华北理工大学药物分析实验指导

华北理工大学药物分析实验指导

目录

前言

………………2

实验一

葡萄糖的杂质检查（一般杂质检查）…………………3

实验二

药物特殊杂质检查………6

实验三

苯巴比妥的鉴别、区别（微晶反应）及含量测定（银量法）………7

实验四

安妥碘的含量测定（氧瓶燃烧-可见分光光度法）…9

实验五

盐酸普鲁卡因注射液的提取中和滴定法……………10

实验六

硫酸阿托品注射液的测定……………11

实验七

酚磺乙胺注射液的含量测定…………11

实验八

复方新诺明片中磺胺甲基异恶唑及甲氧苄氨嘧啶的双波长分光

光度法…………………12

实验九

维生素C注射液的分析………………13

实验十

复方乙酰水杨酸片的含量测定………15

实验十一

维生素B1片剂的含量测定（差示分光光度法）…16

实验十二

氯霉素滴眼液的高效液相色谱分析法……………18

Exp13

DeterminationofAlcoholinBelladonnaTincture

………20

实验十四

设计性实验

………22

前

言

药物分析是药学专业的一门专业课程，也是一门综合性应用学科。药物分析实验是本课程的重要组成部分，通过实验课学习培养学生树立药品质量观念，熟悉药品检验程序，并能较系统地掌握药典常用的分析方法和实验技术，从而培养学生独立进行药品检验工作的能力。

按照教学大纲规定，学生应做到以下几方面：

了解药物分析工作的程序和要求，加深对本学科专业理论知识的理解。

掌握实验教材中各类代表药物的常用分析方法，包括药物的鉴别、杂质检查、含量测定等基本理论和常用仪器的操作技术。

培养实事求是的科学态度和严谨的工作作风。

实验课前做好预习，明确实验目的和要求，了解实验内容和操作方法及注意事项。

按实验规程认真操作，仔细观察实验现象，并做好原始记录，记录要清楚工整，用钢笔或圆珠笔直接记于实验记录本上，不得涂改或编写记录。

认真分析实验结果，正确进行数据处理，力求得出准确可靠得结论。认真完成实验报告。

遵守实验室规则，爱护仪器，防火、防爆，节约水电，注意废溶剂的回收。

值日生认真清理实验台，打扫实验室并检查门、窗、水、电等安全事宜。

本实验讲义内容是根据药学专业（四年制）教学计划结合我院实际情况编写的，使用时可根据教学时数选择，也可作为实例用做课堂教学参考。

实验一

葡萄糖的杂质检查（一般杂质检查）

目的要求

1.通过葡萄糖分析了解一般杂质检查项目和意义。

2.掌握杂质检查的原理和方法。

实验内容和操作方法

标准溶液的配制

标准氯化钠溶液的制备

称取氯化钠0.165g，置1000ml量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀作为贮备液。临用前精密量取贮备液10ml置100ml量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，既得（每1ml相当于10mg的Cl）。

2.

标准硫酸钾溶液的制备

称取硫酸钾0.181g，置1000ml量瓶中，

加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，既得（每1ml相当于100mg的SO42-）。

3.

标准铁溶液的制备

称取硫酸铁胺[FeNH4（SO4）2×12H2O]0.863g，置1000ml量瓶中，加水溶解后，加硫酸2.5ml，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。临用前精密量取贮备液10ml置100ml量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，既得（每1ml相当于10mg的Fe）。

标准铅溶液的制备

称取硝酸铅0.160g，置1000ml量瓶中，加硝酸5ml与水50ml溶解后，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。临用前精密量取贮备液10ml置100ml量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，既得（每1ml相当于10mg的Pb）。

配制与贮存用的玻璃容器均不得含有铅。

标准砷溶液的制备

称取三氧化二砷0.132g，置1000ml量瓶中，加20%氢氧化钠溶液5ml溶解后，用适量的稀硫酸中和，再加稀硫酸10ml，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。临用前精密量取贮备液1ml置100ml量瓶中，加稀硫酸1ml，用水稀释至刻度摇匀，既得（每1ml相当于10mg的As）。

（二）葡萄糖的杂质检查

酸度

取本品2.0g，加水20ml溶解后加酚酞指示液3滴与氢氧化钠滴定液（0.02mol/L）0.20ml，应显粉红色。

溶液的澄清度与颜色

取本品5g，加热水溶解后，放冷，用水稀释至10ml，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（取浊度标准原液5.0ml，加水95.0ml配制）比较，不得更浓；如显色与对照液（取比色氯化钴液3ml、比色用重铬酸钾液3ml与比色用硫酸铜液6ml，加水稀释成50ml）1.0ml加水稀释至10ml比较，不得更深。

乙醇溶液的澄清度

取本品1.0g，加90%乙醇30ml，置水浴上加热回流约10分钟，溶液应澄清。

4．氯化物

取本品0.6g，加水溶解使成25ml（溶液如显碱性，可滴加硝酸使成中性），再加稀硝酸10ml；溶液如不澄清，应滤过；置50ml纳氏比色管中，加水使成约40ml，摇匀，即得供试溶液。另取标准氯化钠溶液（每1ml相当于10μg的Cl-）6.0ml，置50ml纳氏比色管中，加稀硝酸10ml，加水使成40ml，摇匀，即得对照品溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入硝酸银试液1.0ml，用水稀释使成50ml，摇匀，在暗处放置5分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，供试液与对照液比较，不得更浓（0.01%）。

5．硫酸盐

取本品2.0g，加水溶解使成约40ml（溶液如显碱性，可滴加盐酸使成中性）；溶液如不澄清，应滤过；置50ml纳氏比色管中，加稀盐酸2ml，摇匀，即得供试溶液。另取标准硫酸钾溶液（每1ml相当于100μg的SO42-）2.0ml，置50ml纳氏比色管中，加水使成约40ml，加稀盐酸2ml，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入25%氯化钡溶液5ml，用水稀释至50ml，充分摇匀，放置10分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，供试液与对照液比较，不得更浓（0.01%）。

6．亚硫酸盐与可溶性淀粉

取本品1.0g，加水10ml溶解后，加碘试液1滴，应即显黄色。

7．干燥失重

取本品混合均匀（如为较大的结晶，应先迅速捣碎使成2mm以下的小粒），取约1g，置与供试品同样条件下干燥至恒重的扁形称瓶中，精密称定，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过9.5%。

8．炽灼残渣

取本品1.0~2.0g，置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化，放冷至室温，加硫酸0.5~1ml使湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在700~800℃炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在700~800℃炽灼至恒重，所得炽灼残渣不得超过0.1%。

9．蛋白质

取本品1.0g，加水10ml溶解后，加磺基水杨酸溶液（1®5）3ml，不得发生沉淀。

10．铁盐

取本品2.0g，加水20ml溶解后，加硝酸3滴，缓缓煮沸5分钟，放冷，加水稀释使成45ml，加硫氰酸铵溶液（30®100）3ml，摇匀，如显色，与标准铁溶液（每1ml相当于10μg的Fe）2.0ml用同一方法制成的对照液比较，不得更深（0.001%）。

11．重金属

取25ml纳氏比色管两支，甲管中加标准铅溶液（每1ml相当于10μg的Pb）2ml与醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml后，加水稀释成25ml；取本品4.0g置乙管中，加水23ml溶解后，加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml；再在甲乙两管中分加硫代乙酰胺试液各2ml，摇匀，放置2分钟，同置白纸上，自上而下透视，乙管中显出的颜色与甲管比较，不得更深，含重金属不得过百万分之五。

硫代乙酰胺的制备：临用前取混合液5.0ml，加硫代乙酰胺溶液1.0ml，置水浴上加热20秒钟，冷却，立即使用。

12．砷盐

取本品2.0g加水5ml溶解后，加稀硫酸5ml与溴化钾溴试液0.5ml，置水浴中加热约20分钟，使保持稍过量的溴存在，必要时，再补加溴化钾试液适量，并随时补充蒸散的水分，放冷，加盐酸5ml与水适量使成28ml，置试砷瓶中加碘化钾试液5ml与酸性氯化亚锡试液5滴。在室温中放置10分钟后，加锌粒2.0g，迅速将瓶塞（瓶塞已放好装有醋酸铅棉花60mg及溴化汞试纸的试砷管）塞紧，保持反应温度在35~37℃间（视反应快慢而定，但不应超过40℃）。45分钟后取出溴化汞试纸，将生成的砷斑与标准砷溶液（每1ml相当于1μg的As）2ml制成的标准砷斑比较，颜色不得更深（0.001%）。

标准砷斑的制备：精密吸取标准砷溶液2ml，置另一试砷瓶中，加盐酸5ml与水21ml，照上述方法，自"加碘化钾试液5ml……"起依法操作（古蔡氏法），即得标准砷斑。

思考题：

什么是一般杂质？

药物中杂质的来源主要有哪些途径？如何计算杂质限量？

实验二

药物特殊杂质检查

一、目的要求

1．了解本实验中药物特殊杂质的来源和检查目的。

2．掌握本实验中药物杂质的检查方法。

二、实验内容及操作方法

薄层板制备：取硅胶G（或硅胶H）3g，（可稍过量），加0.5%CMC-Na9ml于乳钵中，按同一方向研磨至适宜稠度，分别均匀铺于5´20cm玻璃板上，凉干，于105℃活化一小时，置干燥器内备用。

显色剂的配制（由实验室制备）

碱性四氮唑蓝试液：0.2%四氮唑蓝甲醇液10ml，加12%NaOH甲醇液30ml制成。

对二甲氨基苯甲醛溶液：2%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液100ml，加入冰醋酸5ml制成。

（三）操作方法

1．氢化可的松中其他甾体的检查：

取本品，加氯仿-甲醇（9:1）制成每1ml中含3mg的溶液。作为供试品溶液。精密量取适量，加氯仿-甲醇（9:1）稀释成每1ml中含60μg的溶液，作为对照溶液，照薄层色谱法（中华人民共和国药典2005年版附录）试验，吸取上述两种溶液各20μl，分别占于同一硅胶G薄层板上。以二氯甲烷一乙醚-甲醇-水（38.5:6:3:0.2）为展开剂，展开后，晾干，在105℃烘10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视，供试品溶液所显的杂质斑点不得超过3个，其颜色与对照溶液的斑点比较，不得更深。

2．盐酸普鲁卡因注射液中对氨基苯甲酸的检查：

精密量取本品适宜，加乙醇稀释使成每1ml中含盐酸普鲁卡因2.5mg的溶液，作为供试品溶液。另取对氨基苯甲酸，加乙醇制成每1ml含30μg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中华人民共和国药典2005年版附录）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于含有羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶H薄层上，用苯-冰醋酸-丙酮-甲醇（28:2:2:8）为展开剂，展开后，取出晾干，用对二甲氨基苯甲醛溶液喷雾显色。供试溶液如显与对照品相应的杂质斑点，其颜色与对照品溶液的主斑点比较，不得更深（1.2%）。

思考题：

薄层层析法检查氢化可的松中其它甾体的原理是什么？为何用稀释液作对照？

2.试计算两种药物的杂质限量。

实验三

苯巴比妥的鉴别、区别（微晶反应）及含量测定（银量法）

一、目的要求

1．掌握用银量法测定巴比妥类药物含量的方法原理及其操作条件。

2．了解苯巴比妥的鉴别反应的原理及微晶反应的观察。

二、鉴别

1．取供试品约0.1g，加碳酸钠试液1ml与10ml振摇2分钟，滤过（如不浑浊可不必滤过）。滤液中逐滴加入硝酸银溶液，即发生白色沉淀，振摇，沉淀即溶解，继续滴加过量的硝酸银试液，沉淀不再溶解。

2．取供试品约50mg，加吡啶溶液（1®10）5ml，溶解后，加铜吡啶试液1ml，即显紫色或产生紫色沉淀。

3．取本品约10mg，加硫酸2滴与亚硝酸钠约5mg，混合，即显橙黄色，随即转橙红色。

4．取本品约500mg，置试管中，加甲醛试液1ml，加热煮沸，冷却，沿管壁缓缓加硫酸0.5ml使成两液层，置水浴中加热，接界面显玫瑰红色。

三、微晶反应：

取3-5%的巴比妥钠的水浴液一滴，滴于载玻片上，在其边缘上加1滴稀硫酸，即生成巴比妥的特殊结晶为长方形结晶。

取3-5%的苯巴比妥钠的水溶液一滴，滴于载玻片上，在其边缘上加1滴稀硫酸，苯巴比妥在开始结晶时呈现球状，然后变成花瓣状的结晶。

操作注意事项：

1．显微镜头和载玻片在使用前用绸布擦净。

2．观察显微镜结晶时，显微镜应置于光线充足的地方。

3．做显微镜结晶时，不可用玻捧搅拌液滴，而用手轻轻地摆动载玻片使样品液滴和稀硫酸液滴自然汇合，待放置1-2分钟自然生长出结晶时，再用显微镜观察。

四、含量测定

1．操作步骤

取本品约0.4g，精密称定，加入新制的碳酸钠试液16ml使溶解，加丙酮12ml与90ml，用硝酸银液（0.1mol/L）滴定至生成的浑浊在30秒钟内不消失，即得。（每1ml的硝酸银液（0.1mol/L）相当于23.22mg的C12H12O3N2）。

2．操作注意事项

（1）在接近终点时，反应较慢，因此在近终点时需逐滴加入充分振摇，待乳白色浑浊出现30秒钟不褪即为终点。

（2）近终点时，观察出现的浑浊较难掌握，可以黑色背景为衬托观察较为明显。

思考题：

银盐鉴别反应时为什么不应加过多的碳酸钠？

如何用化学方法鉴别苯巴比妥、司可巴比妥、异戊巴比妥和含硫巴比妥？

实验四

安妥碘的含量测定（氧瓶燃烧-可见分光光度法）

一、目的要求

1．掌握氧瓶燃烧样品处理法的原理、技能及应用范围。

2．了解选择和氧瓶燃烧联用方法的依据，进一步培养设计测定方法的能力。

二、仪器与试剂

氧瓶250ml、UV-120光度计、硫氰酸汞、硫酸铁铵、乙二醇一甲醚、冰醋酸、水合肼（均为分析纯）、碘化钾（基准物质）

硫氰酸汞溶液：称取硫氰酸汞0.2g溶于乙二醇一甲醚150ml后，以冰醋酸稀释至500ml。

硫酸铁铵溶液：量取70%高氯酸77ml，用水稀释至150ml，将硫酸铁铵6.0g溶于该溶液中，并以冰醋酸稀释至500ml。

三、实验原理

安妥碘（普罗碘铵）经氧瓶燃烧，使有机碘转变为无机状态的碘，吸收于吸收溶液（0.5%水合肼溶液20ml）中，完全转变成碘离子后，和硫氰酸汞反应，生成难电离可溶性的碘化汞，从而定量地置换出硫氰酸根离子。硫氰酸根离子再与高铁离子反应，生成红色配位化合物，于460nm波长处进行分光测定。

四、操作步骤

1．标准曲线的会制（A-C）曲线：准确称取碘化钾（基准）0.0830g，按药典规定方法操作，以0.5%水合肼溶液20ml为吸收液，快速通氧1分钟，点燃滤纸引条，迅速将瓶塞紧，并放置。待燃烧完毕后，振摇至瓶内烟雾消失，再于水封条件下放置20分钟，定量转移至100ml容量瓶中，以水稀释至刻度。所得溶液的碘离子浓度为1.00mmol/ml。分别取上述溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml后，再分别加入硫氰酸汞及硫酸铁铵溶液各10.00ml，混合均匀后，室温静止10分钟，以0.5%水肼溶液5.00ml加硫氰酸汞溶液10.00ml，及硫酸铁铵溶液10.00ml的混合溶液作空白，于460nm波长处测吸收度，绘制标准曲线。

C=0.1159+6.780A

2．样品测定：准确称取安妥碘样品0.013-0.017g，用标准曲线绘制项下的方法进行燃烧后，定量转移至100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，取上述溶液5.00ml同上测定，用回归方程式计算所得相应的碘离子浓度，按下式计算含量：

安妥碘%=（10CM·10-6）/W

C：碘的微摩尔数

M：安妥碘的分子量

W：取样量（g）

安妥碘分子式：C6H24I2N2O

分子量：430.11

思考题:

何种药物样品，在什么条件下可选用所瓶燃烧样品处理法?

实验五

盐酸普鲁卡因注射液的提取中和滴定法

一、目的要求

学习提取中和法及其操作注意点。

二、操作步骤

本品含盐酸普鲁卡因（C13H2O2N2·HCl）应为标量的95-105%。

精密量取本品10ml（约与盐酸普鲁卡因0.20g相当）至分液器中，加氨试液3ml成碱性后，分别用氯仿提取（氯仿用量为20、20、15、15ml/次），使普鲁卡因均溶入氯仿中，合并氯仿液，滤过，滤纸用少量氯仿洗净，洗液与滤液合并，并在水浴上蒸发至近干，加中性乙醇5ml与硫酸液（0.05mol/L）15ml，在水浴上加热至氯仿的臭气完全消失，放冷，加甲基红指示剂数滴，用氢氧化钠液（0.05mol/L）也将剩余的硫酸滴定，即得（每1ml硫酸液（0.05mol/l）与27.28mg的C13H20O2N2·HCl相当）。

三、操作说明

1．样品碱化前宜先加氯仿，以免游离碱析出，沉积与分液漏斗活塞部分，而在操作中损失。

2．提取也应用氯仿湿润的滤纸或棉花滤过，本实验用棉花。

思考题：

提取中和滴定法常用于哪一类药物的含量测定？

实验六

硫酸阿托品注射液的测定

一、目的和要求

学习酸性染料比色法及操作注意点。

二、操作步骤

1．对照品溶液的制备

精密称取在120℃干燥至恒重的硫酸阿托品对照品25mg，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得（每1ml中含硫酸阿托品50μg）。

2．供试品溶液的制备

精密量取本品适量（约相当于硫酸阿托品2.5mg），置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀作为供试品溶液。

3．测定法

精密量取对照品溶液与供试品溶液各2ml，分别置分液漏斗中，各加溴甲酚绿溶液（取溴甲酚绿50mg与邻苯二甲酸氢钾1.021g加氢氧化钠液（0.2mol/L）使溶解。再加水稀释至100ml）2ml摇匀，分别精密加氯仿10ml，振摇提取后，静置使分层，氯仿液用无水硫酸钠脱水后，移置1cm比色池中，以水2ml按同法操作所得的氯仿液作为空白，在420nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。

思考题：

酸性染料比色法测定生物碱类药物的原理是什么？影响测定的主要因素有哪些？

实验七

酚磺乙胺注射液的含量测定

一、目的要求

1．掌握不经消解的半微量凯氏定氮法的原理与操作。

2．掌握注射液的分析特点。

二、操作步骤

精密量取本品适量（约相当于酚磺乙胺0.2g）置50ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml加入蒸馏器中，用少量水冲洗，加40%氯氧化钠溶液5ml后，按药典（中华人民共和国药典2000年版附录VIID）氮测定法操作，即得（每1ml的硫酸液（0.005mol/L相当于2.633mg的C19H17O5NS）。

三、计算

（V1-V2）f·T·D·100/（毫升数·标示量）

V1：样品消耗H2SO4溶液（0.005mol/L）毫升数

V2：空白消耗H2SO4溶液（0.005mol/L）毫升数

T：滴定度：（每1毫升标准液相当于被测物质的克数）

（每1ml的H2SO4溶液（0.005mol/L）相当于2.633mg的C19H17O5NS）

D：稀释倍数

思考题：

本实验的原理是什么？

为什么要做空白？如何做？

实验八

复方新诺明片中磺胺甲基异恶唑及

甲氧苄氨嘧啶的双波长分光光度法

一、目的要求

1．掌握双波长分光光度法的基本原理，复方制剂不经分离直接测定各组分含量的方法。

2．熟悉用单波长型分光光度计（751G）进行双波长测定。

二、操作步骤

（一）工作曲线及回归方程的制作

1．标准贮备液的配制

分别精密称取磺胺甲基异恶唑和甲氧苄氨嘧啶标准品各0.1g，置100ml容量瓶中，加入50ml95%乙醇，振摇溶解后，以氢氧化钠液0.1mol/L稀释至刻度。吸取25ml置250ml容量瓶中以氢氧化钠液0.1mol/L稀释至刻度，得两标准贮备液（100μg/ml）。

2．SMZ的标准曲线绘制及回归方程

取SMZ标准贮备液（100μg/ml）0.00、3.00、6.00、9.00、12.00、15.00置10ml容量瓶中，以NaOH0.1mol/L稀释至刻度。以NaOH0.1mol/L为空白，257nm为测定波长，304nm参比波长，测得这两个波长处的吸收度这差值（△A）。以△A为纵坐标，以浓度C为横坐标，作标准曲线，并用最小二乘法回归得回归方程。

△A=6.467×10-2+0.002（C:

μg/ml）

r=0.9999，线性范围：0~15μg/ml

3．测定SMZ、TMP在287nm波长处的吸收系数

将SMZ、TMP的贮备液适当稀释，以NaOH液0.1mol/L为空白，测定二液在287nm波长处的吸收度。并计算吸收系数，E1%SMZ=109.6，

E1%TMP=247.4

（二）复方新诺明片中SMZ和TMP的含量测定

取本品20片，精密称定，研细，精密称取粉末适量（约相当于0.071~0.106gSMZ），置于250ml容量瓶中，加入95%乙醇50ml，振摇10分钟，溶解，以NaOH溶液0.1mol/L稀释至刻度。用于燥滤纸过滤，弃去初滤液，取10ml续滤液于100ml容量瓶中，以0.1mol/LNaOH溶液稀释至刻度，得I液。精密吸取I液25ml置另一100ml容量瓶中，以NaOH溶液0.1mol/L稀释至刻度得II液。测定I液287nm处的吸收率，测定II液在257nm和304nm波长处的吸收度差值，按工作曲线或回归方程吸收系数计算二组分的含量。

相当于标示量%=

测得含药量/（标示量/平均片重）´1/W样品´100%

思考题：

简述双波长分光光度法原理及波长选择原则。

实验九

维生素C注射液的分析

一、目的要求：

1．掌握注射液分析的特点及附加成分的干扰与排除方法。

2．掌握维生素C注射液鉴别和含量测定的原理和方法

二、实验内容

（一）鉴别

取本品适量（约相当于维生素C0.2g），加水稀释至10ml，照下述方法试验。

1．取溶液5ml，加硝酸银试液0.5ml，即生成银的黑色沉淀。

2．取溶液5ml，加二氯靛酚钠试液1-2滴，试液的颜色即消失。

（二）含量测定

1．碘量法

精密量取本品适量（约相当于维生素C0.2g），加水15ml与丙酮2ml，摇匀，放置5分钟，加稀醋酸4ml与淀粉指示液1ml，用碘液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝色并持续30秒钟不褪，即得。每1ml的碘液（0.1mol/L）相当于8.806mg的C5H5O5。

本品含维生素C应为标示量的90.0~110.0%。

2．比色法

（1）标准曲线的制备

精密称取维生素C对照品约100mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液5ml置另一100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（50μg/ml）。

分别精密量取以上对照品溶液2、3、4、5、6ml，置25ml量瓶中，加水稀释至10ml，加1，10-菲咯啉-铁（II）试液[取1，10-菲咯淋（一水物）0.198g，加盐酸（1mol/L）2ml和硫酸铁铵0.16g，加水溶解并稀释至100ml。]1ml，混匀，加水稀释至刻度，摇匀，于510nm的波长处测定吸收度。用吸收度对对照品量（mg）回归，即得。

（2）维生素C注射液的含量测定

精密量取本品适量（约相当于维生素C500mg），置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（100μg/ml）。

精密量取供试品溶液2ml于25ml量瓶中，加水稀释至10ml，加入1,10-菲咯啉一铁（II）试液1ml，以下按照标准曲线方法操作。根据供试品溶液的吸收度和标准曲线计算出维生素C的含量，即得。

三、说明：

1．在酸性溶液中铁（II）氧化抗坏血酸生成去氢抗坏血酸，同时铁（II）被还原成亚铁离子，后者与1，10-菲咯啉络合生成红色的亚铁菲咯啉离子Fe（C12H8N2）32+，在波长510mm处有最大吸收

。可用作抗坏血酸及其制剂的含量测定。反应式为：

2．经试验，注射剂中抗氧剂焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等不干扰测定。

思考题:

1．试简述维生素C的结构与分析方法之间的关系。

2．用碘量法测定含量时，加入丙酮和稀醋酸的目的是什么？

3．用比色法测定维生素C含量时，空白对照溶液如何制备？实验中应注意哪些问题，才能保证实验结果的准确？

实验十

复方乙酰水杨酸片的含量测定

一、目的要求：

熟悉复方制剂含量测定的特点

二、操作步骤：

1．乙酰水杨酸的含量测定

称取本品10片，精密称定，研细，精密称取细粉适量约相当于乙酰水杨酸0.4克，置分液漏斗中，加水15ml，摇匀，用氯仿振摇提取三次（20,20与10ml）氯仿液用同一份水10ml洗涤，合并氯仿液，置水浴上蒸干，残渣用中性乙醇（对酚酞指示液呈中性）20ml溶解后，加酚酞指示液3滴，用氢氧化钠液（0.1mol/L）滴定。即得（每1ml0.1mol/L的氢氧化钠溶液相当于18.02mg的C9H8O4）。

2．非那西丁的含量测定

精密称取上述细粉适量（约相当于非那西丁0.3克）置锥形瓶中，加稀硫酸25ml，加沸石数粒，瓶口放一小漏斗（或附加回流冷凝管），置石棉网上微沸40分钟，放冷至室温。将析出的水杨酸。经棉花过滤至200ml的烧杯中，滤渣及锥形瓶用盐酸溶液（1→2）40ml，分数次洗涤，每次5ml，合并滤液与洗涤液，加溴化钾3克，溶解后，将滴定管的尖端插入液面下约2/3处，在不低于20℃的温度下用亚硝酸钠溶液（0.1mol/L）迅速滴定，随滴随搅拌。至近终点时，将滴定管尖端提出液面用少量的水将尖端洗净，洗液并入溶液中，继续缓缓滴定至用玻棒蘸取少量的溶液，划到含锌碘化钾溶液的试纸上，立即显蓝色的条痕。停止滴定3分钟后，再蘸取少许溶液，再划一次，如仍立即显蓝色条痕，即为至终点，即得（1ml的亚硝酸钠溶液（0.1mol/L）相当于17.92mg的C10H13O2N）。

3．咖啡因的含量测定

精密称取上述细粉适量（相当于咖啡因50mg），加稀硫酸5ml振摇数分钟使咖啡因溶解，用棉花滤过，滤液置50ml容量瓶中，滤器与滤渣用水洗涤3次，每次5ml，合并滤液与洗液。精密加碘液25ml用水稀释至刻度，摇匀。在约25oC避光放置15分钟，用干燥的滤纸过滤，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，用硫代硫酸钠液（0.05mol/L）滴定，至近终点，加淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失，并将测定结果用空白试验校正，即得（1ml的碘液0.05mol/L）相当于2.653mg的C8H10O2N4H2O）。

思考题：

复方阿司匹林片中阿司匹林测定时，氯仿提取的目的是什么？

亚硝酸钠法适于哪类结构药物的含量测定？应注意什么？

咖啡因含量测定为何要作空白试验校正？

实验十一

维生素B1片剂的含量测定（差示分光光度法）

一．目的要求

1．掌握差示分光光度法消除可能存在干扰的原理；

2．熟悉△A法的基本测定方法。

二．基本原理

差示分光光度法（简称△A法），既保留了通常的分光光度法简易快速，直接读数的优点，又无需事先分离，并能消除干扰。其原理为在两种不同的pH介质中若经适当的化学反应后，供试品中待测组分发生了特征性的光谱变化，而赋形剂或其他共存物则不受影响，光谱行为不发生变化，从而消除了它们的干扰。在测定时，取两份相等的供试溶液，经不同的处理（如：调节不同的pH值或加入不同的反应剂）后，一份置样品池中，另一份置参比池中，于适当的波长处，测其吸收度的差值（△A值），根据标准曲线或△E1%

1cm值计算出组分的含量。

三．操作步骤

1．测定波长的选择

精密称取维生素B1

100mg，用水溶解并稀释成100ml。精密量取2.0ml二份，分别用缓冲液（pH7.0）和盐酸盐（pH2.0）稀释成100ml（浓度为0.002%）。以相应溶剂为空白，测定紫外吸收光谱再将前者放于参比池，后者放于样品池，绘制差示吸收光谱。差示光谱表明在247nm处有最大差示吸收值（△A）。确定247nm为测定波长。

2．标准曲线绘制

精密称取干燥至恒重的维生素B1

50mg，置100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度；摇匀，作为贮备液，精密量取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml贮备液各二份，分别置50ml量瓶中。一份用缓冲液稀释至刻度，另一份用盐酸盐稀释至刻度，摇匀，取上述五组浓度相同，pH不同的溶液，在247nm处分别测定差示吸收值（△A）。以浓度C为横坐标，以差示吸收值△A为纵坐标绘制标准曲线。

3．样品的测定

取本品20片，精密称定，研细。精密称取适量粉末，（约相当于维生素B1

50mg），置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液。精密量取续滤液1.0ml二份，分别置50ml量瓶中，分别用缓冲液和盐酸液稀释至刻度，摇匀。将前者置参比池中，后者置样品池中。在247nm波长处测定差示吸收值。由标准曲线求得维生素B1浓度，计算维生素B1片含量（标示量的百分含量）。

四．注释

1．缓冲液（pH7.0）:取磷酸二氢钾0.68g，加氢氧化钠（0.1mol/L）29.1ml,用水稀释至100ml，即得。

2．盐酸盐（pH2.0）:取盐酸9ml，。加水稀释成100ml。取10ml,

加水稀释成1000ml,即得。

3．所给测定波长仅供参考，可照"测定波长的选择"项下自行测定。

4．本实验线形范围为10—30ug/ml,

其回归方程：△A=0.002+0.0213C，r=0.9996

五．思考题

1．试述差示分光光度法如何消除干扰物的影响。

2．差示分光光度法用于制剂分析或原料药测定，主要有哪几种方法类型？

实验十二

氯霉素滴眼液的高效液相色谱分析法

一、目的要求

1．学习内标法和外标法测定组分的含量。

2．了解高效液相色谱仪的结构及正确使用。

二、基本原理

内标物可以消除仪器与操作或制备样本时带来的误差，精密称取样品后，加入一定量的内标物，然后制成适当溶液进样分析。根据样品和内标物的重量及其相应的峰面积比，求出某组分的含量。

外标法又称校正法或定量进样法。本法要求能准确地定量进样。配制一系列已知浓度的标准液，在同一操作条件下，按同量注入色谱仪，测量其峰面积（或峰高），作峰面积（或峰高）与浓度的标准曲线。然后在相同条件下，注入同量样品溶液，测量待测组分的峰面积（或峰高）根据标准曲线，计算样品中待测组分的浓度。

三、操作步骤

（一）实验条件

色谱仪

AGILENT1100型高效液相色谱仪

DiamonsilC18柱(150mm×4.6mm,5μm)

温度

室温

流动相

内标法

甲醇：水（60:40）

外标法

甲醇：水（80:20）

流速0.7ml/min

检测波长

280nm

标准贮备液的制备

1mg/ml氯霉素标准贮备液的配制

精密称取氯霉素100mg至100ml容量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度。

2mg/ml对硝基苯酚（内标）标准贮备液的配制

精密称取对硝基苯酚约200mg置100ml量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度。

（三）内标法测定氯霉素的含量

相对校正因子的测定

分别精密吸取对硝基苯酚标准贮备液各2.5ml，置5个10ml量瓶中，再分别精密加入氯霉素标准贮备液1，2，3，4，5ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀。色谱仪基线平稳后，分别进样0.5ml得色谱图。测量对硝基苯酚及氯霉素的峰面积或峰高，按公式计算相对校正因子：

fi内标

=（W

i

/A

i）/（W内标

/A内标）或f

i内标

=（W

i

/h

i）/（W内标

/h内标）

式中：Wi-氯霉素重量；

W内标-对氯霉素的峰面积（峰高）；

A内标（h内标）-对硝基苯酚的峰面积（峰高）。

本实验中，由于峰形较窄，可采用峰高法。

样品含量测定

精密吸取滴眼液适量（约相当与氯霉素5.0mg，标示量为2.5mg/ml），置10ml容量瓶中，并加入对硝基苯酚的贮备液2.5ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样0.5ml，得色谱图。按下式计算标示量的百分含量。

标示量=

（W

i

/W

）´100%=（h´

W内标）/（h内标´

W样）

（四）外标法测定氯霉素的含量

1．标准曲线的制备

分别吸收氯霉素标准贮备液各1，2，3，4，5ml置10m容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，各进样0.5μl，以峰高对浓度作图，得标准曲线，并算出回归方程。

2．样品测定

精密吸取滴眼液适量（约相当于氯霉素2.5mg）置10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样0.5μl，以峰高对浓度作图，得标准曲线，并算出回归方程。

2．样品测定

精密吸取滴眼液适量（约相当于氯霉素2.5mg）置10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样0.5μl，得色谱图、根据峰高从标准曲线上查得或根据回归方程式算得标示量的百分含量。

思考题：

1.内标法测定药物含量的优点是什么？

2.如何计算理论塔板数和分离度？

Exp13

DeterminationofAlcoholinBelladonnaTinccture

Object:

Tofamilarizethequantitativedeterminationofalcoholintinctureusinggaschromatograph.

Instrumentsandchemicals:

1).Equipment:MODEL100GasChromatograph.

2).Column:I.D.4mm+

2mstainlesssteelcolumnpackedwithchromosorbWwhichwascoatedwithPEG2000(15%).

3).Chemicals:absoluteethanol(AR)

n-propyylalcohol(AR)(internalstandard)

Method:Using

FID

1).Conditionofchromatograph:

Detecter:FID(flame-ionizationdetector)

Columntemperature:75℃

Injectionporttemperature:110℃

Detector

temperature:125℃

Flowrate:

N2

:20ml/min

Air:800ml/min

H2:80ml/min

Sensiticity:10

Attenuation:8

Samplevolumeinjected:0.4μl

2).Procedure:

Methodusingquantitativecorrectionfatcor:

a).Determinationofquantiyativecorrectionfactor:

Pipetaccurately5mleachofabsoluteethylalcoholand

π-propylalcoholintothe100mlvolumetricflask,dilutewithwatertovolume.Shakethoroughly.Inject0.4μlofthesolutionintogaschromatograph.Repeatthisoperationmorethan3times,calculatecorrectionfactor(fi)foreachinjectionandmeanvalue(f)offi

.

fi

=Ap/Ae×Vp/Ve

f=(f1+f2+f3

+

……)/n

Ap:peakaeraoftheπ-propylalcohol

Ae:peakaeraofalcohol

Ae:volumeofπ-propylalcoholaddedintheflask

Ve:volumeofalcoholaddedintheflask

b).Measuermentofalcoholintincture:

Pipetaccurately8mlofBelladonnatinctureand5mloftheinternalstandardto100mlvolumetricflask,dilutewithwater,mix.Inject0.4μlofthesolutioninto

chromatographandthencalculatethepeakarearatios(Ae/Ap).Repeat2to3injections.CalculatethecontentofalcoholwiththemeanvalueofAe/Apasthefollowing:

contentofalcoholinthetincture(v/v%)=(fi×Ae/Ap×Vp/Vtin)×100%

Ae:areaofalcoholintincture

Ap:areaofalcoholintincture

Vtin:volumeoftincturepipeted

Vp:volumeoftinctureintinctuer

Methodwithstandardcurve:

a).Makingstandardcurve:

Prepare5standardsolutionbypipeting3.0,4.0,5.0,6.0,and7.0mlofabsoluteethylalcolholinto100mlvolumetricflaskinwhich5mlofinternalstandardhasbeenadded,diluteeachtovolumewithwaterandmixthoroughly.Inject0.4μlofstandardso