等；儿童则多因意外服用大剂量维生素A补充剂而引起。

急性维生素A中毒多在食用后3-6小时发病。多发生于一次或多次连续摄入成人膳食推荐摄入量(RNI)的100倍，或儿童大于其RNI的20倍。临床表现1.急性中毒：表现为食欲减退、烦躁或嗜睡、呕吐、前囱膨隆、头围增大等。颅内压增高在急性中毒中较常见。

2.慢性中毒：早期出现烦躁、食欲减退、低热、多汗、脱发，以后有典型的骨痛症状，呈转移性疼痛，可伴有软组织肿胀，有压痛点而无红、热征象，以长骨及四肢骨多见，由于长骨受骨骺包埋，可导致身材矮小。孕妇维生素A中毒可导致胎儿畸形。

治疗：应立即停服维生素A。预防：遵守医嘱，不可过量或过长时间摄入；积极宣传营养卫生常识，改变滥用维生素A制剂的现象及不良的饮食习惯。防止医源性维生素A中毒的发生。儿童防治维生素D缺乏性佝偻病应采用单纯维生素D制剂，避免使用维生素A、维生素D合剂;

孕妇要防止维生素A摄入过量。我国制定的维生素A可耐受最高摄入量(UL)3000μgRE。维生素D过量与中毒病因

短期内多次给予大剂量的维生素D治疗维生素D缺乏病;维生素D预防剂量过大，每日摄入量过多，或在数月内反复肌注大剂量的维生素D;误将其他代谢性骨骼疾病或内分泌疾病诊断为维生素D缺乏病而长期给予以大剂量维生素D治疗。维生素D中毒剂量的个体差异较大，一般小儿每日服用2万-5万IU，连续数周或数月即可发生中毒；敏感小儿每日服用4000IU，连续1-3个月即可中毒。临床表现患儿服用过量维生素D制剂后，最早出现的症状是食欲减退甚至厌食，烦躁、哭闹、精神不振，多有低热。可有恶心、呕吐、腹泻或便秘，逐渐出现烦渴、尿频、夜尿多，偶有脱水或酸中毒。长期慢性中毒可致骨髓、肾、血管、皮肤出现相应的钙化，影响体格和智力发育，严重者可致死。治疗对维生素D中毒要积极治疗。第一，应立即停服维生素D制剂及钙剂。第二，避免晒太阳，采用低钙饮食。第三，重症患者需输液，服用利尿剂，以加速排出。第四，口服肾上腺皮质激素(如氢化可的松)，有利于减弱维生素D的作用，服至血钙正常为止。凡维生素D中毒症，全部治疗必须在医师严格指导下进行。预防全面分析患儿佝偻病的轻重程度，不要仅因出汗多，或有出牙晚、走路迟、烦躁、枕秃、体弱中的一两项就误认为佝偻病而给予大剂量突击治疗。家长在给孩子服维生素D制剂时应按医生的嘱咐，严格掌握预防或治疗用量，服用维生素D期间应随时观察孩子服药后的表现，一般每3个月测定血钙一次，如出现中毒表现，立即去医院就诊。儿童保健工作者应宣传切勿滥用维生素D制剂，对佝偻病的防治应强调经常户外活动和接受日光照射，不能因缺钙而反复注射维生素D。氟过量与中毒氟的慢性中毒主要发生于高氟地区，称为地方性氟病，主要造成骨和牙的损害，即所谓氟骨病和氟斑牙，在我国黑龙江、吉林、辽宁、北京、天津、山西、陕西、河南、山东、宁夏、贵州等地均有流行。氟斑牙多见于儿童，随年龄增长而病‘情加重；氟骨症多侵犯成年人，并随年龄增长而发病率增高、病情加重，性别差异不显著。地方性氟病的主要发病因素1.饮用高氟水：病区分布最广、患病人数最多的一型。2.燃煤污染：明火烧含氟高的煤3.食用高氟食品：如食盐、粮食、茶叶等高氟4.工业三废污染临床表现(一)氟斑牙受损害时间是恒齿生长期，到恒齿钙化后即不再受损害。临床上分为三型:1.白垩型——牙齿表面失去光泽，粗糙似粉笔，触之有细沙感，可呈点状或线状，或为不规则小片;重者可波及牙的整个表面，非白墓区呈淡白浅黄色。

2.着色型——表面出现微黄色，逐