第4章第1节第3课时基因工程的基本操作程序

第3课时基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。.科学思维——结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。.生命观念——运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等。一、利用表达载体构建重组DNA分子是基因工程操作的第二步.克隆载体：用于大量扩增外源DNA的载体,称为克隆载体。.表达载体：使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体,称为表达载体。.构建重组DNA分子:用同种限制性内切核酸酶剪切含有目的基因的DNA片段以及表达载体,然后用DNA连接酶将它们连接起来,可完成体外重组，形成重组的DNA分子。二、将目的基因导入受体细胞是基因工程操作的第三步.将目的基因导入细菌细胞(1)感受态细胞：自然条件下，细菌的转化效率很低，通过化学和物理方法的处理可以增强细菌捕获外源DNA的能力,成为感受态细胞。(2)方法(以大肠杆菌为例)：将大肠杆菌放于低温、低浓度的CaCL溶液中,造成细胞膨胀,细胞膜通透性改变，成为感受态细胞。再在低温条件下将大肠杆菌与重组DNA分子混合,使外源DNA会附于受体细胞表面，最后进行短暂的热刺激处理,使外源DNA转入细胞。.将目的基因导入动物细胞(1)常用方法：显微注射法。(2)常用受体细胞：受精卵。.将目的基因导入植物细胞(1)常用方法：农杆菌转化法。⑵农杆菌特点：自然条件下，根癌农杆菌的Ti质粒上的T-DAN片段能整基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，错误的是()A.获取目的基因的单链片段并用含放射性的物质标记后制成探针B.可用含有目的基因的DNA探针检测基因是否转入受体细胞C.目的基因是否转录和翻译的检测方法是DNA分子杂交技术D.可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质C［将含有目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记，以此作为探针，A正确。可采用DNA分子杂交技术将含有目的基因的DNA片段用放射性同位素等做标记，以此作为探针，检测目的基因是否转入了受体细胞，B正确。目的基因是否转录出了mRNA的检测方法是分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，C错误。检测目的基因是否翻译成蛋白质，可从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交,若有杂交带出现，表明目的基因已形成相应蛋白质产物，D正确。］5.下图是将某细菌的基因导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。据图回答下列问题。(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在酶的催化下，合成互补的单链DNA,然后在的作用下合成双链DNA,从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的序列，再通过化学方法合成所需基因。(2)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有、、4种脱氧核糖核昔三磷酸和耐高温的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。(3)由基因A和载体B拼接形成的C通常称为o(4)在基因工程中，常用Ca2+处理D,其目的是［解析1(1)利用逆转录法合成目的基因的过程是：以mRNA为模板，在逆转录酶的催化作用下合成单链DNA,然后在DNA聚合酶作用下，合成双链DNA分子；根据蛋白质工程合成目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测DNA中脱氧核昔酸的排列顺序，通过化学方法合成。（2）PCR过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等条件。（3）目的基因和载体结合，形成基因表达载体。（4）在利用大肠杆菌作受体细胞时，需要先用Ca2+处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态。［答案］（1）逆转录DNA聚合酶氨基酸脱氧核昔酸（2）引物模板（A基因）（3）基因表达载体（4）使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态合到植物染色体DNA中。(3)转化方法：将目的基因插入质粒的Tz*&中，用重组Ti质粒转化农杆菌,再让农杆菌感染植物细胞，目的基因就会随T-DNA整合到植物染色体DNA中，最后通过植物组织培养技术可培育出完整的转基因植株。三、检测目的基因及其表达产物是基因工程操作的第四步.通过检测DNA可确定目的基因在受体细胞内是否稳定在在。⑴借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传。(2)PCR和核酸分子杂交技术可更加精准地鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。①运用PCR技术检测的简要步骤是：根据目的基因的序列设计PCR引物,利用待检DNA为模板进行PCR,再通过电泳或DNA测序技术鉴定PCR产物。②核酸分子杂交技术a.核酸分子杂交是指两个不同来源核酸单链的核昔酸之间碱基互补配对的过程。b.核酸探针是带有放射性或荧光标记的具有特定核昔酸序列的DNA或RNAoc.利用探针检测目的基因的简要方法是：用化学方法使待检的DNA变性成单链并固定在硝酸纤维素膜上,然后加入探针,在适当的条件下探针与互补的目的基因片段形成双链。漂洗硝酸纤维素膜去除未互补结合的探针后，若硝酸纤维素膜仍具有放射性或荧光,则可判断待检DNA中含有目的基因。.检测RNA、蛋白质以及个体水平上是否出现相应性状，可得知目的基因是否正确表达。(1)运用核酸分子杂交技术还可检测受体细胞中是否含有目的基因转录出的mRNAo如果能检测到目的基因转录出的mRNA,则说明目的基因在受体细胞内成功转录。(2)运用抗原一抗体杂交技术可以检测目的基因是否表达出相应的蛋白质。如果能探测到目的蛋白,则说明目的基因在受体细胞内成功表达。(3)观察测定个体是否表现出目的基因控制的特定性状并稳定遗传,是判断转基因成功的直接证据。判断对错（正确的打“J”，错误的打“X”）.为保证目的基因在水稻细胞中表达，载体上应含有特定的复制原点。（X）提示：基因表达需要有启动子，复制原点就是复制起点。.外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。（X）提示：复制需要以复制原点为起点，启动子与终止子是转录的起止点。.从大肠杆菌细胞中获得人胰岛素基因的mRNA,说明目的基因完成了表达。（X）提示：基因的表达包括转录和翻译，获得mRNA只能说明完成了转录。.将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。（J）.转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。（X）提示：抗虫效果的鉴定要在个体生物学水平上做抗虫接种实验来鉴定。.可通过PCR等技术检测棉花的染色体上是否插入了次基因。（J）遨Q0四1利用表达载体构建重组DNA分子.表达载体的组成及作用.表达载体的构建步骤目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。其过程大体为：用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端或平末端。一般用同一种限制酶切割目的基因和质粒，使其产生相同的黏性末端或平末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成一个重组DNA分子（重组质粒）（如图）。（1）目的基因主要是指编码蛋白质的基因，若其没有启动子，只将目的基因导入受体细胞中将无法进行转录。（2）目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒在插入目的基因的部位前面需要有启动子，后面需要有终止子。（3）鉴别目的基因是否导入受体细胞中需要有筛选标记一一标记基因。因此，一个基因表达载体的组成应该包括：启动子、终止子、目的基因、标记基因等。⑴由于受体细胞有动物细胞、植物细胞、微生物细胞之分，以及目的基因

导入受体细胞的方法不同，所以基因表达载体在构建上也会有所差别，不可能是千篇一律的。(2)基因表达载体的构建过程中，最好用同一种限制酶切割目的基因和载体,以获得相同的黏性末端或平末端，便于二者进行连接。但有时可用两种限制酶分别切割载体和目的基因，这样可避免载体与载体之间、目的基因与目的基因之间的自身连接，还可以确保目的基因和载体的正向连接。.图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRI>BamHI和3AI三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRI、Sau3\I的切点是唯一的)。图(a)图(b)根据基因工程的有关知识，回答下列问题。(1)经以7mHI酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接，理由是(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有,不能表达的原因是图(c)［解析］(1)由题图(a)可知，BamWI和Sau3AI两种限制性内切核酸酶的共mIxmIx1a.—GATC同识别序列是_CTAGmIx1a.—GATC同识别序列是_CTAG，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经mIx1a.—GATC同识别序列是_CTAG，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamH⑵在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。

［答案］（l）Sa〃3AI两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端（2）甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录遨此喜二将目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞的方法1.农杆菌转化法为什么要将目的基因插入农杆菌质粒的T-DNA片段?生物类型方法受体细胞转化过程特点植物农杆菌转化法体细胞或受精卵目的基因插入Ti质粒的T-DNA上一转入农杆菌一导入植物细胞一插入植物细胞中的染色体DNA上一目的基因表达适用于双子叶植物和裸子植物花粉管通道法在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊适用于任何开花植物动物显微注射法受精卵目的基因表达载体提纯一取卵（受精卵）一显微注射一受精卵发育一获得具有新性状的转基因动物是采用最多、最有效的方法微生物3+处理法原核细胞Ca?+处理微生物细胞f使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态一将基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中一一定温度下促使该细胞吸收DNA分子原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，从而成为最常用的受体细胞提示：Ti质粒的T・DNA片段可以整合到受体细胞的染色体上。.如果改用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞，与农杆菌转化法相比有什么优点?提示：（1）操作简便；（2）直接将目的基因导入受精卵，无须组织培养即可获得植株。（答出一个即可，其他答案合理也可）.将目的基因导入动物细胞的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。.（2020•山东泰安期中改编）下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述，错误的是（）A.可利用花粉管通道法培育转基因植物B.用CM+处理大肠杆菌，以改变大肠杆菌细胞的生理状态C.对于动物来说，受体细胞一般是受精卵D.将目的基因转入微生物细胞常用显微注射法D［可利用花粉管通道法培育转基因植物，A正确；用Ca2+处理大肠杆菌，使之处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性易于表现，C正确；将目的基因转入动物细胞常用显微注射法，将目的基因转入微生物细胞常用Ca2+处理法，D错误。］.下列关于目的基因导入受体细胞的描述，正确的是（）A.可以通过显微注射法直接将目的基因导入动物的受精卵中B.通过基因工程大量获得胰岛素时，受体细胞选择大肠杆菌比酵母菌更有优势C.可以用PEG处理大肠杆菌将目的基因导入其细胞内D.可以使用病毒将目的基因导入受体细胞D［目的基因导入受体细胞前必须进行基因表达载体的构建，不能直接将目的基因导入，A错误；酵母菌细胞中有多种细胞器，作为受体细胞生产胰岛素（分泌蛋白）比大肠杆菌更有优势，B错误；大肠杆菌作为受体细胞时应使用Ca?+进行处理，C错误；可以利用部分病毒将自身DNA整合到宿主细胞染色体上的特点构建病毒表达载体，并通过病毒的侵染将目的基因导入相关受体细胞，D正确。］懑卜0券三检测目的基因及其表达产物1.在分子水平上检测目的基因及其表达产物待检测物质检测目的检测方法DNA确定目的基因在受体细胞中是否稳定存在借助标记基因检测、运用PCR技术鉴定、利用核酸分子杂交技术鉴定RNA确定目的基因核酸分子杂交技术蛋白质是否正确表达抗原一抗体杂交技术2.常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法转基因生物检测方法观察目标抗虫植物饲喂害虫害虫死亡抗病毒（菌）植物病毒（菌）感染未侵染上病斑抗盐植物盐水浇灌正常生长抗除草剂植物喷洒除草剂正常生长4.下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否以i功导入或表达（）A.在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因B.通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因C.提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原一抗体特异性反应进行检测D.抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性A［检测目的基因是否成功导入或表达的方法有多种。①分子水平上的检测：通过FCR等技术检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA;检测目的基因是否翻译成蛋白质用抗原一抗体杂交技术。②个体生物学水平的鉴定：检测是否具有抗性及抗性程度；检测基因工程产品与天然产品的活性是否相同等。在显微镜下无法观察到受体细胞中是否含有目的基因，故选A。］5.同一人体，所有体细胞都是由同一个受精卵有丝分裂而来的，所以人体内所有细胞所含DNA相同，且具有该个体全部的遗传物质，但是由于基因的选择性表达，不同种细胞中的mRNA和蛋白质种类有所区别，如胰岛A细胞能表达胰高血糖素基因，但不会表达胰岛素基因。关于目的基因的检测与鉴定，下列说法错误的是（）A.要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，可采用PCR技术B.要检测目的基因是否转录出了mRNA,采用核酸分子杂交技术C.要检测目的基因是否翻译成蛋白质，采用抗原一抗体杂交技术，此技术要提前制备好抗原D.要进行个体生物学水平的鉴定，以确定是否赋予转基因生物相应的特性C［检测目的基因是否翻译成蛋白质，采用的方法为抗原一抗体杂交技术，此技术要提前制备好抗体（抗原为基因表达的蛋白质，可以根据抗原提前制备好抗体）。］［课堂小结］1.下列有关基因表达载体的叙述，不正确的是（）知识网络构建核心语句背诵基因工程的基.本操作程序获取目的基因构建重组DNA分子一将目的其因导入受体细胞检测目的基因1,使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体，称为表达载体。表达载体包含适当的转录和翻译信号。2,将目的基因导入细菌、动物细胞和植物细胞常用的方法分别为CM+处理法、显微注射法和农杆菌转化法。.借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传。.PCR和核酸分子杂交技术可更加精准地鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。.运用核酸分子杂交技术还可以检测受体细胞中是否含有目的基因转录出的mRNAo.运用抗原一抗体杂交技术可以检测目的基因是否表达出相应的蛋白质。A.具有复制起点，使目的基因能在受体细胞内扩增B.具有启动子，作为多肽链合成的起始信号C.具有标记基因，有利于目的基因的初步检测D.具有目的基因，以获得特定的基因表达产物B［基因表达载体必须使目的基因能够在受体细胞内进行扩增，因此要具有复制起