分子白云第六周rna part

RNABiology–PartIIIP2Theaccuracyoftranslation1、mRNA的错误翻译<10-62、Twotypesoferrorsfromtheribosome:Frameshift移码突变:~10-5Incorrectaminoacid:~5x10-43、Twotypesoferrorsfroman氨酰-tRNA合成酶:Wrongaminoacid、WrongtRNAP3SmallnuclearRNA(snRNA)小核RNA——eukaryoticcellnucleus•100-300nucleotidesinsize•许多snRNA是剪接体的组分：Majorspliceosome:U1,U2,U4,U5,U6Minorspliceosome:U11,U12P42种snRNA•Sm-classsnRNA•Lsm-classsnRNAP6SmallnucleolarRNA(snoRNA)小核仁RNA指导其他RNAs的初级化学修饰(rRNA,tRNA,snRNA)两种snoRNA•C/DboxsnoRNAs•H/ACAboxsnoRNAsP7RNApairingwithboxC/DsnoRNAstoguidemethylationreactions甲基化.P8RNApairingwithboxH/ACAsnoRNAstoguidepseudouridylylations假尿苷化.P9Non-codingRNAs非编码RNAsHousekeepingncRNAs：tRNA,rRNA,snRNA…RegulatoryncRNAs：miRNA、lncRNA…P10microRNAs(miRNAs)微RNA真核生物基因组编码（内源的）的(~22-ntlong)RNAmolecules.Thehumangenomehas>1000genescodeformiRNAs(~5%ofthegenome).Atleast30%ofourgenesareregulatedbymiRNAs,miRNAs参与RNAinterference(RNAi).RNAinterference(RNAi):Aprocessbywhichshort(21to23)nucleotideantisenseRNAs,derivedfromlongerdouble-strandedRNAs,canmodulateexpressionofmRNAbytranslationinhibitionordegradation.RNA干扰指由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的技术。P13miRNA-mRNA相互作用的模型1.The“seed”region:nucleatesthemiRNA-mRNAassociation.2.Bulgeormismatchesinthecentralregion:precluding排除thecleavageofmRNA.3.Reasonablecomplementarityonthe3’endtostabilizethisinteraction.P14ShortinterferingRNA(siRNAs)干扰小RNA外源合成或病毒产生的RNAiP17miRNApathwayPrimarymiRNAtranscripts(pri-miRNA)areatleast1000ntlong,containsingleorclustereddouble-strandedhairpinswithsingle-stranded5’and3’-terminaloverhangs.DNARNApol=2\*ROMANIIpri-miRNADroshaandDGCR8pre-miRNADicermiRNAduplexcleavageP20Precursor先驱miRNA(pre-miRNA)Pre-miRNAisexportedtothecytoplasmbyExportin-5andRanGTP.P21Dicer:anendoribonuclease内切核糖核酸酶responsibleforcleavinglongdsRNAsand/orpre-miRNAstodsRNAduplexesofaspecificlengthdsRBP:double-strandedRNA-bindingprotein.siRNA介导沉默的机理：转录后水平的mRNA的降解以及染色体水平上形成异染色质。siRNA介导mRNA的降解需要核酸酶的催化以及镁离子的帮助。miRNA的功能：装载成RISC后使互补配对的mRNA降解；miRNA也可抑制mRNA的翻译，降低靶基因的蛋白水平但不影响其mRNA的水平。P25RISC:RNA-inducedsilencingcomplexRISCloadingcomplex(RLC):acomposedofatleastArgonaute(Ago),Dicer,andadsRBP.RLCgeneratediceddsRNAandloaditontoArgonaute.RISC装载与链选择一致。Argonaute(Ago)为一种蛋白，具体名字未查到。siRNAmiRNAsiRNAmiRNAP29Post-initiationtranslationrepression后起始翻译抑制A、Blockingtranslationelongationorpromotepre-maturedissociationofribosomes.阻断翻译延长或促进成熟核糖体解离。B、Translationisnotinhibitedbutthenascentpeptidechainisdegradedco-translationally.翻译不抑制，但新生肽链边合成边降解。AgocancompetewitheIF4Eforbindingtothe5’capstructure.Ago与eIF4E竞争结合到5’cap结构。B、AgocanrecruiteIF6,whichpreventsthelargeribosomalsubunitfromjoiningthesmallsubunit.阻止核糖体大小亚基结合。P31Deadenylation脱腺苷化degradationA、AgocanpreventmRNAcircularization环化B、miRNAtriggersdeadenylationandsubsequentlydecapping脱盖P33ApplicationsofRNAi•Usedinavarietyoforganisms用于各种生物•High-throughputscreens高通量筛选•ThedevelopmentofRNAiasatherapeuticstrategy治疗策略•miRNAasbiomarkersanddiagnosticsmiRNA作为生物标志物和诊断P34Agenome-wideRNAiscreenforinfluenzavirus流感病毒hostcellularfactors.P35miRNAsasbiomarkers.一、C值(C-Value)：在每一种生物中其单倍体基因组的DNA总量是特异的，被称为C值。C值悖论：物种的C值和它进化的复杂性之间没有严格的对应关系，这种现象称为C值悖论。注：高等生物具有比低等生物更复杂的生命活动，所以理论上应该是它们的C值也应该更高。但是事实上C值没有体现出与物种进化程度相关的趋势。高等生物的C值不一定就意味着它的C值高于比它低等的生物。这种生物学上的DNA总量的比较和矛盾，称为C值悖论。二、长链非编码RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)：lncRNA是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白的RNA。（1stidentifiedintheearly1990’s:Xist&H19）注：LncRNAXist(Xchromosomeinactivespecifictranscript)就是通过调节目的基因使CpG岛发生甲基化，抑制X染色体基因的表达来介导X染色体失活;基因组印记是指来自亲本的等位基因传递给子代时发生了修饰，使带有亲本印记的等位基因表达与亲本不同的性状。而H19LncRNA对维持人类11号染色体近端的IGF2受体-H19基因组印迹具有非常重要的作用lncRNA特点：lncRNA的表达受调控，呈现组织和细胞特异性。物种之间保守性差它们包含许多类型的转录本，在结构上类似mRNA，有时也转录成编码基因的反义转录本。相当一部分lncRNA只位于细胞核内。lncRNA被认为执行了重要的调控功能，也与疾病发展息息相关lncRNA的分类AntisenselncRNA(反义长非编码RNA)Intronictranscript(内含子非编码RNA)BidirectionallncRNAs（双向lncRNA）IntergeniclncRNAs（基因间lncRNA）注：刘默芳老师课件中的分类：对lncRNA的研究方法染色质标记：启动子区：组蛋白H3赖氨酸4三甲基化（H3K5me3）转录单位：组蛋白H3赖氨酸36三甲基化（H3K36me3）CAGE-seq：加帽的RNA片段的测序转录物的精确开始3P-seq：多聚腺苷酸化的末端测序转录物的精确末端注：如何排除IncRNA编码蛋白的潜力TranslatelncRNAsinall3frames，并对蛋白质家族和结构域数据库进行同源性检索CSF：密码子替代频率RibosomeProfiling（源自刘默芳老师PPT）RNA分子功能鉴定：基因表达分析：High‐throughputRNAseqRNA合成动态分析：Bromouridelabel+RNAseq翻译水平检测：RibosomeProfilinglncRNA的作用机制Decoy(诱饵)：lncRNA可以阻止调节蛋白进入DNA，结合其它调控RNA或蛋白并屏蔽其功能eg.Gas5糖皮质激素受体（GR）的DNA结构域与糖皮质激素反应元件（GRE）相结合代谢转录基因饥饿条件下Gas5被诱导，Gas5结构类似于GR的DNA结合位点，即Gas5-GRinteractionsGR-GREinteractionsScaffold（支架）：lncRNA可以作为衔接子使两种或多种蛋白质空间上更接近，作为相关分子元件组装的平台eg.HOTAIR（HOXtranscriptantisenseintergenicRNA）2148-nt，能形式独立的结构域。其5'结构域结合PRC2复合物，其3'结构域结合LSD1-CoREST复合物，协调H3K27甲基化和H3K4me2去甲基化，导致基因沉默Guide（向导）：lncRNA可以指导DNA招募蛋白质，即指导核糖核蛋白复合物定位eg.Xist（X-inactivespecifictranscript）：在人中为17kbX染色体失活过程的主要原因有两个功能：定位到DNA和沉默基因表达lncRNA的功能X染色体失活，基因组印记及染色质修饰，转录激活/沉默，核内运输等三、核酶ribozyme：主要指一类具有催化功能的RNA，亦称RNA催化剂1.核酶的历史：核酶的发现从根本上改变了以往只有蛋白质才具有催化功能的概念，为此Cech和Altman获得了1989年的诺贝尔奖。T.Cech的重要发现开始于1981年。研究目的：细胞中DNA转录成rRNA后，rRNA中一些“内含子”（intron），如何从RNA分子中剪切下来的。根据过去传统的概念，这一过程必须要有蛋白质酶来完成。研究对象：原生动物四膜虫，其含有一种RNA，组成中除了核糖体RNA外还有一个由413个核苷酸组成的插入序列（interveningsequenc，IVS）。研究发现：转录产物rRNA前体很不稳定，在鸟苷和Mg2+存在下切除自身的413个核苷酸的内含子（IVS），使两个外显子拼接起来，变成成熟的rRNA分子。催化反应是在没有任何蛋白质酶的存在下发生的，称为自我剪接。首次发现rRNA基因转录产物的I型内含子剪切和外显子拼接过程可在无任何蛋白质存在的情况下发生，证明了RNA具有催化功能。为区别于传统的蛋白质催化剂，Cech给这种具有催化活性的RNA定名为核酶。1983年Altman等人在研究细菌RNaseP时发现研究目的：t-RNA分子的剪接过程。核糖核酸酶P是一种核糖核蛋白,含有一个单链RNA分子,长度为375个碱基，结合一个相对分子质量为20kDa的多肽(119个氨基酸残基)。过去都认为核酸酶P的催化作用由RNA和蛋白质共同完成的。而该实验证明，核酸酶P的催化作用是由RNA完成的，而其中的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用。研究发现：在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，核酸酶P（ribonucleaseP，RNaseP）中的RNA能够切割tRNA前体的5端。随着研究的深入，Cech发现L-19RNA在一定条件下，能以高度专一性的方式去催化寡聚核苷酸底物的切割与连接。核酶可以识别底物RNA的特定序列，并在专一性位点上进行切割，其特异性接近DNA限制性内切酶，高于RNase，具有很大的潜在的应用价值。2.核酶的特点•具有催化活性的RNA•可以表征酶活性•催化活性可以是分子间或分子内（一轮）•核糖体是核酶！3.核酶的分类：剪接型核酶：指RNA分子被磷酸二酯酶水解切割后，伴随着形成新的磷酸二酯键，即磷酸二酯键的转移反应或称转酯反应。其作用机制是通过既剪有接的方式除去内含子I类内含子：一类具有酶催化功能的内含子,转录成RNA后可以自我剪接。此类内含子转录后可以形成9个由碱基配对形成的特定二级结构，分别命名为P1至P9,P1和P7是保守的。P3，P4，P6和P7的核心区域具有催化性在剪接反应中,要有一种鸟嘌呤核苷(含有游离的3'-OH)G-OH。G首先结合到内含子的5'端,当线性的内含子成为环状时,其3'端可以距离5'端15个核苷酸以外,从而将原来的5'端和15个碱基(或以上)的节段(包括G)切除出去。这种自我剪接,是由RNA的特定序列的核酸内切酶的活性所催化。剪切型核酶：这类RNA进行自身催化的反应是只切不接。特点是在Mg2+或其他二价金属离子存在下，在特定的位点，自我剪切，产生5‘-OH和2’，3‘-环磷酸二酯末端。eg.RNaseP可剪切前体5‘端41nt,5’端成熟。不同tRNA的5’端没有顺序共同性，剪切的准确性与剪切部位周围的核苷酸顺序无关，表明在RNaseP的组分内没有引导序列，RNaseP所识别的是底物的高级结构。锤头型核酶对切割位点的识别位点遵守NUH规则（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）。催化过程需要二价金属离子参与。有三个双螺旋区，13个核苷酸残基保守序列，剪切反应在右上方GUX序列的3‘端自动发生四、SELEX即指数富集的配基系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)。利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体(Aptamer)。自Tuerk等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异寡核苷酸配基后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具。1.原理：基本思想是体外化学合成一个单链寡核苷酸库，用它与靶物质混合，混合液中存在靶物质与核酸的复合物，洗掉未与靶物质结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，以此核酸分子为模板进行PCR扩增，进行下一轮的筛选过程。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的DNA或RNA分子被洗去，而"适配子"(Aptamer)即与靶物质有高亲和力的DNA或RNA从非常大的随机文库中分离出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，从P摩尔到n摩尔，最后占据库的大多数(>90%左右)。注：SELEX首先根椐分子生物学技术，人工合成单链随机寡核苷酸文库。通常文库容量为10"一10个单链寡核苷序列。文库包括DNA文库、RNA文库、修饰化的RNA文库。文库的中间为随机序列，序列长度往往在20~40bp之间。随机序列两端是带有限制性内切酶位点的固定序列，此固定序列是多聚酶链反应及其他酶学反应相关引物的结合位点。在随机文库中，单链随机寡核苷酸分子