2017年转录组入门合辑

【PPT】文献报告-AsurveyofbestpracticesforRNA-seq 讲解............................................................................................................................................... 内 转录组相关的安 讲解.............................................................................................................................................准 其他安装笔 读文章拿到数 讲解.............................................................................................................................................文 数据.............................................................................................................................................其他学习笔 了解fastq数 讲解.............................................................................................................................................sra文件转换为fastq格 数据校验及备份存 质控 了解参考组及注 讲解.............................................................................................................................................任务列 在UCSChg19参考 从gencode数据库注释文件，并且用IGV去查看感的的结 截图几个的IGV可视化结 ENSEMBL，NCBI的gtf 序列比 任务列 比对.............................................................................................................................................hisat2的用 index文件 比对、排序、索 质量控 载入IGV，截图几个.................................................................................................................reads计 任 代码记 参考资 个人笔记平 博 .........................................................................................................................................【PPT】文献报告-AsurveyofbestpracticesforRNA-seqdataAsurveyofbestpracticesforRNA-seqdataysis我把它叫做RNA-seq数据分析指南。这篇文章是由佛罗里达大学等单位的研究在1月26日在GenomeBiology上的，该期刊的影响因子有10.8分。这是这篇文章的通讯作者，应该挺靠谱的。新一代技术在式发展的同时，也衍生出许多其他技术创新。RNA-Seq就是其中之seq可以获得相当惊人的数据量，而这恰恰是一柄双刃剑。丰富的数据量蕴含着大量的宝贵正因如此，数据分析可以说是RNA-seq的重中之重。RNA-seq有非常广泛的应用，但没有分析策略。现在人们已经了大量的RNA-seq和数据分析方案，对于刚入门的新手来说难免有些无所适从。这篇文章概述了RNA-seq生物信息学分析的准和现有资源，为人们提供了一份RNA-seq数据分析指南，可以作为开展RNA-seq研究的宝贵参考资料。这份指南覆盖了RNA-seq数据分析的所有主要步骤，比如质量控制、读段比对、和转录本定量、差异性表达、功能分析、融合检测、eQTL图谱分析等等。研究绘制的RNA-seq分析通用路线图(标准Illumina)，将主要分析步骤分为前期分析、分析从这，横轴是年份，纵轴是仪的通量，圈里面的数字代表读长。可以看到仪的通量和读长都在增加了，其中PacficBiosciences的三代仪读长最长，可以达到14K，illumina的仪通量最大，HiSeqXTen的通量可以达到1.8T。现在Illumina生从左到右，仪的通量逐渐增大，它们适合不同的样品和目的。Miseq通量比较低，适合宏组等微生物；Hiseq通量太高了，如果你送去公司，他们一般要20~30这幅图的横轴是年份，纵轴是高通量技术应用的代表性文章的量。不同的应用技术用颜色进行分类，数据点的大小跟率（率/月）成正比。可以看出RNA-Seq技术的mRNA在生物内RNA的组分中只占很小的一部分，rRNA占绝大多数。一般说RNA-seq指的都是mRNA-seq，后面的流程也都是主要针对mRNA-seq数据分析的。在科学家们的努力下，可以把那些非编码RNA提取出来建库，进序。对于Illumina，片段一般小于500bp。确定合适长度的片段是后续和分析然后呢，设定生物学重复对差异的检出率（真阳性率，TPR）的提高具有明显效果。上数据量分配到的生物学重复样本中，差异分析结果的可靠性在不断提升。对于RNA-seq，设置一些重复，差异不稳定的话有时候设置10个/20个都不够。具体问题具体分析！！深度（Sequencingdepth），也叫乘数，指每个碱基被的平均次数，是用来衡量测序量的首要参数。研究表明，增加深度，量从1.6M条reads增加到20M条reads,（75bp）10Mreads时就已经达到平衡了，80%的鸡转录本被检测到。在此基础上增直观一些说，如果某个在RNA-seq结果显示差异表达，但QPCR结果表明这个表达差异不显著，可以认为这个RNA-seq结果为假阳性；反之，这个结果就是真阳性。如表2、3所示，在一定的生物学重复数（n）的情况下，随着单样本量（Depth）的提高（25%→100%），真阳性率（TPR）都只有有限的提高。例如在n=3的情况下，单个样本的量从25%提高到100%，TPR仅仅从6.24%提高到8.95%。在表3中，如果Depth等于25%不变，当n从2提高到12，TPR的提高则是非常明显的。因此深度对结果改为n*1/n=1,保持不变）。如图A,灰色实线代表不同的生物学重复数（n）和单样本数据量高。例如n=2,TPR约为3%，如果n=6,TPR则提高到22%。但单个样本的数据量不断降低，TPR的降低十分缓慢。例如，n=3,单个样本的数据量从15%，TPR9%5%和单样本量的组合，对假阳性率（FPR）的影响却较小。如图B，灰色实线代表不同生物学重复数（n）和单样本数据量（1/n）组合的情况下，真阳性率（FPR）的变化。虽然n从2变化到96，FPR基本没有太大变化。从图中很容易发现，基于负二项分布的差异分析检验（Pvalue），FPR对生物学重复数和单个样本数据量均不敏感，始终保持低于0.1%水平。或者说，这个算法对FPR的控制还随着单价的下降，目前市场上RNA-seq类项目的单样本量正在不断提高。以2G，PE100的表达谱项目为例，其对应的量为20M条reads。如果一条长度为1kbp的低表达的表达量为RPKM=0.5，其理论上可以检测到的reads数为20×0.5=10。所以低丰度的检测，对RNA-seq这个技术来说并非最大问题。的表达量变化程度，可以使用Qpcr来验证。但往往也使用所有差异来统计某些规律。例如使用差异的pathway富集分析来寻找与性状相关的pathway。如果在全局水平的差异集并不可靠，那么pathway富集分析得出的结论的可靠性自然也受到影响。而全局水平的差异数量巨大，是难以使用Qpcr验证的。因此，定量以及差异分析的准确性是在RNA-seq中更值得关心的问题。run跑不完，为了避免技术误差造成太大的实验误差，要把样品随机分配到每个批次或runs中;(到底怎么设计，要一下！！)如果你的样品是多样品混合，每个样品要单独加上，每个lanes要保证足够的测序深度，为了保证所有的样品在每个lane中都有。如果送给公司去做的话，要选择建库llumina平台用FastQC看；其他平台的数据用NGSQC。一般会有原始数据的序列质量，GC含量，存在的接头以及K-mers子串图并且重复序列太多的reads。在下降，因此数据质量逐渐降低乃是自然趋势。常用的数据过滤的有FASTX-Reads比对后的质量控制(评估比对质量的指标)：比对上的reads占总reads的百分比；Reads比对到外显子和参考链上的覆盖度是否一致；比对到组序列：多重比对reads？录本被定量以后，应该看一下GC含量和长度偏差，确定定量的方法是否适用。把所有样本的reads混合用于转录本的拼接。二代的转录组reads用于拼接还是存在一些问题的，最终拼接结果不太理想。一个转录本的拼接结果会是10~100contigs。三代是一样的，FPKM可以转换成TPM。Cufflinks(支持双端数据，并且需要GTF格式的注RNA-seqRNA18~34个碱基，包含了miRNAs,short-interferingRNAssiRNAs)，PIWI-interactingRNAs(piRNAs)以及其他种类的**。sRNA-seqlibrariesarerarelysequencedasdeeplyasregularRNA-seqlibrariesbecauseofalackofcomplexity,withatypicalrangeof2–10millionreads.miRTools2.0atoolforpredictionandprofilingofsRNAspeciesusesbydefaultreadsthatare18–30baseslong5.比对到参考组上，比对有：Bowtie2,STAR,orBurrows-WheelerAligner(BWA)PatMaNandMicroRazerSmapshortMoreover,thecombinationofRNA-seqandre-sequencingcanbeusedbothtoremovefalsepositiveswheninferringfusiongenesandto yzecopynumberalterations.Thestatisticallysignificantcorrelationsthatwereobserved,however,accountedforrelativelysmalleffects.(DNAmethylation)一些：CORNA,MMIA,,MAGIA,and代谢组和转录组数据结合进行通路分析，有一些：MassTRIX,Paintomics,VANTEDv2,andSteinerNetRNA-seq技术已经成为转录组分析的标准方法。其相对应的技术和数据分析工具还在不断地发展。对低表达的的定量仍是一个等待解决的问题;三代技术，Smart-seq和Smart-seq2应用于转录组，所需要的样品量少，并且可以测定单细胞内的RNA表达水平;Pacbio技术可以直接测得接近全长的转录本，可以有效解决二代技术拼接较为零碎以及Win10BashonUbuntuonWindows怎么用？（安装和用法mkdirBiosoftmkdirBiosoft&cd /jmzeng/RNA-seq/RNA-seq-example-GSE81916-two-fastqchisatscdcdmkdirsratoolkit&&cd#长度：7647376973Mapplication/x-正在保存至“sratoolkit.2.8.2-1-tar-zxvfsratoolkit.2.8.2-1-cdmkdirfastqc&&cd#unzip6.unzipjava，根据系统提示安装，一般是sudoaptinstallcdmkdirHISAT&&cd#/pub/infphilo/hisat2/downloads/hisat2-2.1.0-cdhisat2-makeg++gcc，同上用sudoaptinstallrm-f*.hcdmkdirsamtools&&cd#/samtools/samtools/releases/download/1.5/samtools-长度：4190142(4.0Mapplication/octet-正在保存至samtools-tarxvfjsamtools-1.5.tar.bz2cdsamtools-1.5sudomakesudoapt-getinstallpython-pipinstall--upgradesudoapt-getinstallbuild-essentialpython2.7-devpython-numpypython-#tarxvzfHTSeq-pythonsetup.pyinstall--~/.local/bin/htseq-count--#viexport condainstall-cbiocondacondainstall-cbiocondahtseq=0.7.2condainstall-cbiocondahisat2=2.1.0condainstall-cbioconda10.condainstall-cjfear /p/27670618?utmsource=wechatsession&utmmedium=so AKAP95regulatessplicingthroughscaffoldingRNAsandRNAprocessing#esearchdbsraqueryPRJNA299273|efetchformatruninforuninfo.txt这个命SRR#catruninfo.txt|cut-f1-d','|grepSRR>~/biosoft/sratoolkit.2.8.2-1-centos_linux64/bin/prefetchoption-filesra.ids数据存在/home/shenmy/ncbi/public/sra这个文件下面，找了半天mkdir/mnt/d/rna_seq/data&&cdperl-lne'$id=substr($_,0,6);print"axelftp://ftp- RR/$id/$_/$_.sra"'SRR_Acc_List.txtbash改成用axel下是ls*.sra|whilereadid;do(/mnt/d/Software/Biosoft/sratoolkit/sratoolkit.2.8.2-ubuntu64/bin/fastq-dump--split-3rmodu-w/ncbinlm /s/LNrQNSHdcdKb25s4mFeqw 了解fastq数sra文件转换为fastq /mnt/d/Software/Biosoft/sratoolkit/sratoolkit.2.8.2-1-ubuntu64/bin/fastq-dump-Legacy3-filesplittingformate-pairs: biologicalreadssatisfyingdumconditionsareplacedinfiles*_1.fastqand*_2.fastqIfonlyonebiologicalreadispresentitisplacedin*.fastqBiologicalreadsandaboveare也就是说如果 Compressoutputusing将这些文件合并成一个tar文件，然后再使用gzip进行压缩，最后生成的.tar.gz或者.tgz文件就是所谓的“tar压缩包”或者“tarball”）Compressoutputusing1.1.ls*.sra|whilereadid;do(/mnt/d/Software/Biosoft/sratoolkit/sratoolkit.2.8.2-1-ubuntu64/bin/fastq-dump--split-3$id);done的数据是Illumina的双端4，所以用fastq-dump--split-3命令来把sra格式数据转换为fastq。perl-F'\t'-alneperl-F'\t'-alne"$F[7]\t$F[6]_$F[13]"}'SraRunTable.txt>Rename.txtperl-F'\t'-alne'print"/mnt/d/Software/Biosoft/sratoolkit/sratoolkit.2.8.2-1-ubuntu64/bin/fastq-dump--split-3--gzip-A$F[1]$F[0].sra"'Rename.txt>rmodu-w在此最开始之前应该做

数据传输完整性验证1.md5sum*.fastq.gz1.md5sum*.fastq.gz质控mkdirmkdir/mnt/d/rna_seq/work&&cdln/mnt/d/rna_seq/data/*mkdirls*.gz|whilereadid;do(/mnt/d/Software/Biosoft/fastqc/FastQC/fastqc/mnt/d/rna_seq/work/1_FastQC_Raw_Data-t-foriin*.zip;dounzip$i;perl|/mnt/d/Software/Biosoft/csvtk/csvtk293cell21.在UCSChg19参考组2.从gencode数据 5.在 hg19参 这个对新手来说，是一个很大的坑，hg19、GRCH37、ensembl75这3种 的是同样的fasta序列， 单位，即NCBI，UCSC及ENSEMBL各自发布的 样，比如BGI做的炎黄 组，还有DNA双螺旋结构提出者 有2016 hg19和hg38，都是UCSC提供的，虽然hg38相比hg19来说，做了很多改进，优点也不少，但因为目前为止很多注释信息都是针对于hg19的坐标系统来的， mkdir/mnt/d/rna_seq/data/reference&&cdmkdir-pgenome/hg19&&cd#nohup nohup tarzvfxcat*.fa>rmGRCh37ist omeReferenceConsortiumHumangenomebuild37.hg19组大小是3G，压缩后百兆。从gencode数据库注释文件，并且用IGV去查看感的的结gzip-dIGV、tar-zxvfbedtools-cd截图几个的IGV可视化结grepgrep-w'gene'gencode.v26lift37.annotation.gtf1,4,5grep-w'gene'gencode.v26lift37.annotation.gtf|grep1,4,5>>gene.bedgrep-w'gene'gencode.v26lift37.annotation.gtf1,4,5-w'TP53'|cut--w'KRAS'|cut--w'EGFR'|cut-/mnt/d/Software/Biosoft/bedtools2/bin/bedtoolsigv-igene.bed#perl-alne'{print"goto$F[0]:$F[1]-$F[2]\nsnapshot$F[3].png"}ENSEMBL，NCBI的gtf#axel/pub/grch37/release-3.axelftp://ftp.ensembl. ## 4. 出来以上里的，还有Bowtie2,BBMap,BWA,CLC,Novoalign,SMALT等，百科hisat2本作业是比对到组，所以使用gappedorsplicesmapper，此流程已经更新。TopHat首次被已经是7年前，STAR的比对速度是TopHat的50倍，HISAT更是STAR的1.2倍。10HISAT2TopHat2/Bowti2BWT算法，实现了更快的速度和更少的资源占用，作者TopHat2/Bowti2和HISAT的用户转换到HISAT2。11HELP$./hisat2-HISAT2version2.1.0byDaehwanKim hisat2[options]*-x<ht2-idx>{-1<m1>-2<m2>|-U<r>|--sra-acc<SRAaccessionnumber>}[-S<sam>]<ht2-idx>Indexfilenameprefix(minustrailing Fileswith#1mates,pairedwithfilesinCouldbegzip'ed(extension:.gz)orbzip2'ed(extension: Fileswith#2mates,pairedwithfilesinCouldbegzip'ed(extension:.gz)orbzip2'ed(extension: FileswithunpairedCouldbegzip'ed(extension:.gz)orbzip2'ed(extension:<SRAaccession Comma-separatedlistofSRAaccessionnumbers,e.g.-sra-acc FileforSAMoutput(default:stdout)<m1>,<m2>,<r>canbecomma-separatedlists(nowhitespace)andcanspecifiedmanytimes.E.g.'-Ufile1.fq,file2.fq-Ufile3.fq'.20.Options(defaultsin ueryinputfilesareFASTQ.fq/.fastq-- ueryinputfilesareinIllumina'sqseq- queryinputfilesare(multi-)FASTA- queryinputfilesarerawone-sequence-per-- <m1>,<m2>,<r>aresequencesthemselves,not-s/--skip skip <int>reads/pairsintheinput-u/--upto stop <int>reads/pairs(no-5/--trim5 trim<int>basesfrom5'/leftendofreads-3/--trim3 trim<int>basesfrom3'/rightendofreads-- qualitiesarePhred+33-- qualitiesare--int- qualitiesencodedasspace-delimited SRAaccessionID--n-ceil funcformax#non-A/C/G/Tspermittedinaln--ignore- treatallqualityvaluesas30onPhredscale-- donotalignforward(original)versionofread donotalign plementversionofread(off)Spliced--pen-cansplice penaltyforacanonicalsplicesite penaltyforanon-canonicalsplicesite--pen-canintronlen<func> penaltyforlongintrons(G,-8,1)withcanonicalsplicesites--pen-noncanintronlen<func> penaltyforlongintrons(G,-8,1)withnoncanonicalsplicesites--min-intronlen minimumintronlength--max-intronlen umintronlength providealistofknownsplice--novel-splicesite-outfile<path>reportalistofsplice providealistofnovelsplice--no-temp- disabletheuseofsplicesites--no-spliced- disablespliced--rna-strandness specifystrand-specificinformation reportsonlythosealignmentswithinknown reportsalignmentstailoredfortranscript reportsalignmentstailoredspecificallyfor triestoavoidaligningreadstopseudogenes(experimentaloption) disablestemplaengthadjustmentforRNA-seq--mp maxandminpenaltiesformismatch;lowerqual=lower--sp maxandminpenaltiesforsoft-clip;lowerqual=penalty65.--no- nosoft-66.--np penaltyfornon-A/C/G/Tsinread/ref67.--rdg<int>,<int>readgapopen,extendpenalties--rfg<int>,<int>referencegapopen,extendpenalties--score-min<func>minacceptablealignmentscorew/r/tread(L,0.0,--k<int>(default:5)reportupto<int>alnsperreadPaired--I/--minins<int>minimumfragmentlength(0),onlyvalidwith--no-spliced--X/--maxins<int> umfragmentlength(500),onlyvalidwith--no-spliced---fr/--rf/-- -1,-2matesalignfw/rev,rev/fw,fw/fw(----no- suppressunpairedalignmentsforpaired suppressdiscordantalignmentsforpairedreads-t/-- printwall-clocktimetakenbysearch--un writeunpairedreadsthatdidn'talignto--al writeunpairedreadsthatalignedatleastonceto--un-conc writepairsthatdidn'talignconcordantlyto--al-conc writepairsthatalignedconcordantlyatleastonceto(Note:for--un,--al,--un-conc,or--al-conc,add'-gz'totheoptionname,--un-gz<path>,togzipcompressoutput,oradd'-bz2'tobzip2compress--summary- printalignmentsummarytothis printalignmentsummaryinanewstyle,whichismoremachine--- printnothingtostderrexceptserious--met-file<path>sendmetricstofileat<path>--met- sendmetricstostderr--met reportinternalcounters&metricsevery<int>secs--no- supppressheaderlines,i.e.linesstartingwith--no- supppress@SQheader--rg-id setreadgroupid,reflectedin@RGlineandRG:Z:opt--rg add<text>("lab:value")to@RGlineofSAMNote:@RGlineonlyprintedwhen--rg-idis put'*'inSEQandQUALfieldsforsecondary-o/--offrate<int>overrideoffrateofindex;mustbe>=index's-p/--threads<int>numberofalignmentthreadstolaunch-- forceSAMoutputordertomatchorderofinput usememory-mappedI/Oforindex;many'hisat2'scan--qc-filteroutreadsthatarebadaccordingtoQSEQ--seedseedforrandomnumbergenerator --non-deterministicseedrand.gen.arbitrarilyinsteadofusingread--remove-remove'chr'fromreferencenamesin--add-add'chr'toreferencenamesin--printversioninformationand-h/--printthisusagecdcdmkdir-pindex/hisat&&cdwget-cwget-ctarzxvftarxvzf把fastq格式的reads比对上去得到sam文件，接着用samtools把它转为bam文件，并且接输出BAM文件12。~/biosoft/HISAT/current/hisat2-p5-x$reference-USRR3589959.fastq-Scontrol_1.sam2>control_1.log~/biosoft/HISAT/current/hisat2-p5-x$reference-USRR3589960.fastq-Scontrol_2.sam2>control_2.log~/biosoft/HISAT/current/hisat2-p5-x$reference-USRR3589961.fastq-SAkap95_1.sam~/biosoft/HISAT/current/hisat2-p5-x$reference-USRR3589962.fastq-SAkap95_2.samls*sam|whilereadid;do(nohupsamtoolssort-n-@5-o${id%%.*}.Nsort.bam$id在上面的基础进行修改，编写bash #!set-uset-set-o11.ls--color=neverHomo*1.fastq.gz|whilereadid;do(~/biosoft/hisat2-2.1.0/hisat2-t-$NUM_THREADS-x$hg19_ref-1$data_path/${id%_*}_1.fastq.gz-$data_path/${id%_*}_2.fastq.gz2>${id%_*}_map.log|samtoolsview--13.ls--color=neverMus*1.fastq.gz|whilereadid;do(~/biosoft/hisat2-2.1.0/hisat2-t-p$NUM_THREADS-x$mm10_ref-1$data_path/${id%_*}_1.fastq.gz-2$data_path/${id%_*}_2.fastq.gz2>${id%_*}_map.log|samtoolsview--15.ls--color=never*.bam|whilereadid;do(samtoolssort--threads$NUM_THREADS$id-16.ls--color=never*_sorted.bam|whilereadid;do(samtoolsindex：bashbamreadsreads比对 组序列,多重比对~/biosoft/qualimap_v2.2.1/qualimaprnaseq-Homo_sapiens_Control_293_cell_sorted.bam-outdirHomo_sapiens_Control_293_cell_sorted_QC-pe-s--java-mem-size=60G-gtfcondainstallcondainstallucsc-gtfToGenePred-genePredExt-ignoreGroupsWithoutExons-geneNameAsName2gencode.v26lift37.annotation.gtfgencode.v26lift37.annotation.gpdgzip-djava-jar~/biosoft/picard_2.8.0/picard.jarCollectRnaSeqMetrics bam_stat.py-i载入IGV 看上去很类似fastq文件，它也有readread名称mate名称，记录matepairchromosomeCIGAR 详情samreadnamereadscountls--color=never*.bam|whilereadid;do(samtoolssort-n--threads40$id-ls--color=never*_sorted_name.bam|whilereadid;do(samtoolsindexreadsname#[E::hts_idx_push]unsorted#samtoolsindex:"Homo_sapiens_AKAP95_KD_miR_12_293_cell_sorted_name.bam"iscorruptedorunsortedsamtoolssort-n--threads30Homo_sapiens_AKAP95_KD_miR_12_293_cell.bam-osamtoolsviewHomo_sapiens_AKAP95_KD_miR_12_293_cell_sorted_name.bam|less-pos排序的文件小些，为什么呢？因为按照位置排序相似的内容会排在一起，按照采用默认的pos排序。提高文件的压缩比例。BAMsort缩比提高了，因此排序之后的BAM文件变小了，相对应的SAM文件就是纯文本文件，对SAM文件进行排序就不会改变文件大小。而且由于RNA-seq中由于表达量的关系，RNA-seq的数据比对结果BAM文件使用samtools进行sort之后文件压缩比例变化会比DNA-seq更甚。另外，samtoolsBAMreads会被放From:Gainingcomprehensivebiologicalinsightintothetranscriptomebyperformingabroad-spectrumRNA-seq FigureTheRNACocktail ysisprotocol.RNACocktailisacomprehensiveprotocolofRNA-seq ysis.ThefiguresummarizesthewidelyusedapproachesforthekeystepsoverthebroadspectrumofRNA-seq ysisandalsosuccinctlycapturesthepossibleworkflowsonecanuseto yseRNA-seqdatabedtoolsusageusage:htseq-count[options]alignment_file<alignment_file>：比对到组后得到的SAM文件（SAMtools包含一些perl可以将大多数的比对文件转换成SAM格式），注意组map时一定要用支持剪接的比对（splicing-awarealigner）进行比对如TopHat.HTSeq-count需要用到SAM格式中的CIGAR区域的信息。<gff_file>:包含单位信息的gff/GTF文件（gff文件格式），大多数情况下就是指注释文件 由GTF文件其实就是gff文件格式的变形，在这里同样可以传入GTFThisscripttakesoneormorealignmentfilesinSAM/BAMformatandafeaturefileinGFFformatandcalculatesforeachfeaturethenumberofreadsmap toit.Seeforpositional PathtotheSAM/BAMfilescontainingthemapped If'iselectd,adfrmstndardinut想通过准输入来传入 组map 到SAM文，用–替换<aligmetfile>即可 Pathtothefilecontainingthefeaturesoptional-h,-- showthishelpmessageand-f{sam,bam},--formattypeof<alignment_file>data,either'sam'or(default:指定输入文件的格式，<format可以是samfortextSAMfiles)bam(forbinaryBAMfiles)-r{pos,name},--order'pos'or'name'.Sortingorderof(default:name).**Paired-endsequencingdatamustbesortedeitherbypositionorbyreadname,andthesortingordermustbespecified.**Ignoredforsingle-enddata.如果你是双端，必须要对SAM进行排序（单端可不必排序，但这里我也对单端结果排序已减少内存消耗并提高效率），对readname或 排序皆可（这里我按readname排序，因为通过位置排序我遇到过错误）。具体需要通过-r参数指定，所以排序请详见参数-r，在sort时用-n则不用修改，默认的排序则修改成pos。When<alignment_file>ispairedendsortedbyposition,allowonlysomanyreadstostayinmemoryuntilthematesarefound(raisingthisnumberwillusemorememory).Hasnoeffectforsingleendorpairedendsortedbyname-s{yes,no,reverse},--strandedwhetherthedataisfromastrand-specificassay.Specify'yes','no',or'reverse'(default:yes).'reverse'means'yes'withreversedstrand是否链特异性，如果不是修改成-aMINAQUAL,--minaqualskipallreadswithalignmentqualitylowerthanthegivenminimumvalue(default:指定一个最低read -tFEATURETYPE,--typefeaturetype(3rdcolumninGFFfile)tobeused,allfeaturesofothertypeareignored(default,suitableforEnsemblGTFfiles:exon)指定最小计数单位类型（gff文件的第3列中的类型如：exon）,指定后其他单位类型将被忽略（默认情况下，对于rna-seq分析采用EnsemblGTF： -iIDATTR,--idattrGFFattributetobeusedasfeatureID(default,suitableforEnsemblGTFfiles:最终的计数单位，一般为。默认为：gene_id需要改成gene_name，可以直接识别，如果是gene_id--additional-attrADDITIONAL_ATTR[ADDITIONAL_ATTRAdditionalfeatureattributes(default:none,suitableforEnsemblGTFfiles:-m{union,intersection-strict,intersection-nonempty},--mode{union,intersection-modetohandlereads morethanone(choices:union,intersection-strict,intersection-nonempty;default:判断一个reads属于某个的模型，用来判断统计reads的时候对一些比较特殊的reads定义是否计入<mode>unionintersection-strict、intersectionnonempty（--nonuniqueWhethertoscorereadsthatarenotuniquelyalignedorambiguouslyassignedto-oSAMOUTS[SAMOUTS...],--samoutSAMOUTS[SAMOUTSwriteoutallSAMalignmentrecordsintoanoutputSAMfilecalledSAMOUT,annotatingeachlinewithitsfeatureassignment(asanoptionalfieldwithtag'XF')出所有algnment的reads叫<samout>的sam件中通过个可选的sam ‘XF来标注一对应的位计数，以设-q, s