毒理学第四章毒作用机制

公共卫生学院

第四章毒作用机制化学毒物1.吸收、分布、代谢、排泄，转运至靶部位2.与靶分子相互作用3.分子、细胞、组织功能失调、结构损伤4.机体修复功能失调毒性毒物如何进人机体、如何与靶分子交互作用、机体如何应对侵害，对于评价特定化学物的潜在危险性具有重要价值。ADME

第一节毒物的ADME过程与靶器官第二节靶分子的反应第三节细胞调节功能障碍第四节修复障碍第一节毒物的ADME过程与靶器官一、从接触部位进入血液循环二、从血液循环进入靶部位三、增毒与解毒(一)毒物的吸收

主要方式:简单扩散主要影响因素(1)化学物的性质：结构和理化性质

脂溶性(2)接触部位的性质接触面积

、上皮特征、上皮下微循环

一、从接触部位进入血液循环(二)毒物进入体循环前的消除经胃肠道吸收外源化学物通过门静脉系统首先达到肝脏，进行生物转化后，再进入体循环。胃肠道黏膜也起一定的消除效应

首过消除（firstpasselimination）

（1）毛细血管内皮多孔性肝窦和肾小管周毛细血管有较大孔道，与蛋白质结合化学物通过，肝肾蓄积。（2）专一化的膜转运

专一化离子通道和膜转运蛋白转运毒物进入靶部位。铅等重金属通过离子通道。

（3）细胞器内蓄积化学物质子化蓄积在溶酶体和线粒体，并损伤细胞。（4）可逆性细胞内结合

黑色素是胞内多聚阴离子芳香族聚合物，结合阳离子及多环芳烃等二、从血液循环进入靶部位(一)促进毒物分布到靶部位的机制

（1）血浆蛋白结合化学物与血浆蛋白结合，不易透过毛细血管

（2）专一化屏障

血脑屏障和胎盘屏障

（二）

妨碍毒物分布到靶部位的机制

（3）贮存部位的分布某些部位是贮存库,而不是靶器官

（4）与细胞内结合蛋白结合镉、汞中毒与金属硫蛋白（MT）结合

（5）从细胞内排出血脑屏障中多药耐药蛋白将化学物从细胞内排出(三)排泄与重吸收

肾和肝仅能有效清除高亲水性和离子化的化学物（如：有机碱和有机酸）①只有溶于血浆的化学物可通过肾小球滤过；②肝细胞和肾近曲小管的转运蛋白专一性排泄高亲水性的有机酸和有机碱；③只有亲水性化学物无约束地溶于尿与胆汁；④脂溶性化学物易于通过穿细胞扩散而被重吸收。1.排泄２.重吸收肾小管经扩散重吸收的过程需要化学物有一定的脂溶性。

在肠腔中能被转变为脂溶性较强的化学物才有可能从肠道重吸收。

三、增毒与解毒（一）

终毒物（ultimatetoxicant）的形成1.终毒物

指直接与内源靶分子反应或引起机体生物学微环境的改变、导致机体结构和功能紊乱并表现毒物毒性的物质。亲电子剂、自由基、亲核物、氧化还原性反应物。

2.增毒（toxication）

外源化学物在体内经生物转化为终毒物的过程原外源化合物作为终毒物铅离子，河豚毒素，TCDD，异氰酸甲酯，HCN，CO外源化合物的代谢物作为终毒物苦杏仁苷→HCN，砷酸盐→亚砷酸盐氟乙酰胺→氟柠檬酸，1，2－亚乙基二醇→草酸，乙二酸己烷→2，5－己二酮，乙酰氨基酚→N－乙酰－p－苯醌亚胺CCl4→CCl3OO·，苯并（a）芘（BP）→BP自由基阳离子苯并（a）芘（BP）→BP－7，8－二醇－9，10－环氧化物活性氧或活性氮作为终毒物过氧化氢敌草快，阿霉素，呋喃妥英→羟基自由基（HO·）Cr（Ⅴ），Fe（Ⅱ），Mn（Ⅱ），Ni（Ⅱ）→过氧亚硝基（ONOO－）百草枯→O2－

＋NO·内源化合物作为终毒物磺胺类药物→白蛋白结合的胆红素→胆红素CCl3OO·→不饱和脂肪酸→脂质过氧自由基CCl3OO·→不饱和脂肪酸→脂质烷氧自由基CCl3OO·→不饱和脂肪酸→4－羟基壬醛HO·→蛋白质→蛋白羰基终毒物的来源及其类型

指含有一个缺电子原子（带部分或全部正电荷）的分子。缺电子的物质具有亲电子的性质。概念1．亲电子剂

亲电子剂——带正电（喜欢带负电的）

亲电子中的正电荷容易通过共享电子对的方式与亲核剂中富含电子发生原子反应。（1）外源化学物通过插入一个氧原子而生成亲电子剂，插入的氧原子从其附着的原子中获得一个电子，使其具有亲电性。氧原子电负性强，相邻碳显正电

氧原子是非金属元素，原子最外层上的电子数目为6个，在化学反应中较易得到电子，而使最外层达到8个电子的相对稳定结构。亲电物的形成

外源化合物被细胞色素P-450或其他酶氧化成醛、酮、环氧化物、芳烃氧化物、亚砜类、亚硝基化合物、膦酸酯和酰基卤类等亲电子剂均是通过上述过程形成黄曲霉毒素B1-8,9-环氧化物BP-7,8-二醇-9，10-环氧化物敌敌畏苯并(a)芘[benzo(a)pyrene，BaP]

P-4507,8-环氧苯并(a)芘7,8-二羟-BaP7,8-二羟基-9,10-环氧BaP环氧化物水解酶(终致癌物)（2）另一种情况是共轭双键形成。共轭双键是以由一个单键隔开的两个双键,以C=C-C=C表示，一个C被O取代，通过氧的去电子作用而被极化，使得双键碳之一发生电子缺失。α、β-不饱和醛和酮

(3)化学键的异裂作用产生阳离子亲电子剂

7，12-二甲基苯并蒽苄基醇

酯化

异裂反应苄基正碳离子自由基（freeradicals）是在其外层轨道中含有一个或多个不成对电子的分子或分子片段。

化学物通过①接受一个电子或②丢失一个电子或③共价键均裂而形成自由基。其共同特点是：其化学性质十分活泼、反应性极高，半减期极短，一般仅能以μS计，作用半径短。

2.自由基(1)概念共价键均裂甲基自由基CH3

·则为一个不稳定的结构甲烷(CH4)是一个稳定的化合物·H

+

自由基含奇数电子，不成对，欲寻求其他电子来配对，因此会把别的物质氧化。寻找能与自己结合的另一半(2)自由基类型与生物体有关的自由基最主要的是氧中心自由基

“氧气在参与生命活动的同时也产生氧自由基，引起细胞损伤，导致疾病发生，氧气是一切氧自由基的来源和引起氧自由基损伤的物质基础”。

氧自由基的来源——O2生物体内最重要的自由基是超氧阴离子（O2－·

）和羟基自由基（·OH）

O2－·的生成是其他自由基或活性氧生成的基础;OH·是活性氧中毒性最强的一种O2-·的生成是其他自由基或活性氧生成的基础,性质活泼，具有很强的氧化性和还原性，既是氧化剂，又是还原剂.1)超氧阴离子（O2－·）

外源性

内源性O2－•主要来源于巨噬细胞和粒细胞呼吸爆发,线粒体电子传递链解偶联状态也产生O2－•。O2-·通过非自由基中间产物生成两类其他自由基过氧亚硝基羟基自由基Fe3++O2¯

→O2+Fe2+(1)Fe2++H2O2→Fe3++OH+OH(2)O2¯+H2O2→O2+OH+OH(3)生成羟基自由基的反应(Fenton反应)2)羟基自由基(OH)

·OH是活性氧中毒性最强的一种,比高锰酸钾的氧化性还强，是氧气的三电子还原产物，反应性极强，它几乎可以和所有细胞成分发生反应，对机体危害极大，但寿命短．

1894年,法国人HJH

Fenton发现（3）自由基的来源

内源性

1）呼吸爆发

2）新陈代谢即人体生化反应产生。从大气吸进O2，与食物消化后进入血液里的葡萄糖进行化学反应，产生ATP。正常生化过程中，常有2％左右的氧误入歧途，变成化学性质极其强烈的氧自由基。2)外源性

氧化还原循环

辐射、农药、食物添加剂、酒精、吸烟等外来因素引发的自由基吞噬细胞在吞噬病原菌后，出现有氧代谢活跃、氧耗急剧增加，通过氧的部分还原作用产生一组高反应性的杀菌物质的过程，称为呼吸爆发。1)内源性自由基来源(1)——呼吸爆发

呼吸爆发过程，激活细胞膜上的还原型辅酶Ⅱ（NADPH氧化酶），分子氧活化，生成活性氧。这些物质具有强氧化作用或细胞毒作用，可有效地杀伤病原微生物。

1)内源性自由基来源(2)

——

线粒体电子传递过程能生成ROS图线粒体内单电子还原生成氧自由基增加2)外源化学物来源

——氧化还原循环

许多外源化学物可通过各种途径形成自由基，但其中最主要“氧化还原循环”（redoxcycling）通过加入一个单电子使化学物还原为不稳定的中间产物，随后这个电子转移给O2而形成超氧阴离子自由基(O2·)，而中间产物则再生为原化学物。外源化学物的氧化还原代谢图醌还原过程涉及氧化还原循环我国约有3.3亿烟民，占我国人口的25%，占世界吸烟人数的1/3.

目前已鉴定出香烟中含有化学物质近5000种，每支香烟烟气中约含有7×1014个自由基。烟气中的自由基被认为是烟气中的三大杀手（自由基、亚硝胺和苯并[a]芘）之一。吸烟可产生自由基1)对生物膜的破坏(4)自由基的危害

生物膜内含有脂质。自由基对人体攻击首先是细胞膜。

自由基是脂质过氧化作用的引发剂，自由基与脂类中的饱和脂肪酸（RH）发生化学反应，从而引发连锁反应，使脂类分子末端发生脂质过氧化（ROOH），导致不同程度的破坏。

膜成分的改变膜脂流动性的改变膜上酶的活性膜通透性的改变

自由基作用于细胞膜，引起细胞膜结构和功能的改变2)对蛋白质和酶的损害分子结构改变，可使蛋白质变性。蛋白质断裂蛋白质-蛋白质交联-S-S-CH3-S-O二硫交联脂质-蛋白质交联氨基酸氧化3)对核酸的损害

自由基攻击DNA，导致细胞遗传信息的转变。自由基自由基自由基是“万病之源”

由氧自由基引发的疾病多达60多种。

自由基脂质过氧化反应蛋白质交联胶原蛋白的交联聚合会使胶原蛋白破坏、弹性降低,皮肤衰老、出现皱纹脂褐素,黄褐色不规则小体，溶酶体作用后剩下不能被消化的物质形成的残余体,其中50%为脂质.沉积在皮肤，皮肤粗糙、黯淡、无光，出现色斑老年斑

沉积在脑细胞，记忆力下降、头脑混沌、睡眠质量下降沉积在晶状体细胞，使其退化变性，视力障碍沉积在血管壁上就会形成动脉粥样硬化等自由基与衰老较少见苦杏仁经肠道细菌β-糖苷酶催化形成氰化物；丙烯腈环氧化和随后谷胱甘肽结合后形成氰化物；硝普钠经巯基诱导降解后形成氰化物；CO是二卤甲烷经过氧化脱卤的有毒代谢产物；硒化氢是由亚硒酸盐与谷胱甘肽或其他巯基反应形成的。3.亲核物4.活性氧化还原反应物一种特殊的产生氧化还原活性还原剂的机制。硝酸盐通过肠道细菌还原亚硝酸酯或硝酸酯与谷脱甘肽反应亚硝酸盐

（二）解毒消除终毒物或阻止终毒物生成的生物转化过程称为解毒（detoxication）。

1.无功能基团毒物的解毒2.亲核物的解毒3.亲电子剂的解毒4.自由基的解毒5.蛋白质毒素的解毒6.解毒过程失效

1.无功能基团毒物的解毒

无功能基团的化学物如苯、甲苯以两相方式解毒。

Ⅰ相反应Ⅱ相反应生物转化氧化反应还原反应水解反应结合反应肝、肺胃、肠和皮肤2.亲核物的解毒

Ⅱ相反应——结合反应羟基化合物与硫酸或葡萄糖醛酸的结合巯基化合物通过甲基化或与葡萄糖醛酸的结合胺类和肼类化合物通过乙酰化氰化物在硫氰酸酶作用下生成硫氰酸是亲核物解毒的一种特殊机制。

3.亲电物的解毒

亲电物解毒一般是与巯基亲核物谷胱甘肽结合。可自发发生，也可由谷胱甘肽-S-转移酶催化。金属离子如Ag+、Cd2+、Hg2+和CH3Hg+离子易于通过谷胱甘肽解毒。

亲电物解毒的特殊机制包括：环氧化物水化酶催化环氧化物和芳烃氧化物分别生成二醇类和二氢二醇类化合物。4.自由基的解毒抗氧化酶低分子清除剂抗氧化酶过氧化氢酶(CAT)过氧化物酶（GPO）超氧化物歧化酶MnSODCuZnSOD超氧物歧化酶(SuperoxideDismutase简称SOD)三种酶组成完整的防氧链条抗氧化酶的作用低分子清除剂胞浆：还原性辅酶Ⅱ细胞内外水相：半胱氨酸、VitC、谷胱甘肽细胞脂质：VitE、VitA2.自由基检测化学发光法、电子自旋共振技术、荧光法等1自由基相关酶的测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及谷胱甘肽过氧化物酶（GPO）自由基检测方法中科院化学研究所自由基与生命科学研究室/index.htm美国《时代杂志》票选而出的10种抗氧化标兵1号标兵─

番茄火力最强。番茄含有丰富茄红素，其抗氧化能力是Vitc的20倍。小番茄，熟吃。2号标兵─葡萄

籽花青素抗氧化能力是Vitc的20倍、E的50倍。葡萄酒因发酵，抗氧化能力↑3号标兵─绿茶火力同样猛烈，同时还去油解腻、清新口气。坚持饮用，既抗老化，又有能减肥。4号标兵─鲑鱼唯一上榜的肉类。因含有超强的omega-3多元不饱和脂肪酸，所以有强的抗氧化功效，而一般家禽或家畜的肉类，因其中omega-6多元不饱和脂肪酸的比例较高，会影响其抗氧化功能。5号标兵─坚果富含VitE的坚果类除具有抗氧化功能之外，还能修护皮肤组织。但坚果类高脂，如摄取过量，不但有致胖危险，由高脂所造成的氧化反应还会损害VitE抗氧化作用。因此，摄取要适量。

美国《时代杂志》票选而出的10种抗氧化标兵6号标兵─花椰菜除含有丰富的VitA、C外，还含有一种特有的抗氧化物质，几乎集所有抗氧化物于一身，而且还是抗癌明星7号标兵─蓝莓莓类富含β胡萝卜素以及Vitc。另外它所含有的钾及水溶性纤维，还能降低血胆固醇浓度及减少患高血压的几率。8号标兵─大蒜

不但有抗氧化功效，还促进血液循环和新陈代谢，降低胆固醇，预防高血压及心血疾病。吃过大蒜后喝杯牛奶可除蒜味。

9号标兵─菠菜富含β胡萝卜素以及Vitc。另外还含有铁、钾、镁等多种矿物质及叶酸，能有效降低血压，振奋情绪。10号标兵─燕麦富含蛋白质、钙、核黄素、硫胺素等成分。每日摄取适量的燕麦能加速人体新陈代谢，加速氨基酸的合成，促进细胞更新。海带含有丰富的海带胶质，可促使侵入体内的放射性物质排出。蘑菇经常食用能清洁血液，排泄毒性物质，还可清洁、净化体内环境。猪血含有大量的血浆蛋白，经过人体胃酸和消化酶分解后，与侵入胃肠的粉尘、有害金属微粒发生化学反应，会变为不易吸收的废物而被排出体外。绿豆能帮助排泄侵入体内的各种毒性物质，包括各种重金属及其它有害物质，促进人体正常代谢。其他抗氧化食物在蛇毒发现的几种毒素，如α-和β-银环蛇毒素可被硫氧还蛋白所失活。

5．蛋白质毒素的解毒

细胞内外的蛋白酶参与有毒多肽的失活作用。

硫氧还蛋白含有一个二硫键活性位点，是通用的蛋白质二硫键氧化还原酶，通过氧化还原机制与多种蛋白质相互作用。SHSHSS蛋白质二硫键还原作用PS2P（SH）2NADP+或FdoxNADPH+H+或Fdred硫氧还蛋白还原酶硫氧还蛋白的还原与蛋白质二硫键的氧化示意图（1）解毒能力耗竭毒物接触剂量超过了机体解毒能力，引起解毒酶耗竭、共底物（cosubstractes）消耗或者胞内抗氧化剂（如谷胱甘肽）耗竭，最终导致终毒物蓄积。

6.解毒过程失效（2）解毒酶失活偶尔可见某种具有反应活性的毒物使解毒酶失活。例如，ONOO－使Mn-SOD失效。正常情况下，Mn-SOD对抗ONOO－的形成。（3）某些结合反应可被逆转。

膀胱致癌物α-萘胺在肝脏经N-羟化并与葡萄糖醛酸结合。而在膀胱中，葡糖苷酸被水解，释放的芳基羟胺经质子化和脱水过程转变为具有反应性的亲电子芳基硝鎓离子。在肺部吸入的甲基异氰酸盐在吸收部位形成不稳定的谷胱甘肽结合物、分布到其它组织，并重新分解为亲电子的异氰酸和异硫氰酸。（4）解毒过程有时产生潜在有害副产物，

自由基解毒过程中产生谷胱甘肽自由基（GS•）和谷胱甘肽二硫化物。谷胱甘肽二硫化物与蛋白巯基形成混合二硫化物，而谷胱甘肽硫基自由基在与硫醇盐（GS－）反应后形成谷胱甘肽二硫化物自由基阴离子（GSSG－•），能使O2还原为O2－•。H2O2+2GSH2H2O+GSSG第二节靶分子的反应一、反应的类型二、毒物对靶分子的影响实际上所有的内源化合物都是毒物潜在的靶标，然而毒理学上相关的靶标是大分子，如核酸（特别是DNA）和蛋白质。在小分子中，膜脂质最为常见。靶分子的属性变性蛋白变性蛋白基因细胞核DNADNA碱基细胞膜氨基酸链基因细胞核DNADNA碱基细胞膜氨基酸链

通过非极性交互作用或氢键与离子键的形成，具有代表性的是毒物与膜受体、细胞内受体、离子通道以及某些酶等靶分子的交互作用。非共价结合通常是可逆的。图

细胞表面受体和细胞内受体一、反应的类型1.非共价结合（nonconvalentbinding）类固醇激素与甲状腺素通过胞内受体调节生理过程

2．共价结合（convalentbinding）共价结合实际上是不可逆的，由于这种结合持久地改变内源分子，因此具有重要的毒理学意义。（1）亲电子剂以共价结合方式与靶分子结合。亲电子剂通常与生物大分子（如蛋白质和核酸）中的亲核原子反应，取决于其电荷∕半径比。（2）中性自由基（如：HO•、NO2•和Cl3C•）也能与生物靶分子发生共价结合。（3）亲核毒物倾向与亲电内源性分子反应。但由于生物体内亲电化合物十分罕见，因此只有少数亲核毒物与体内亲电内源性分子发生反应。化学物可与DNA结合，形成DNA加合物32P后示踪法;免疫法;物理化学仪器法（色谱-质谱和色谱-荧光法）.鸟嘌呤

自由基可迅速从内源化合物去除氢原子，将这些化合物转变为自由基。巯基化合物（R-SH)3.去氢反应巯基自由基（R-S·)4.电子转移

化学物能将血红蛋白中的Fe2+氧化为Fe3+，形成高铁血红蛋白血症。

亚硝酸盐能氧化血红蛋白。

5.酶促反应少数毒素通过酶促反应作用于特定靶蛋白。例如，蓖麻蛋白诱发核糖体水解断裂，阻断蛋白质合成。几种细菌毒素催化ADP-核糖从NAD＋转移到特定蛋白质。例如，白喉毒素阻断蛋白质合成过程中延伸因子（elongationfactor）的功能，霍乱毒素通过这样一种机制活化一种G蛋白，蛇毒含有破坏生物分子的水解酶。（1）活化靶蛋白分子，模拟内源性配体，吗啡激活鸦片受体；佛波酯和铅离子刺激蛋白激酶C。二、毒物对靶分子的影响（一）靶分子功能失调（2）更多情况下，化学物通常抑制靶分子的功能。形成加合物，发生交联和断裂而使内源分子的初级结构改变。（二）靶分子的结构破坏

膜脂质蛋白质DNA-S-S-CH3-S-脂质-脂质交联OOHHO脂肪酸氧化OHHO从氧化的脂肪酸释出的丙二醛MDA(1)细胞膜脂质破坏

蛋白质断裂蛋白质-蛋白质交联-S-S-CH3-S-脂质-脂质交联O二硫交联脂质-蛋白质交联氨基酸氧化OHHO脂肪酸氧化OHHO(2)蛋白质失活

蛋白质的空间结构及构成发生变化导致蛋白质的生理特性减弱或消失(3)DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变

虽然外源化学物或其代谢物的共价结合对于免疫系统功能的影响通常是不重要的，但在某些个体，这些发生变化了的蛋白质常激发免疫应答。（三）新抗原形成一、细胞应激

二、细胞调节功能障碍

三、细胞维持功能改变

第三节细胞功能障碍与毒性调节功能：细胞一部分发出信号，另一部分接收信号并将其转变为细胞功能上的变化的过程。维持功能：维持细胞自身的完整性1.基因转录调节障碍2.信号转导调节障碍3.细胞外信号产生的调节障碍二、细胞调节功能障碍（一）基因表达调节障碍1.基因转录调节障碍转录（transcription）以DNA为模板合成RNA的过程。转录RNADNA

转录所需的酶叫做DNA依赖的RNA聚合酶（DNA-dependentRNApolynerase）转录起始点TATA盒CAAT盒GC盒

增强子顺式作用元件(cis-actingelement)包括启动子、增强子和沉默子。

转录起始前的上游区段

AATAAA切离加尾转录终止点修饰点外显子翻译起始点内含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚体由组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两分子构成核小体结构的核心颗粒。启动子定位转录起始点增强转录频率－30－100

外源化学物通过影响转录因子的活性是外源化学物调节基因表达最主要的方式。反式作用因子

转录因子（TranscriptionFactors，TF）TF是一种蛋白质，特异地识别某基因上顺式作用元件，引起基因的转录蛋白质-DNA相互作用是指反式作用因子与顺式作用元件之间的特异识别及结合。

受体与信号的接受

信号分子识别并结合的受体通常位于细胞质或细胞内，所以有两类受体：细胞表面受体（膜受体）细胞内受体（核受体）2.信号转导调节障碍膜受体介导的跨膜信号转导核受体介导的信号转导信号转导的一般步骤特定细胞释放信号分子信号分子经扩散或血循环到达靶细胞与靶细胞受体特异性结合受体对信号进行转换并启动细胞内信使系统靶细胞产生生物学效应信号分子及信号通路的构成信号接收装置（受体）信号转导装置（G蛋白、蛋白激酶、接合蛋白）靶蛋白信号分子（配体）效应细胞外信号分子信号分子——配体（ligand），第一信使（1）激素（2）神经递质/神经肽（3）细胞因子（4）气体信号（NO）

存在于细胞膜或细胞内的特殊蛋白质，能特异性识别细胞外信号分子并与之结合，激活细胞内一系列的生物化学反应，进而使细胞对外界刺激产生相应的效应。信号通路的构成——受体（receptor）：信号接收装置受体分类细胞表面受体—膜受体（membranereceptors)

配体为水溶性细胞内受体—核受体（nuclearreceptors）配体为脂溶性

1.离子通道偶联受体电兴奋性细胞（神经、肌肉细胞）之间的突触部位，是神经递质受体，将化学信号转变为电信号。如乙酰胆碱受体。2.G蛋白偶联受体许多激素和神经递质的受体,如肾上腺素受体。3.酶偶联受体生长因子和细胞因子受体。其胞内结构域本身具有酶活性或与酶偶联。膜受体种类1.离子通道偶联受体（1）作用：参与电兴奋性细胞间的突触信号快速传递

（2）特点：受体本身构成离子通道

（3）举例：N型乙酰胆碱（Ach），γ-氨基丁酸受体

N型Ach受体由α×2、β、γ、δ5个亚单位组成的钠离子通道，α亚单位上Ach结合点与Ach结合后，钠离子通道开放，胞外钠离子内流、细胞膜去极化、肌肉收缩。Kir6.1/K-ATP通道：帕金森病神经保护的新靶标（胡刚2010）

2012年诺贝尔化学奖

授予两位美国人：罗伯特•莱夫科维茨（RobertJ.Lefkowitz）和布莱恩•科比尔卡（BrianKobilka），表彰在G蛋白偶联受体（G-protein-coupledreceptors，GPCRs）研究上所做的贡献。

G蛋白偶联受体是环境信息进入细胞内部的门户，并触发细胞内一系列响应。大约半数药物通过G蛋白偶联受体产生效应。2.G蛋白偶联受体（1）作用：最大的受体超家族，分布最广，参与功能最多。视觉、嗅觉、味觉、神经传递、激素参与的多项生理代谢活动；以该受体为靶点药物约占一半以上。（2）特点：G蛋白偶联系统由7次跨膜的受体、G蛋白和效应物三部分组成；产生第二信使。（3）举例：M型乙酰胆碱（Ach），肾上腺素G蛋白偶联受体激素等配体（第一信使）→G蛋白偶联受体→G蛋白→效应物（酶或通道）→第二信使（cAMP等）G蛋白偶联受体反应链

G蛋白偶联受体（G-proteincoupledreceptor,GPCR）又称蛇型受体。肽链分为细胞外区、跨膜区、细胞内区三区。立体结构有七个跨膜α螺旋，且其肽链的C端和连接第5和第6个跨膜螺旋的胞内环上都有G蛋白的结合位点。G蛋白偶联受体

G蛋白（guanylatebindingprotein）即鸟苷酸结合蛋白。

、和亚基组成的异聚体；具有GTP酶(GTPase)的活性，亚基能结合GTP或GDP；本身构象改变可活化效应蛋白。两种构象：非活化型（G与GDP结合）；活化型（G与GTP结合）。G蛋白的分子结构酶和离子通道两种酶催化生成（或分解）第二信使。腺苷酸环化酶（adenylylcyclase,AC）、磷脂酶C（phospholipaseC,PLC）、磷脂酶A2（PLA2）、鸟苷酸环化酶（guanylylcyclase,GC）和cGMP磷酸二酯酶（phosphodiesterase,PDE）等。某些离子通道可接受G蛋白的直接或间接的调控。G蛋白效应物（靶分子）G蛋白偶联受体介导信号转导的主要步骤配体+受体G蛋白G蛋白效应物第二信使第二信使效应器腺苷酸环化酶依赖于cGMP的磷酸二酯酶磷酯酶CCa2+或K+通道蛋白激酶A（PKA）蛋白激酶C（PKC）Na+、K+和Ca2+通道蛋白环磷酸腺苷（cAMP）环磷酸鸟苷（cGMP）三磷酸酰肌醇（IP3）二酰甘油（DG）钙离子和NO等G-蛋白偶联受体介导的cAMP信号通路配体→G蛋白偶联受体→G蛋白→腺苷酸环化酶→cAMP→蛋白激酶A（PKA）→基因调控蛋白(转录因子）（CREB，cAMP应答元件结合蛋白，cAMPresponseelementbindingprotein）→基因转录ＣＣＣＲＥＢＣＲＥＢ细胞核PiPiＣＲＥＢPiＣＲＥＢPi结构基因ＣＲＥDNA蛋白质PKA对基因表达的调节作用（演示）3.酶偶联受体（1）作用：参与细胞因子信号转导，与细胞的增殖、分化、分裂及癌变有关（2）特点：单次跨膜蛋白；接受配体后二聚化而激活，起动下游信号转导。（3）举例：胰岛素受体IGF-R

表皮生长因子受体(EGF-R)。①受体酪氨酸激酶

RTKs（receptortyrosinekinase）是最大的一类②酪氨酸激酶连接的受体③受体酪氨酸磷脂酶④受体丝氨酸/苏氨酸激酶⑤受体鸟苷酸环化酶⑥组氨酸激酶连接的受体（与细菌的趋化性有关）酶偶联受体分类

本身具有激酶活性，如肽类生长因子（EGF，PDGF，CSF等）受体本身没有激酶活性，但可以连接非受体激酶。

本身具有激酶活性的受体酪氨酸激酶—RAS信号途径信号(配体)→受体(RTK)→受体二聚化(Dimer)→受体自磷酸化→接头蛋白GRB2→Sos（鸟嘌呤核苷酸释放因子）→Ras蛋白→Raf（MAPKKK，MAP激酶激酶激酶）→MAPKK（MEK，MAP激酶激酶）→MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）→转录因子磷酸化（cMyc,cJun,cFos）→激活靶基因→细胞应答和效应EGFR（表皮生长因子受体）介导的信号转导过程本身没有激酶活性（酪氨酸激酶连接的受体）JAK-STAT信号转导通路信号（配体，细胞因子或生长因子）→受体R→受体二聚化→JAK（januskinases，两面神激酶，非受体酪氨酸蛋白激酶）→STAT（Signaltransducersandactivatorsoftranscription，信号转导及转录激活因子)→基因转录活性改变→细胞生理功能改变膜受体信号通路小结（1）类固醇激素受体糖皮质激素受体（GR）、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、雄激素受体（AR）、盐皮质激素受体（MR）；（2）维生素D3受体（VDR）（3）甲状腺激素受体（TR）细胞内受体—核受体核受体信号通路信号通路基本过程信号L（配体）→受体R→受体激活→蛋白质量的变化+蛋白质磷酸化与去磷酸化（活性变化）+蛋白质分子间的相互作用→转录因子

→+靶基因→转录活性改变→细胞生理功能改变

信号通路研究策略蛋白质表达水平和细胞内定位

Westernblot和免疫荧光2.蛋白质与蛋白质相互作用3.磷酸化蛋白质研究

Westernblot4.基因表达检测

RT-PCR和westernblot5.蛋白质与DNA相互作用染色质免疫沉淀（ChIP）6.第二信使含量的测定

信号蛋白分子表达水平检测

Westernblot（蛋白印迹，免疫印迹）Proteomics（蛋白质组，双向电泳）信号蛋白分子在细胞内定位

Immunofluorescence(IF)

免疫荧光技术已知抗原或抗体标记荧光素制成荧光标记物，再用荧光标记物为探针检查标本抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物含荧光素，用荧光显微镜观察，可看见荧光所在的细胞，对抗原或抗体定位。1.蛋白质表达水平和细胞内定位研究2.蛋白质与蛋白质相互作用Co-IP（Co-Immunoprecipitation，免疫共沉淀）GSTpull-downassay（谷胱甘肽巯基转移酶捕获）Yeasttwo-hybridassay（酵母双杂交）FRET(fluorescenceresonanceenergytransferassay）（荧光共振能量转移）

当细胞被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质——蛋白质间的相互作用被保留下来。如用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。Co-IP（免疫共沉淀）

原理（1）蛋白样品准备（2）抗原抗体结合反应（3）ProteinA/G与抗原抗体复合物结合（4）免疫复合物与proteinA/G解离（5）分析鉴定应用western-blot或质谱仪分析鉴定样品步骤和方法GSTpull-downassay（谷胱甘肽巯基转移酶捕获）构建靶蛋白和GST的融合基因，导入细菌中表达出相应融合蛋白，然后提取靶蛋白-GST融合蛋白，将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过western分析，在体外证实两种蛋白间的相互作用。

原理和方法本课题组的研究农药氯氰菊酯对雄激素受体（AR）信号通路的影响-----核受体氯氰菊酯对非配体依赖性IL-6/JAK/STAT3/AR信号通路影响-----膜受体2008年国家自然科学基金AR信号通路介导农药氯氰菊酯抗雄激素效应的机制研究2007年申报国家自然科学基金雄激素受体NH2/COOH端在氯氰菊酯抗雄激素效应中的作用2006年申报国家自然科学基金氯氰菊酯和壬基酚抗雄激素效应的联合作用研究氯氰菊酯对雄激素受体（AR）信号通路的影响核受体（AR）信号通路

雄激素（双氢睾酮DHT)与受体结合形成配体-受体复合物，识别核中雄激素效应元件（ARE）并与之结合，激活靶基因转录。共调节因子是与AR转录激活功能相关的蛋白质因子，可以与AR结合增强或抑制AR的转录。AR对基因的激活涉及与共调节因子相互作用共激活因子（coactivators）

SRC-1共调节因子分类共抑制因子（corepressors）

SMRT和NCoR氯氰菊酯对AR信号通路影响的主要机制

共激活因子SRC-1和共抑制因子SMRT和NCoR可能在氯氰菊酯抗雄激素效应中起重要作用，氯氰菊酯通过抑制AR与SRC-1的相互作用，并增强AR与共抑制因子SMRT和NCoR的相互作用抑制靶基因的转录激活。研究方法■哺乳动物双杂交系统用于研究蛋白与蛋白之间的相互作用。AR和SRC-1、SMRT和NCoR之间的相互作用

是否加入DHT，CAT的表达明显升高，AR和SRC-1、SMRT和NCoR之间存在相互作用。结果

氯氰菊酯对AR/SRC-1、AR/SMRT和AR/NCoR相互作用中的影响

氯氰菊酯能抑制AR和SRC-1之间的相互作用；能增强AR和SMRT和NCoR之间的相互作用。结果研究中的新发现

DHT对AR与SRC-1相互作用的影响

AR和SRC-1之间的相互作用是非配体依赖性的用浓度为10−10M到10−8M的DHT溶液对细胞染毒时，CAT的表达没有明显升高，与不加DHT的CAT表达相比较，差异没有统计学意义。

配体依赖性的AR信号通路是AR转录激活的经典模式，AR需要与雄激素结合从而被活化。非配体依赖性AR信号通路与经典的AR信号通路间存在交互作用。在无雄激素存在的情况下，白细胞介素（IL）、表皮生长因子（EGF）和胰岛素生长因子（IGF）等细胞因子均可通过活化相应信号通路下游的信号分子激活AR，促进AR的转录。

非配体依赖性AR信号通路

氯氰菊酯对非配体依赖性IL-6/JAK/STAT3/AR信号通路的效应2012年国家自然科学基金

改变蛋白磷酸化、干扰G蛋白GTP酶活性、破坏蛋白-蛋白交互作用、建立异常蛋白-蛋白交互作用、改变信号蛋白的合成与降解。外源化学物通过多种途径引起信号转导障碍总结一句话3.细胞外信号产生的调节障碍图

下丘脑-垂体-睾丸轴激素分泌的主要调控机制

特定细胞正常运行的控制是通过作用于膜受体的信号分子来实施的，毒物可通过中断信号连接过程中的任何一个步骤而影响细胞的瞬息活动。

（二）细胞瞬息活动的调节障碍

许多植物和动物毒素以及合成化学物如DDT激活Na+通道，导致过度兴奋。

毒物（如河豚毒素和哈蚌毒素）阻断电压门控的Na+通道的引起麻痹。

ATP耗竭细胞内Ca2+稳态失调ROS/RNS生成二、毒物引起的细胞维持功能改变（一）细胞内部维持的损害：中毒性细胞死亡的机制

1．危害细胞存活的原发性代谢紊乱：多糖脂肪蛋白质葡萄糖甘油＋脂肪酸氨基酸HCO2TAC乙酰CoAO2H2OATP有机物质在细胞内进行氧化分解而生成CO2和H2O并释放出能量的过程称为生物氧化。

（1）ATP耗竭三羧酸循环ATP生成呼吸链传递H给氧生成水的过程，与ADP磷酸化生成ATP的过程相偶联发生称为氧化磷酸化（脱氢、失电子或与氧结合）ATP合成酶及ATP合成

A类物质干扰氢向电子传递链传递；B类化学物如鱼藤酮和氰化物抑制电子沿电子传递链转移到分子氧；C类毒物干扰氧传递到终末电子转运蛋白——细胞色素氧化酶；D类化学物抑制ATP合酶（氧化磷酸化的关键酶）的活性。E类化学物引起线粒体DNA损伤、损害由线粒体基因组编码的特定蛋白质(如：复合物I亚单位和ATP合酶)合成，干扰线粒体ATP合成的化学物包括五类

ADP不能重新磷酸化导致ADP及其代谢产物的堆积以及ATP的耗竭细胞内钙稳态细胞钙稳态的紊乱与细胞毒性钙稳态失调的机制(2)细胞内Ca2+持续升高细胞内钙稳态

细胞静息状态下细胞内游离的Ca2+仅为10-7mol/L，而细胞外液Ca2+则达10-3mol/L细胞内钙稳态

当细胞处于兴奋状态，细胞内游离Ca2+迅速增多可达10-5mol/L，此后再降低至10-7mol/L，完成信息转递循环。认为Ca2+是体内第二信使。上述Ca2+浓度的变化过程呈稳态状，称为细胞内钙稳态。细胞受损时导致Ca2+内流增加，或Ca2+从细胞内贮存部位释放增加，或抑制细胞膜向外逐出Ca2+，表现为细胞内Ca2+浓度不可控制的持续增加，称为细胞内钙稳态的失调。细胞内钙稳态的失调①能量储备的耗竭；②微丝功能障碍；③水解酶的活化；④ROS和RNS的生成。钙的浓度变化，可通过下列途径造成细胞损伤（3）ROS与RNS的过度产生

有许多外源化学物可直接生成ROS与RNS，如氧化还原循环物质和过渡金属。此外，ROS和RNS的过度产生可继发于细胞内高钙症.1）细胞ATP的耗竭剥夺了内质网质膜Ca2+泵的燃料，引起胞浆Ca2+的升高。Ca2+内流进线粒体，ATP合酶发生障碍。（2）细胞内高钙促进ROS和RNS的形成，而ROS与RNS使巯基依赖的Ca2+泵发生氧化性失活，这反过来又加剧了高钙。（3）ROS与RNS也能消耗ATP储备。NO和ONOO－抑制细胞AT