脑室内注射胰岛素对大鼠全脑缺血后海马CA1区Bcl

脑室内注射胰岛素对大鼠全脑缺血后海马CA1区Bcl李兵，章翔，蒋小帆，王彦刚，张戈【关键词】胰岛素；脑缺血；Bl关键词：胰岛素；脑缺血；Bl2TheeffetfintraventriularadinistratinfinsulinnexpressinfBl2RNAandprtEininrathippapalA1reginfllingglbalbrainisheiaKEYRDS:insulin;brainisheia;Bl2自1978年初次在大鼠脑构造的提取物中创造有胰岛素及其受体以来，一些研究相继创造在其他哺乳动物及人类脑中也具有胰岛素及其受体的存在。胰岛素在中枢神经体系中的作用引起了普及的留意。在缺血性脑损伤的研究历程中，人们通过动物实行创造，全脑缺血再灌注后利用胰岛素，可减轻神经元的殒命或脱失，且这种作用在利用葡萄糖抵销其落糖作用后并不削弱，表白胰岛素在全脑缺血再灌注历程中可不依靠其外周落血糖作用而发挥神经庇护作用。但胰岛素对缺血性脑损伤产生中枢庇护作用的详细机理如今仍不甚明白。比年来很多文献报道,脑缺血后神经元的凋亡是缺血造成中枢神经体系损伤的一个紧张缘故原由。我们以往的研究证明，胰岛素对缺血性脑损伤具有中枢直接庇护作用并可淘汰大鼠海马A1区神经元的凋亡[1]。为进一步探究胰岛素对缺血性脑损伤产生中枢直接庇护作用的机理，我们对在脑缺血再灌注后，经脑室内注入胰岛素，对大鼠海马A1区Bl2RNA相对含量变革及其卵白表达的影响举行了不雅察。1质料与要领1.1实行动物及分组接纳康健成年雄性SD大鼠，共72只(干净级)，体重(300±20)g，由第四军医大学动物实行中央提供。随机分为①缺血组：缺血再灌注后1、3、5d别离取材，每个时间点12只。②胰岛素治疗组：取材时间点及每个时间点的动物数同缺血组。1.2动物模子制作大鼠经20g/L戊巴比妥钠(40g/kg)腹腔注射后，俯卧位结实于立体定向架上，于颈后正中第一、二颈椎处，切一长约1.5暗语，剥离颈部肌肉表现第一颈椎上之双侧翼孔后，插入双极电凝镊，烧灼闭塞从中穿行的椎动脉，缝合伤口，置笼喂养。24h后，同法麻醉，于头顶部皮下插入针状电极，仰卧位结实。分散颈部肌肉，表现双侧颈总动脉，夹闭30s后描记脑电变革，以脑电酿成直线为模子乐成的尺度。夹闭15in后放开动脉夹，行再灌注。于放开动脉夹后马上，从前囟后1.2、中线旁开1.5为穿刺点。颅骨钻孔后，用微量加样器垂直进针3.5穿刺脑室，缺血组注入10μL生理盐水，治疗组注入1u(10μL，1×105u/L)速效基因合成人胰岛素(丹麦诺和灵公司)。1.3血糖测定各组鼠别离于颈总动脉夹闭前及再灌注后30in、1、2、6、12、24h自鼠尾静脉取血约50μL，用血糖测定仪(Lifesan)测定血糖。1.4标本网罗于规按时间，麻醉后开胸表现心脏，自左心室插管至自动脉，剪开右心房，经预冷生理盐水冲净血液。每组每个时间点12只大鼠，此中4只以预冷之40g/L多聚甲醛灌注结实2h，断头取脑，前囟处以美兰标识表记标帜，置40g/L多聚甲醛中结实4h，系列脱水，白腊包埋，冠状切片，收取前囟后3.8处相邻切片两张(6μ)行免疫组化不雅察；4只断头取脑，剥离海马，切取双侧海马A1区构造100g，敏捷置入液氮保存用于esternblt检测。4只以焦碳酸二乙酯(DEP)处置惩罚的0.01l/LPBS(4℃)50L灌注，冲净血液，冰盒内断头取脑。快速剥离海马，切取双侧海马A1区构造100g，立即在干冰上冷冻，保存于-80℃冰箱。1.5海马A1区Bl2RNA相对含量的测定引物方案及合成根据已报道[2]的Bl2DNA方案其相应的特异性引物(引物序列5′ATGGATTTTT3′；5′AAATTAGTTA3，扩增产物长度303bp)。大连宝生物公司合成。1.6Bl2卵白表达的不雅察将猎取的切片脱蜡至水，置入枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)行微波抗原修复10in；冲洗后滴加3%(体积分数)H22阻断内源性酶15in，冲洗5in；滴加Bl2抗体(Stantaruz，1∶1000)50μL，4℃孵育留宿，PBS冲洗，参照SAB试剂盒说明(博士德公司)别离滴加二抗及StreptavidinPerxidase，DABH22混淆液显色，封片，镜下不雅察。1.7esternblt1.8统计学处置惩罚接纳SPSS统计软件行统计学处置惩罚，数据用±s表现，行组间方差阐发。2效果2.1全脑缺血后血糖的变革全脑缺血前后各组鼠血糖浓度无显着差异。缺血组与治疗组比力血糖浓度那么无明显差异(表1)。表1各实行组血糖浓度变革〔略〕Table1Thehangesfbldgluseindifferentgrup2.2全脑缺血后海马A1区Bl2RNA相对含量的变革在缺血组及胰岛素治疗组海马A1区，于各取材时间点均可见Bl2RNA的阳性电泳条带(图1)。利用Labrks软件对各阳性条带均匀密度举行丈量，盘算各阳性条带的均匀密度值与βatin条带均匀密度值之比，效果全脑缺血后1、3、5d胰岛治疗组与缺血组比力无明显差异(表2)。表2缺血组及治疗组海马A1区Bl2RNA的相对含量〔略〕Table2TherelativelyntentfBl2RNAfhippapalA1regininisheiandtreatedgrup图1脑缺血后海马A1区Bl2RNARTPR电泳条带〔略〕Fig.1TheeletrphretistripfBl2RNAithRTPRfrhippapalA1reginpstbrainishei1,3,5:theeletrphretistripfBl2RNAfisheigrupin1,3,5day,respetively;2,4,6:theeletrphretistripfBl2RNAfinsulintreatedgrupin1,3,5day,respetively2.3全脑缺血后海马A1区Bl2卵白的表达全脑缺血后1、3、5d，缺血组海马A1区Bl2卵白表达为阴性，而胰岛素治疗组海马A1区Bl2卵白表达那么呈阳性(图2)。2.4全脑缺血后海马A1区构造esternblt效果全脑缺血后1、3、5d胰岛素治疗组Bl2卵白电泳条带密度(图3)均高于缺血组(P0.01)。表白全脑缺血后经脑室注入胰岛素可进步峻鼠海马A1区Bl2卵白的表达(表3)。表3海马A1区Bl2卵白电泳条带密度〔略〕Table2ThedensityfeletrphretistripfBl2prtEinfrhippapalA1regin图2全脑缺血再灌注后1、3、5d海马A1区神经元Bl2卵白表达〔略〕Fig.2TheexpressinfBl2inhippapalA1reginin1,3,5daypstglbalbrainisheia(×400)A-:theexpressinfBl2asnegativeinhippapalA1reginin1,3,5daypstglbalbrainisheiainisheigrup,respetively;D-F:theexpressinfBl2aspsitiveinhippapalA1reginin1,3,5daypstglbalbrainisheiaininsulintreatedgrup,respetively图3脑缺血后海马A1区Bl2卵白esternblt电泳条带〔略〕Fig.3TheeletrphretistripfBl2prteinbyesternbltfrhippapalA1reginpstbrainisheia1:psitiventrl;2,4,6:theeletrphretistripfBl2prteinin1,3,5dayinisheigrup,respetively;3,5,7:theeletrphretistripfBl2prteinin1,3,5dayininsulintreatedgrup,respetively3讨论缺血性脑血管病是威胁人类康健的庞大疾病之一，随着对缺血后脑致伤机理研究的深化，如今以为缺血性脑损伤的病理生理机制是一种损伤级联反响。针对级联反响差异阶段的致伤特点，探求相应的神经庇护剂阻断损伤反响级联，淘汰神经元的殒命是缺血性脑损伤研究中的一个热门。胰岛素为一种血糖调治激素，其介导的落血糖效应对减轻缺血性脑损伤具有必然的庇护作用。大量动物实行证明，脑缺血后将血糖落至正常低限程度可减轻缺血造成的神经元损害。因此早期被应用于脑缺血病人，尤其是同时患有糖尿病患者的治疗傍边并获得了较好的疗效。自证明哺乳动物及人类脑中存在有胰岛素及其受体后，胰岛素在中枢神经体系中的作用引起了人们的器重。比年来一些实行研究创造，全脑缺血后经外周血赐与胰岛素的同时赐与葡萄糖抵消其落糖作用可减轻缺血造成的脑损害，提示胰岛素对缺血性脑损害具有中枢直接庇护作用[34]。我们此前的研究也证明胰岛素可淘汰大鼠全脑缺血后海马A1区神经元的凋亡并可减轻全脑缺血后大鼠的影象力损害，其产生抗凋亡作用的机理与促进Bl2卵白表达有关。Bl2基因家属在细胞凋亡中具有紧张的调控作用。在Bl2基因家属中，如今已断定出有凌驾20种基因，包罗按捺凋亡的Bl2、Blxl、Blx、Bl1和促进凋亡的Bax、Bak、Bad、Blxs、Bik等成员，两类分子的比例决定了细胞是否产生凋亡。Bl2基因家属对换治线粒体通透性具有关键的作用。在Bl2基因家属中按捺凋亡的重要成员如Bl2等基因的表达低落，促进凋亡成员如Bax过表达，均可导致线粒体通透性的增长，可使细胞色素自线粒体中开释进入细胞浆中[56]，并与Apaf1及aspase9的前体结合，形成复合物。此后，aspase9的前体裂解，形成aspase9并被激活。使其他aspase家属成员裂解并被激活，此中包罗aspase3[7]。aspase3的激活如今被以为是起始细胞凋亡的关键点。aspase3可激活很多细胞底物，此中最重要的有PARP(聚ADP核糖多聚酶)，DNA卵白激酶，DNA裂解因子。这些卵白的水解直接导致与细胞凋亡相干特性的出现(如DNA修复的制止，染色体的聚拢和细胞核内DNA的断裂等)[89]。由此可见，Bl2基因家属在细胞是否产生凋亡中具有紧张的调控作用。一些研究创造，全脑缺血后海马A1区神经元的迟发性殒命大概是一个细胞凋亡的历程[10]，Bl2卵白在脑缺血再灌注后中枢神经体系中的作用受到了器重[1112]。Kitagaa等[13]在神经元过表达Bl2基因的转基因小鼠上不雅察到，全脑缺血再灌注后7d，转基因鼠海马A1区神经元的殒命数显着少于同源的非转基因鼠。Antnaih等[14]乃至将携带Bl2基因的逆转录病毒于全脑缺血前24h莳植于鼠海马A1区，使其转染神经元，全脑缺血后72h不雅察创造，于莳植区四周的神经元Bl2卵白呈阳性表达，且神经元存活数显着高于未转染区[14]。从而进一步证明Bl2卵白具有减轻全脑缺血后海马A1区神经元凋亡的作用。为进一步探究全脑缺血后胰岛素淘汰海马A1区神经元凋亡机制，本实行通过制作大鼠全脑缺血再灌注模子，于全脑缺血再灌注后马上经脑室直接注入胰岛素，对血糖及海马A1区的Bl2基因的RNA和卵白表达环境举行了不雅察。效果表现，再灌注马上经脑室注入1u胰岛素后，全脑缺血前后各组鼠血糖浓度无显着变革，缺血组与治疗组比力血糖浓度亦无明显差异；全脑缺血后1、3、5d，胰岛素治疗组海马A1区Bl2基因的RNA表达与缺血组无明显差异，而Bl2卵白的表达却显着高于缺血组。效果证明，胰岛素促进鼠海马A1区Bl2卵白表达的作用大概是通过促进Bl2卵白的翻译历程而实现的，而并不依靠胰岛素的外周血糖调治效应及此中枢直接作用。因此我们以为，全脑缺血后经脑室内注入胰岛素大概通过促进Bl2卵白翻译历程，使大鼠海马A1区Bl2卵白高表达按捺海马A1区神经元的凋亡，从而发挥中枢直接庇护作用。参考文献：[1]李兵，章翔，张志文，等.脑室内注射胰岛素对全脑缺血后海马A1区神经元凋亡及学习影象的影响[J].中华神经外科疾病研究杂志,2022,2(1):3639.[2]S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